转运蛋白

2018年1月5日9时，梁洞泉博士（AuroraBiomed Inc.创始人、董事长及CEO、中国科学院客座教授）于中国科学院昆明动物研究所就《离子通道与离子转运蛋白研究新方法》为主题作出学术报告。当中，感谢天然药物功能蛋白质组学组组长赖仞博士、离子通道药物研发组组长杨建博士、生物毒素与人类疾病组组长张云博士及其他工作人员的大力支持。　　梁洞泉博士报告的主要内容是分享他及其科学团队研发出的一款仪器-----离子通道阅读器（Ion Channel Reader），该仪器能对进出细胞的目标离子流进行精准定量，通过检测细胞内（外）的目标离子浓度，从而得出目标离子通道与转运蛋白的活性分析，能帮助研究学者加速离子通道与转运蛋白靶点相关疾病研究，以及治疗与预防药物的开发。国际知名制药公司Amgen, Merck, Pfizer, AstraZenaca, Roche, Abbott，以及北京大学，河北医科大学，英属哥伦比亚大学等科研实验室已使用该仪器，并且发表了非常多的文章。　　报告中，梁洞泉博士还结合中国科学院昆明动物研究所的研究热点-----动物多肽，分享了自己的独特见解，希望能有更多的研究者关注多肽和离子通道、离子转运蛋白的关系，更好的推动科学研究。　　当天下午，梁洞泉博士还访问了中国科学院昆明植物研究所的孔清华博士。由于梁洞泉博士和孔清华博士对天然化合物都有着浓厚的研究热情，讨论的氛围十分浓厚。　　昆明有着优越的地理环境，天然化合物富饶，这就是梁洞泉博士此次昆明之行的理由。他一直致力于基于天然化合物的离子通道与离子转运蛋白靶标药物开发，想借此行与昆明的研究学者作深入的学术交流，让更多的科研力量投入到天然化合物的离子通道与离子转运蛋白靶标药物开发中来。

玉米的三个sweet蔗糖转运蛋白旁系同源基因在韧皮部装载中的重要作用原文以 impaired phloem loading in genome-edited triple knock-out mutants of sweet13 sucrose transporters为标题发表在2017年10月6日的biorxiv上，原文作者margret bezrutczyk等译：贾子毅 作物产量依赖于蔗糖从叶片到籽粒的有效分配。在拟南芥中，韧皮部装载（phloem loading）是通过sweet蔗糖流（sweet sucrose effluxers）以及随之的sut1/suc2蔗糖/h+协同转运子配合完成的。zmsut1对于玉米的碳分配至关重要，但其对质外体韧皮部装载以及易位途径所导致的蔗糖损失回收的贡献还不清楚。因此，研究者检测了玉米中sweets对韧皮部装载的重要性。 研究者们确认了三个基于叶片表达的sweet蔗糖转运蛋白，它们在质外体韧皮部装载中发挥重要作用。尤其是，zmsweet13旁系同源体（a，b，c）是叶脉管系统表达量最高的基因之一。经基因组编辑，三个基因敲除后的突变体明显发育不良。 野生型和突变体植株在生长发育（如株高）以及zmsweets表达方面的差异 为了定量评估突变体在光合作用方面的受损情况，研究者采用li-6800光合荧光自动测量系统评价野生型和突变体玉米植株在光合速率方面的差异。实验在温室条件下进行：温度28℃；光合有效辐射1000μmol/m2/s；相对湿度60%。 li-6800光合荧光自动测量系统 结果发现，突变体的光合作用受损，叶片积累淀粉和可溶性糖。转录组测序（rna-seq）表明，突变体存在显著的与光合器官和碳水化合物代谢相关基因的异常转录。gwas分析表明，zmsweet13s旁系同源体与作物的农艺性状有关，尤其会影响开花时间和叶片角度。 野生型和突变体植株在叶片淀粉以及可溶性糖累积间的差别 实验证实，zmsweet13旁系同源体（a，b，c）和zmsut1在韧皮部装载过程中存在合作。研究者认为，试图通过生物工程措施提高作物产量时，可以将其作为重点候选对象。

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Journal of The American Chemical Society上的文章，A Chemical Proteomic Map of Heme−Protein Interactions1。该文章的通讯作者是美国斯克利普斯研究所的Christopher G. Parker研究员。高铁血红素（heme）是人体中许多蛋白质的辅助因子，也是血液中氧气的主要转运体。最近的研究也证实了高铁血红素可以作为一种信号分子，通过与伴侣蛋白质结合而不是通过其金属中心反应来发挥其作用。然而，目前关于血红素结合蛋白的注释还不够完整。因此，本文采用化学蛋白质组学的方法去揭示人体中与高铁血红素发生互作的蛋白质谱。化学蛋白质组学是揭示蛋白质功能和发现药物靶标的重要工具。其中，最常用的是基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling，ABPP），通过结合活性分子探针标记及串联质谱分析，实现对靶标蛋白的鉴定。