蛋白样品检测

蛋白组学脱胎于人类基因组计划中的功能基因组学，是研究细胞、组织或完整生物体所拥有的全套蛋白质的学科，“全景式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱”。（贺福初，中国蛋白质组计划，中国科学基金，2002，264-268）蛋白组学的实验过程高度依赖优化的样品前处理。其中，蛋白消解和质谱分析这两步之间的处理过程对整体分析质量和灵敏度有着非常重要的影响。一种名为StageTips的关键技术于2003年由南丹麦大学蛋白质组学领域著名学者Matthias Mann首次报道，并因其高效和简便而在蛋白组学研究中得到广泛使用。许多研究机构根据自身课题特点开发了StageTips的应用规程。StageTips是一种填充了Empore膜片的微量移液管。其全称是“Stop and go extraction tips”，喻意为蛋白分解产生的肽被Empore膜片拦截，然后由适当的溶剂释放出来。这个过程中，盐份去除，肽得到纯化和浓缩，或者预分馏。Empore膜片由高分子纤维网固定住的功能颗粒构成，同时具有极佳的物理特性（如柔软、致密）和化学特性（如高保留因子），使StageTips特别适用于LC/MS分析之前处理肽溶液样品。膜片中功能颗粒种类的多样性使StageTips具有多种不同性能，可以根据应用内容有多种选择，并可以在一支StageTips中组合使用。a - 单层Empore膜片的StageTips（放大图中为Empore膜片材料结构示意） b – 多层膜片的StageTips ；图1 StageTips外观Empore相对于用松散颗粒制成的产品有多种优势，包括：颗粒填充致密无沟流；无需筛板；洗脱体积小；容量可由增加膜片层数而扩大。图2. Empore StageTips 质量控制：这些数据显示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次内测试结果的良好可重复性和可靠性，证实生产工艺的优越性。应用实例一美国著名医院Mayo Clinic 于2020 开发了基于StageTips和临床质谱的 新冠病毒快速诊断方案，可以达到和PCR相似的精度。----------------------------------------------------------------------------------------------------图3. Mayo Clinics 新冠病毒高通量检测方案：基于StageTips 和OrbiTrap LC-MS。应用实例二高通量磷酸化蛋白质组学检测----------------------------------------------------------------------------------------------------DNA转录成mRNA要再翻译成具有特定氨基酸序列的蛋白质才能在体内发挥功能，其中大部分蛋白质往往还需要经过化学修饰才能具备真正的活性，这种修饰称为翻译后修饰（PTM）。翻译修饰的过程，就是在蛋白质氨基酸序列中添加特定氨基酸或改变特定化学官能团的过程，进而改变蛋白质的结构。已有实验证明有三百多种潜在的PTM类型，并且同一个蛋白质可能在多个位点发生修饰，这就促成了蛋白结构和功能上的多样性。在众多的PTM类型中，磷酸化修饰（Phosphorylation modification）的蛋白占到了所有蛋白质约三分之一，是最普遍的修饰类型之一。会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等，所以在不同细胞中，蛋白磷酸化水平会呈现不同的差异，特定位点的磷酸化程度可能从小于1%到大于90%。图 4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白质组学检测磷酸化蛋白质组学是研究这个蛋白质磷酸化修饰的重要方法之一。如图四所示，通过采用基于StageTips的高通量蛋白质组学样品制备方法，相对于传统样品制备方法来说，所需要的检测样品少了10倍，检测时间减少3倍，但定量化磷酸化位点增加了3倍，极大了提高了研究效率。高碱性条件下的分馏可大大提高蛋白质检出率。相比于传统的方法，比如离线HPLC 泵，或者散装填料装的Tips，Empore C18 Stage Tips 更为高效，同时成本更低。图五显示的数据表明通过StageTips 在高碱性条件下的分馏样品处理，蛋白质检出量增加了50%，同时蛋白质覆盖率提高了10%。图5: HeLa细胞系用 Empore C18 StageTips在高碱性条件下进行分馏处理可大大增加蛋白质和多肽的检出水平Empore还具有自身优势，其中可供选择的功能颗粒和应用如下表所示。【说明】Empore最早由3M公司生产，2019年，莱伯泰科从3M公司收购了Empore的生产线，由旗下CDS公司全面掌握生产工艺并生产和销售。收购之后，许多将Empore作为关键材料的高科技产品得以继续生产。