如图1b，本文设计了一个“全功能”活性分子探针（HPAP），共包含3个部分：1. Hemin母核，用于与靶蛋白非共价结合；2.光活化基团-双吖丙啶，可在UV光照下生成卡宾，促使分子探针与蛋白发生共价交联；3. 炔基，可在铜催化下与含有叠氮的试剂（荧光标签，生物素）发生点击化学反应，后两者组成FF-control。具体实验流程如下图1a所示，用HPAP处理不同细胞（In Situ）或不同细胞来源的蛋白质组（In vitro），HPAP中的hemin母核可与靶蛋白发生非共价结合，经UV光照，HPAP-蛋白间形成共价交联，再利用点击化学可将HPAP-蛋白与荧光素（TAMRA）或者生物素标签相连，用于后续的荧光成像（In-gel fluorescence）或者链霉亲和素纯化、LC-MS鉴别定量（MS-based I.D. and quantitation）。 图1. (a)使用基于高铁血红素的光亲和探针(HPAP)识别血红素结合蛋白的流程示意图。(b) HPAP、hemin和FF-control的结构；(c) HEK293T裂解物中与HPAP结合的蛋白的荧光成像；(d) hemin加入对HPAP与蛋白结合的影响。作者首先使用了SDS-PAGE去评估了HPAP标记蛋白的能力。如图1c所示，随着HPAP浓度的提高，胶图上条带颜色也逐渐加深，说明HEK293T细胞裂解液中与HPAP结合的蛋白在逐渐增加。如图1d所示，在10 μM HPAP的条件下，逐渐加入hemin，可以看到胶图上条带颜色逐渐变浅，说明hemin与HPAP之间发生了竞争，HPAP模拟了hemin与蛋白的结合过程。随后，作者又使用已知的hemin结合蛋白来确认HPAP捕获目标蛋白的能力。如图2所示，这些已知蛋白被HPAP成功的标记上，但由于hemin的加入，条带的颜色在逐渐变浅（TAMRA）。Western blot的结果显示，蛋白的总量并无太大变化，但hemin的竞争结合，导致与HPAP结合的蛋白量在下降。以上实验均说明，HPAP具有较好的选择性标记能力，能够模拟hemin与靶蛋白的结合，并以共价交联的方式标记在蛋白上。 图2. 用已知的高铁血红素结合蛋白确认HPAP捕获目标蛋白的能力。验证了方法的可行性后，作者将HPAP与定量蛋白质组学结合用于绘制高铁血红素-蛋白质互作谱。考察了多种细胞系，包括：人胚胎肾细胞（HEK293T）、人慢性髓系白血病细胞（K562）以及人原代外周血单个核细胞（PBMCs）。每种细胞系设置了两种实验形式：1）特异性结合实验（Enrichment）：通过将HPAP识别出蛋白与FF-Control识别出的蛋白进行对比，排除非特异结合的干扰（图1b），如果同一蛋白通过HPAP富集到的量是FF-control富集到的量4倍以上，则认为该蛋白是HPAP特异性结合蛋白。2）竞争性结合实验(Competition)：观察HPAP富集的蛋白在hemin和HPAP同时存在时富集到的量的变化，变化大于3倍且具有显著性差异（p＜0.05)的蛋白被认为是HPAP与hemin竞争性结合的蛋白。最终确定的高铁血红素结合蛋白应满足以上两种实验的筛选标准(图3a)。如图3b-d所示，总共鉴定出378个的高铁血红素结合蛋白，其中214个来自HEK293T, 182个来自K562, 107个来自PBMC。尽管三种细胞类型之间的结合蛋白有一些重叠，但大多数靶点蛋白只存在于一种或两种细胞类型中(图3b)，这暗示血红素在不同细胞中可能发挥不同的功能。其中，19个靶点蛋白是在UniProt上已经注释为高铁血红素的结合蛋白，剩余都是未揭示的结合蛋白。这些结合蛋白按照功能可划分为：转运蛋白，转录因子，支架蛋白和酶（图3c），根据代谢通路又可进一步划分（图3d）。作者最后对几个新发现的结合蛋白进行了验证，并选择IRKA1进行进一步的作用机制研究。IRKA1在调节炎症信号通路中起着关键作用，IRAK1被IRAK4磷酸化，然后自磷酸化，产生NFkB介导的炎症反应。经实验确认（图4），hemin是IRKA1的一种变构活化配体，可增强其酶活性，促进IRAK1的自磷酸化。 图3. 基于蛋白质组学的HPAP-蛋白互作分析。 图4. Hemin对IRKA1的调节作用。总之，本文设计开发了一种基于高铁血红素的光亲和探针，它可以与化学蛋白质组工作流程结合，以识别不同蛋白质组中的高铁血红素结合蛋白。利用该方法也可拓展至其他分子配体靶标蛋白的识别。 撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions参考文献1. Homan, R. A., Jadhav, A. M., Conway, L. P., & Parker, C. G. (2022). A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions. Journal of the American Chemical Society, 144(33), 15013–15019.

2022年6月2日，国家纳米科学中心陈春英研究员团队在《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2022, 119(23), e2200363119）在线发表了题为"Dynamic intracellular exchange of nanomaterials’ protein corona perturbs proteostasis and remodels cell metabolism"的研究论文(图1)，通过创新应用多维度多组学（蛋白组学、代谢组学、脂质组学）、分子间互作以及原位质谱成像等分析技术，首次揭示了“纳米蛋白冠”的蛋白组成在细胞转运过程中的动态演化模式，并发现该过程扰动细胞蛋白质稳态、能量代谢和脂质代谢过程。该研究工作得到了岛津中国创新中心(Shimadzu China Innovation Center)的技术支持。 图1 论文首页标题 背景介绍当纳米材料进入生命体系时，生物流体的生物分子迅速与纳米材料表面结合，形成生物分子冠，其中纳米-血液蛋白分子互作形成的“纳米蛋白冠”，自2006年始引起科学界的广泛关注。前期工作发现纳米蛋白冠的形成决定纳米材料在多层级细胞和组织中的识别、转运、分布、功能和生物效应，是纳米材料生物应用的“黑匣子”问题，不仅决定纳米药物载体的递送效率，还会制约纳米药物的递送效率，并严重影响其有效性和安全性 [1]。该领域研究的一个重要挑战是“纳米蛋白冠”的复杂性，该复杂性受不同组织器官中生物分子的多样性以及生理病理状态的影响。然而目前对蛋白冠的蛋白组成和结构特性如何随纳米颗粒所处的生物微环境不同而发生变化，存在认知不明、机理不清的问题。 解决方案为了解决这一问题，研究人员以纳米金颗粒为模式纳米颗粒，研究了蛋白冠从血液系统到细胞内的动态演化过程（血液-溶酶体-细胞质）（图2），当纳米颗粒由血液环境经过细胞内吞进入溶酶体，再从溶酶体逃逸进入细胞质后，其表面的蛋白组成会发生巨大变化，被细胞内蛋白质分子（PKM2、HSPs、GAPDH、ASSY等）所替代，只保留部分血液环境中形成的蛋白冠成分（FIBs、APOs、HBs、C3、S100s等）(图2)。 图2. 纳米蛋白冠组成在细胞转运过程中的演化过程 随后发现，纳米蛋白冠的胞内演化扰乱细胞内的蛋白稳态（proteostasis），引发伴侣蛋白(HSC70, HSP90等)和丙酮酸激酶M2（PKM2）在胞内纳米蛋白冠表面的富集，并利用微量热泳动技术（MST）验证了PKM2、HSC70与从溶酶体逃逸出来之后的纳米蛋白冠具有极强的亲和力，这一吸附规律激发了伴侣蛋白介导的自噬反应（Chaperone mediated autophagy, CMA），即“纳米蛋白冠引发的CMA”（Protein corona induced CMA）（图3）。图3. 纳米蛋白冠的组分与胞内蛋白(伴侣蛋白、代谢激酶)的交换引发伴侣蛋白介导的自噬(CMA)活性的升高 进一步，研究人员采用代谢组学发现“纳米蛋白冠诱导的CMA”影响细胞糖酵解，引发细胞外酸化率（ECAR）显著增加。结合脂质组学发现的特定脂质，利用iMScope TRIO（Shimadzu Corporation）进行鉴定和可视化分布分析显示在动物组织水平纳米蛋白冠的存在一定程度上扰动肿瘤组织中的脂质种类和分布（图4），扰动的脂质主要富集在胆碱代谢、甘油磷脂和鞘脂代谢途径。 图4. 纳米蛋白冠引发的CMA重塑细胞能量代谢和脂质代谢 结论综上所述，此项工作首次阐明了纳米颗粒从血液到亚细胞微环境转运过程中的演化模式，发现了“纳米蛋白冠”的胞内微环境特异性，进而重塑细胞代谢，为深入理解纳米-生物界面调控纳米材料复杂生物学效应提供了新认识和理论支撑。同时借助岛津成像质谱显微镜iMScope，可在肿瘤组织内部原位清晰展现出包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)类脂质等多种成分均发生了明显变化。通过空间可视化成像技术，不仅可实现在分子水平上对纯纳米粒子和纳米蛋白冠的生物毒理学效应进行有效研究，同时也为未来对更多种类的纳米搭载生物诊疗试剂和材料的毒理学和安全性评价提供更为直观有力的研究手段。 原文链接https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2200363119 参考文献：[1] Cao M. et al. Molybdenum Derived from Nanomaterials Incorporates into Molybdenum Enzymes and Affects Their Activities in vivo. Nature Nanotechnology, 2021, 16: 708-716.