聚焦蛋白质互作研究进展与实验方法研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础。蛋白质—蛋白质互作网络是生物信息调控的主要实现方式，是决定细胞命运的关键因素。检测蛋白质间相互作用的实验方法有哪些？这些检测方法各有什么优缺点?总结如下。1. 生化方法●共纯化、共沉淀，在不同基质上进行色谱层析(需要补充)●蛋白质亲和色谱 基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过改基质时，可与改固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有吸附的非目标蛋白则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或者洗脱条件而回收下来。GST pull down技术：为了更有效的利用蛋白质亲和色谱，可以将待纯话的蛋白以融合蛋白的形式表达，即将”诱饵“蛋白与一种易于纯化的配体蛋白融合。例如与GST融合的蛋白再经过GSH的色谱柱时，就可以通过GST和GSH的相互作用而被吸附。当载有细胞抽提物经过柱时，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的目标蛋白了。Epitope-tag技术：表位附加标记技术 就是将附加的抗原 融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白。 缺点：表位附加标记可能会使融合蛋白不稳定，改变或使融合蛋白功能丧失。以上两种方法都要共同的缺点：假阳性。实验所检测到的相互作用可能时由蛋白质所带电荷引起的，并不是生理性的相互作用 蛋白的相互作用可能并不是直接的，可是由第三者作为中介的 有时会检测到两种在细胞中不可能相遇却有极强亲和力的蛋白。因此实验结果还应经其他方法验证。●免疫 共沉淀 免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。 缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。 缺点是转膜前需要将蛋白复性。2. 等离子表面共振技术(Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射绿上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。3. 遗传学方法使某处发生缺损，检测对其他地方的影响。●基因外抑制子。基因外抑制子是通过一个基因的突变 来弥补原有基因的突变。比如相互作用的蛋白A和B，如果A发生了突变使两者不再相互作用，此时B如果再发生弥补性突变就可以使两者的相互作用恢复，那么B就是A的基因外抑制子。 缺点：需要知道基因，要有表型，筛选抑制子比较费时。●合成致死筛选 指两个基因同时发生突变会产生致死效应，而当每个基因单独发生突变时则无致死效应。用于分析两个具有相同重要蛋白之间的相互作用。4. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。 缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近(100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。 缺点 此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。此外还有交联技术(cross-linKing)，蛋白质探针技术，噬菌体展示技术(Phage display)以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。

一、蛋白样品制备　　之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取，当我们做WB的时候，需要对提取好的蛋白样品进行处理：在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上样缓冲液）稀释至1X（如蛋白样品有120ul，则加入SDS loading buffer 6X 600ul），混匀，75-95度加热10-15分钟，使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后，进行离心，使蛋白样品适当降温，防止PAGE胶被融化。　　PS：要测量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加热到75度，一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀释至1X即可。　　那么为什么我们加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。　　二、蛋白上样　　1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1X电泳液　　2. 拔出梳子，应该两侧同时用力，缓慢拔出，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。　　3.加入蛋白样品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul -40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品，是用微量注射器加样，平时我们也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。　　4.电泳：接上电极，正负极不要弄反，红色对红色，黑色对黑色，初始电压设为90V，当样品跑至分离胶时将电压调至120V，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间，如分子量较大，可以延长电泳时间，使得分子量大的marker跑的分散开，容易判断分子量。　　三、注意事项　　1.蛋白样品上样量最好相等，不要过多。　　2.不要过多重复使用电泳Buffer　　3.最佳分辨区在分离胶的2/3　　4.电泳后测定的分子量有10%的误差，不可完全信任。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上的肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链，SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量，有的蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质）不能采用该发测相对分子量。　　5.如果电泳中出现拖尾，染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。