2022年6月2日，国家纳米科学中心陈春英研究员团队在《美国国家科学院院刊》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2022, 119(23), e2200363119）在线发表了题为"Dynamic intracellular exchange of nanomaterials’ protein corona perturbs proteostasis and remodels cell metabolism"的研究论文(图1)，通过创新应用多维度多组学（蛋白组学、代谢组学、脂质组学）、分子间互作以及原位质谱成像等分析技术，首次揭示了“纳米蛋白冠”的蛋白组成在细胞转运过程中的动态演化模式，并发现该过程扰动细胞蛋白质稳态、能量代谢和脂质代谢过程。该研究工作得到了岛津中国创新中心(Shimadzu China Innovation Center)的技术支持。图1 论文首页标题 背景介绍当纳米材料进入生命体系时，生物流体的生物分子迅速与纳米材料表面结合，形成生物分子冠，其中纳米-血液蛋白分子互作形成的“纳米蛋白冠”，自2006年始引起科学界的广泛关注。前期工作发现纳米蛋白冠的形成决定纳米材料在多层级细胞和组织中的识别、转运、分布、功能和生物效应，是纳米材料生物应用的“黑匣子”问题，不仅决定纳米药物载体的递送效率，还会制约纳米药物的递送效率，并严重影响其有效性和安全性 [1]。该领域研究的一个重要挑战是“纳米蛋白冠”的复杂性，该复杂性受不同组织器官中生物分子的多样性以及生理病理状态的影响。然而目前对蛋白冠的蛋白组成和结构特性如何随纳米颗粒所处的生物微环境不同而发生变化，存在认知不明、机理不清的问题。 解决方案为了解决这一问题，研究人员以纳米金颗粒为模式纳米颗粒，研究了蛋白冠从血液系统到细胞内的动态演化过程（血液-溶酶体-细胞质）（图2），当纳米颗粒由血液环境经过细胞内吞进入溶酶体，再从溶酶体逃逸进入细胞质后，其表面的蛋白组成会发生巨大变化，被细胞内蛋白质分子（PKM2、HSPs、GAPDH、ASSY等）所替代，只保留部分血液环境中形成的蛋白冠成分（FIBs、APOs、HBs、C3、S100s等）(图2)。 图2. 纳米蛋白冠组成在细胞转运过程中的演化过程 随后发现，纳米蛋白冠的胞内演化扰乱细胞内的蛋白稳态（proteostasis），引发伴侣蛋白(HSC70, HSP90等)和丙酮酸激酶M2（PKM2）在胞内纳米蛋白冠表面的富集，并利用微量热泳动技术（MST）验证了PKM2、HSC70与从溶酶体逃逸出来之后的纳米蛋白冠具有极强的亲和力，这一吸附规律激发了伴侣蛋白介导的自噬反应（Chaperone mediated autophagy, CMA），即“纳米蛋白冠引发的CMA”（Protein corona induced CMA）（图3）。 图3. 纳米蛋白冠的组分与胞内蛋白(伴侣蛋白、代谢激酶)的交换引发伴侣蛋白介导的自噬(CMA)活性的升高 进一步，研究人员采用代谢组学发现“纳米蛋白冠诱导的CMA”影响细胞糖酵解，引发细胞外酸化率（ECAR）显著增加。结合脂质组学发现的特定脂质，利用iMScope TRIO（Shimadzu Corporation）进行鉴定和可视化分布分析显示在动物组织水平纳米蛋白冠的存在一定程度上扰动肿瘤组织中的脂质种类和分布（图4），扰动的脂质主要富集在胆碱代谢、甘油磷脂和鞘脂代谢途径。 图4. 纳米蛋白冠引发的CMA重塑细胞能量代谢和脂质代谢 结论综上所述，此项工作首次阐明了纳米颗粒从血液到亚细胞微环境转运过程中的演化模式，发现了“纳米蛋白冠”的胞内微环境特异性，进而重塑细胞代谢，为深入理解纳米-生物界面调控纳米材料复杂生物学效应提供了新认识和理论支撑。同时借助岛津成像质谱显微镜iMScope，可在肿瘤组织内部原位清晰展现出包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、磷脂酰肌醇(PI)类脂质等多种成分均发生了明显变化。通过空间可视化成像技术，不仅可实现在分子水平上对纯纳米粒子和纳米蛋白冠的生物毒理学效应进行有效研究，同时也为未来对更多种类的纳米搭载生物诊疗试剂和材料的毒理学和安全性评价提供更为直观有力的研究手段。 原文链接https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2200363119参考文献：[1] Cao M. et al. Molybdenum Derived from Nanomaterials Incorporates into Molybdenum Enzymes and Affects Their Activities in vivo. Nature Nanotechnology, 2021, 16: 708-716.

近几年以来，中国在植物学领域实现了质的飞跃，其植物学研究成果占到了全球的20%以上，随着国家对于基础科学研究的重视，一大批优秀的成果脱颖而出。本期介绍的这篇论文就是重要代表之一。中国农业大学武维华院士/王毅教授课题组、李继刚教授课题组和德国明斯特大学J?rg Kudla教授课题组合作完成了拟南芥转录因子MYB59调控低钾条件下K+/NO3-转运的分子机制研究。2019年2月，Plant Cell在线发表了题为“The tranion factor MYB59 regulates K+/NO3-translocation in the Arabidopsis response to low K+stress”的研究论文。该研究揭示了拟南芥转录因子MYB59应答养分胁迫环境，并调控钾和氮协同运输的分子机制。同时，Plant Cell编委还针对该研究内容发表了题为“It' s an uphill battle: The MYB59-NPF7.3 regulatory module and its role in nutrient transport”的专评。钾和氮是植物生长发育所必需的大量元素,直接影响植物的生长发育以及作物的产量和品质。K+在酶促反应、渗透调节、电荷平衡等方面都起着重要的作用，而N则是碳化合物的组成成分，构成了氨基酸、蛋白质、核苷酸等物质。长期的农业生产实践早已证明，按适当比例施用钾肥和氮肥可以显著提高肥料的吸收利用效率。已有的研究报道显示，钾和氮的吸收和转运是协同进行的,但其分子调控机制仍不明确。课题组实验室前期研究发现，拟南芥硝酸根转运体NRT1.5不仅负责NO3-从根向冠的转运，同时还影响K+从根部向冠部的运输过程。因此，NRT1.5很可能是钾和氮协同运输的重要组分。已有研究表明钾缺乏抑制NRT1.5的转录,说明NRT1.5的转录能够响应环境中钾浓度变化，但低钾抑制NRT1.5转录的调控机制尚属未知。本论文工作证明了MYB59是NRT1.5的正向转录调控因子，低钾可通过抑制MYB59的转录及促进MYB59蛋白的降解进而抑制NRT1.5的转录，最终调节拟南芥中钾和氮的协同转运过程。通过表型筛选获得一个拟南芥低钾敏感突变体lks3。离子含量测定结果显示，低钾条件下MYB59突变体的根部积累了更多的K+和NO3-，而冠部的K+和NO3-含量降低，说明MYB59调控K+和NO3-从根向冠的转运过程。实验结果还表明,低钾处理可以同时抑制MYB59及NRT1.5的转录水平。而半体内蛋白降解实验结果表明，低钾处理后MYB59.3蛋白被快速降解。本论文研究结果表明，MYB59是NRT1.5的正向转录调节因子。在正常钾条件下，MYB59促进NRT1.5的转录，进而促进拟南芥中K+和NO3-从根向冠的协同运输过程。低钾胁迫时，MYB59的转录水平和蛋白水平均被下调，结果使NRT1.5的转录被抑制，K+和NO3-从根向冠的协同转运也随之受抑。论文研究工作证明了MYB59和NRT1.5这一转录调控通路在植物响应环境钾亏缺、调控钾/氮协同转运及根冠分配方面有重要作用。 拟南芥通过MYB59-NPF7.3调控机制应答和调节外部K+/NO3-水平在该研究论文中，86Rb+ 吸收实验被用来分析K+的吸收，86Rb+ 同位素作为示踪剂被珀金埃尔默的MicroBeta液闪仪定量检测，珀金埃尔默助力中国科学家取得更大成绩。文章链接1.http://www.plantcell.org/content/early/2019/02/13/tpc.18.006742.http://www.plantcell.org/content/early/2019/02/13/tpc.19.00032关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

在绿色生物制造和合成生物学等研究领域中，高质量的蛋白分离和纯化是研究目的蛋白结构和功能的重要步骤。传统的分离纯化方法通量低、耗时长、均一性差，全自动高通量蛋白纯化系统在生命科学研究和生物制药领域已开始广泛运用，从样本前处理工序，到不同类型的蛋白纯化流程，可实现多管线自动化平行实验，具有稳定的工艺流程，可极大提高实验效率，节约时间和人力成本；同时还可以进行数据交互，实现样本溯源和实验数据管理。今天小贝给大家整理了几种常见好用的蛋白纯化方案助力您的科学研究。磁珠捕获特异性标签蛋白，因其纯化步骤精简成熟被广泛应用，图1是磁珠纯化流程示意图。小贝为您量身定制蛋白纯化全流程自动化方案：使用Biomek i系列液体工作站，整合核酸/蛋白提取仪，实现高效高通量自动化蛋白纯化，极大节省实验时间和科研精力。图1 磁珠纯化流程图2 Biomek i系列液体处理工作站展示图Biomek i系列液体工作站配置96通道和灵活8通道加样器，适配各种商品化试剂盒和用户自配试剂，轻松实现试剂分装和高通量样本纯化。同时工作站支持多设备整合，可进行后期无限升级，添加离心机、酶标仪等设备助力全流程自动化实验。图3 磁珠纯化方法截图及纯化结果高通量磁珠法蛋白纯化模块可以通过结合核酸/蛋白提取仪实现极简快速蛋白纯化，也可以通过自动化液体工作站结合磁力架完成。使用该功能时仅需要通过软件的简易命令行即可完成，如图3所示，工作站机械抓手会根据纯化流程将Binding Buffer、Beads、Washing Buffer等试剂自动搬运到指定位置，使用磁套进行磁珠转运，单次可以完成96个样本纯化，浓度稳定在0.5-0.8mg/ml，96孔板纯化时间约60min，节省枪头成本，省时省力。图4 亲和层析柱蛋白纯化法实验流程RoboColumn是一种小型色谱柱，用于抗体、蛋白质、多肽等的全自动平行色谱分离，其纯化流程如图4所示。高通量的RoboColumn ALP 与Biomek i系列液体工作站相结合，配置Span8固定针，可实现多通道自动化的平行层析实验流程，显著缩短工艺开发时间；同时还可以进行数据追踪，实现样本溯源，减少重复工作。图5 RoboColumn ALP模块结构及Span8固定针示意图W1：废液槽；B1：收集板载架；C1：柱载架Biomek液体工作站可以实现台面整合RoboColumn ALP模块，通过软件流程式编辑方法，控制ALP板位自动位移，实现液体收集，轻松完成蛋白纯化，图6展示了软件控制ALP板位收集液体的方法以及RoboColumn纯化结果，实验中1.56mg蛋白上样，经0.1M Gly-HCl(pH2.7)洗脱回收得到蛋白含量1.31mg，纯化得率达到84%，8通道操作时间约为80min。图6 调用RoboColumn方法界面及纯化结果展示图7 PhyTip法自动化纯化关键流程PhyTip为枪头式分散固相亲和色谱柱，采用枪头式装置，纯化树脂被填充于枪头尖端，由自动化液体处理工作站加载PhyTip，可以实现单通道到96通道灵活样品数纯化，其纯化流程如图7所示，可对微克级到毫克级的蛋白进行纯化。图8 PhyTip实物图、PhyTip纯化方法及结果展示图Biomek液体工作站与枪头式纯化色谱柱相结合，利用工作站加载PhyTip让纯化流程变得如移液流程一样简单！如图8所示，加样器加载PhyTip，分别在平衡液、蛋白样品、洗杂液和洗脱液中混匀即可完成高通量蛋白纯化，单次可处理96个样品，收集10mL菌液使用PhyTip(40uL填料)，纯化后经BCA蛋白定量测定蛋白含量稳定在400ug左右，优于手工对照实验340ug的结果，96孔板操作时间约为90min。小 结

结构生物学领域有一条不成文的观点：结构决定功能。只有知道生物分子的原子排布，科学家们才能了解这个蛋白的功能。几十年来，分析蛋白结构有一个无冕之王——X射线晶体衍射。在X射线晶体衍射中，科学家们让蛋白结晶，然后利用X射线照射，随后根据X射线的衍射来重建蛋白的结构。在蛋白质数据银行(Protein Data Bank)的100000多条蛋白词目里，超过90%的蛋白结构是利用X射线晶体衍射技术解析得到的。　　尽管X射线晶体衍射一直是结构生物学家的最佳工具，但是它存在较大的限制。科学家们将蛋白进行大块结晶通常需要多年的时间。而很多基础蛋白分子，例如嵌在细胞膜上的蛋白，或是形成复合体的蛋白却无法被结晶。　　X射线晶体衍射技术(X-ray crystallography)即将成为历史，低温电子显微技术(cryo-electron microscopy, 也称作electron cryomicroscopy, cryo-EM)引发结构生物学变革。　　低温电子显微镜适用于研究大的、稳定的分子，这些分子能够承受电子的轰击，而不发生变形——由多个蛋白组成的分子机器是最好的样本。因此由RNA紧紧围绕的核糖体是最佳的样本。三位化学家用X射线晶体衍射研究核糖体溶液的工作在2009年获得了诺贝尔化学奖，但这些工作花了几十年。近几年，低温电镜研究者们也陷入了“核糖体热”。多个团队研究了多种生物的核糖体，包括人类核糖体的首个高清模型。X射线晶体衍射的研究成果远远落后于LMB的Venki Ramakrishnan实验室，Venki获得了2009年的诺奖。Venki表示，对于大分子来说，低温电子显微镜远比X射线晶体衍射要实用。　　这几年，低温电子显微镜的相关文章有很多：2015年一年，这个技术就用于100多个分子的结构研究。X-射线晶体衍射只能对单个、静态的蛋白晶体成像，但低温电子显微镜能够对蛋白的多种构象进行成像，帮助科学家们推断蛋白的功能。　　现在低温电镜迅猛发展，专家们正在寻找更大的挑战作为下一个解析目标。对很多人来说，最想解析的是夹在细胞膜内的蛋白。这些蛋白是细胞信号通路中的关键分子，也是比较热门的药物靶标。这些蛋白很难结晶，而低温电子显微镜不大可能对单个蛋白进行成像，这是因为很难从背景噪音中提取这些信号。　　这些困难都无法阻挡加利福利亚大学(University of California)的生物物理学家程亦凡。他计划解析一种细小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是检测辣椒中引起灼烧感的物质的受体，并与其它痛感蛋白紧密相关。加利福利亚大学病理学家David Julius等人之前尝试结晶TRPV1，结果失败。用低温电子显微镜解析TRPV1项目，一开始进展缓慢。但2013年底，技术进步使得这一项目有了重大突破，他们获得了分辨率为0.34纳米的TRPV1蛋白的结构。该成果的发表对于领域来说，无异于惊雷。因为这证实了低温电子显微镜能够解析小的、重要的分子。　　尽管低温电子显微镜发展迅速，很多研究者认为，它仍有巨大提升空间。他们希望能制造出更灵敏的电子探测器，以及更好地制备蛋白样本的方法。这样的话，就能够对更小的、更动态的分子进行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者发表了一篇细菌蛋白的结构，分辨率达到了0.22纳米。这也显示了低温显微镜的潜力。　　1997年时，英国医学研究委员会分子生物学实验室结构生物学家Richard Henderson非常坚定地宣称，低温电镜会成为解析蛋白结构的主流工具。在将近20年后的今天，他的预测比当年有了更多底气。Henderson表示，如果低温电镜保持这样的势头继续发展，技术问题也得以解决，那么低温电镜不仅会成为解析蛋白结构的第一选择，而是主流选择。这个目标已经离我们不远了。　　1. 施一公小组在《Science》发两篇论文报道剪接体三维结构　　　　U4/U6.U5 tri-snRNP电镜密度及三维结构示意图。　　2015年8月21日，清华大学生命科学学院施一公教授研究组在国际顶级期刊《科学》(Science)同时在线发表了两篇背靠背研究长文，题目分别为“3.6埃的酵母剪接体结构”(Structure of a Yeast Spliceosome at 3.6 Angstrom Resolution)和“前体信使RNA剪接的结构基础”(Structural Basis of Pre-mRNA Splicing)。第一篇文章报道了通过单颗粒冷冻电子显微技术(冷冻电镜)解析的酵母剪接体近原子分辨率的三维结构，第二篇文章在此结构的基础上进行了详细分析，阐述了剪接体对前体信使RNA执行剪接的基本工作机理。清华大学生命学院博士后闫创业、医学院博士研究生杭婧和万蕊雪为两篇文章的共同第一作者。　　这一研究成果具有极为重大的意义。自上世纪70年代后期RNA剪接的发现以来，科学家们一直在步履维艰地探索其中的分子奥秘，期待早日揭示这个复杂过程的分子机理。施一公院士研究组对剪接体近原子分辨率结构的解析，不仅初步解答了这一基础生命科学领域长期以来备受关注的核心问题，又为进一步揭示与剪接体相关疾病的发病机理提供了结构基础和理论指导。详细新闻报道参见：施一公研究组在《科学》发表论文报道剪接体组装过程重要复合物U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构。(Science, 20 Aug 2015, doi: 10.1126/science.aac7629 doi: 10.1126/science.aac8159)　　2. Science：HIV重大突破!史上最详细HIV包膜三维结构出炉!　　　　这项研究首次解析出HIV Env三聚体处于自然状态下的高分辨率结构图，其中HIV利用Env三聚体侵入宿主细胞。图片来自The Scripps Research Institute。　　在一项新的研究中，TSRI的研究人员解析出负责识别和感染宿主细胞的HIV蛋白的高分辨率结构图片。相关研究结果发表在2016年3月4日那期Science期刊上，论文标题为“Cryo-EM structure of a native, fully glycosylated, cleaved HIV-1 envelope trimer”。　　这项研究是首次解析出这种被称作包膜糖蛋白三聚体(envelope glycoprotein trimer，以下称Env三聚体)的HIV蛋白处于自然状态下的结构图。这些也包括详细地绘制这种蛋白底部的脆弱位点图，以及能够中和HIV的抗体结合位点图。(Science, 04 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2450)　　3. Nature：史上最详细转录因子TFIID三维结构出炉，力助揭示人类基因表达秘密　　在一项新的研究中，来自美国加州大学伯克利分校、劳伦斯伯克利国家实验室和西班牙国家研究委员会(CSIC)罗卡索拉诺物理化学研究所的研究人员在理解我们体内被称作转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC)的分子机构(molecular machinery)如何发现合适的DNA片段进行转录方面取得重大进展。他们史无前例地详细呈现一种被称作TFIID的转录因子所发挥的作用。相关研究结果于2016年3月23日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Structure of promoter-bound TFIID and model of human pre-initiation complex assembly”。论文通信作者是劳伦斯伯克利国家实验室生物物理学家Eva Nogales，论文第一作者是Nogales实验室生物物理学研究生Robert Louder。其他作者是Yuan He、José Ramón López-Blanco、Jie Fang和Pablo Chacón。　　这一发现是非常重要的，这是因为它为科学家们理解和治疗一系列恶性肿瘤铺平道路。Eva Nogales说，“理解细胞中的这种调节过程是操纵它或当它变坏时修复它的唯一方式。基因表达是包括从胚胎发育到癌症在内的很多重要生物学过程的关键。一旦我们能够操纵这些基本机制，那么我们就能够要么校正应当或不应当存在的基因表达，要么阻止这种过程[即基因表达]失去控制时的恶性状态。”(Nature, 31 March 2016, doi:10.1038/nature17394)　　4. Science：科学家成功解析人类剪接体关键结构　　　在最近发表的一篇Science研究论文中，来自德国的科学家们利用冷冻电镜技术首次在分子级分辨率水平上重现了人类剪接体中一个关键复合体——U4/U6.U5 tri-snRNP的结构。剪接体是一种由RNA和蛋白质组成的用于切掉mRNA前体中内含子的分子机器。该研究解析的U4/U6.U5 tri-snRNP是构成剪接体的一个重要组成部分，研究人员利用单颗粒冷冻电镜获得了人类U4/U6.U5 tri-snRNP的三维结构，该复合体分子量达到180万道尔顿，解析分辨率达到7埃。该研究模型揭示了Brr2 RNA解螺旋酶如何在分离的人类tri-snRNP中通过空间结构阻止未成熟的U4/U6 RNA发生解链，还展现了泛素C端水解酶样蛋白Sad1如何将Brr2固定在预激活位置。　　研究人员将他们获得的结构模型与酿酒酵母tri-snRNP以及裂殖酵母剪接体的结构进行了对比，结果表明Brr2在剪接体激活过程中发生了显著的构象变化，支架蛋白Prp8也发生了结构变化以容纳剪接体的催化RNA网络。(Science, 25 Mar 2016, doi: 10.1126/science.aad2085)　　5. 北京大学毛有东、欧阳颀课题组与其合作者在Science发表炎症复合体冷冻电镜结构　　　　炎症复合体三维结构　　北京大学物理学院毛有东研究员、北京大学物理学院/定量生物学中心欧阳颀院士与哈佛医学院吴皓教授合作利用冷冻电子显微镜技术解析了近原子分辨率的炎症复合体的三维结构，首次阐释了其复合物在免疫信号转导过程中的单向多聚活化的分子结构机理。该研究工作以“Cryo-EM Structure of the Activated NAIP2/NLRC4 Inflammasome Reveals Nucleated Polymerization”为题于2015年10月8日在线发表在国际期刊Science。　　先天免疫是人类免疫系统的重要组成部分，炎症复合体在触发先天免疫响应的过程中起到了关键信号转导的效应器作用，从而启动细胞凋亡等免疫应答和炎症反应。炎症复合体是胞浆内一组复杂的多蛋白复合体，是胱天蛋白酶活化所必需的反应平台，其复合物单体由多个结构域构成，并在上游蛋白的激活下诱导组装形成环状复合物。炎症复合体的结构对于认识先天免疫的信号转导过程、免疫调控和病原诱导活化等免疫响应机理具有关键的核心价值，因而成为国内外一流结构生物学和免疫学实验室追捧的研究对象。(Science, 23 Oct 2015, 10.1126/science.aac5789)　　6. Nature：施一公团队揭示γ -分泌酶原子分辨率结构　　　　人体γ -分泌酶3.4埃三维结构　　日前，清华大学教授施一公团队与国外学者合作，构建了分辨率高达3.4埃的人体γ -分泌酶的电镜结构，并且基于结构分析了γ -分泌酶致病突变体的功能，为理解γ -分泌酶的工作机制以及阿尔茨海默氏症的发病机理提供了重要基础。相关成果8月18日在《自然》发表。　　阿尔茨海默氏症是最为严峻的老年神经退行性疾病之一，但其发病机理尚待揭示。目前研究已知β -淀粉样沉淀是该病的标志性症状之一。而β -淀粉样沉淀的产生是APP蛋白经过一系列蛋白酶切割产生的短肽聚集而来。在此切割过程中，最关键的蛋白酶是γ -分泌酶。γ -分泌酶由四个跨膜蛋白亚基组成，其中，编码Presenilin(PS1)蛋白的基因中有200多个突变与阿尔茨海默氏症病人相关。γ -分泌酶在阿尔茨海默氏症的发病中扮演着重要角色。　　研究人员通过收集更多的数据、大量的计算并升级分类方法，计算构建出3.4埃原子分辨率γ -分泌酶的三维结构，可以观察到绝大部分氨基酸的侧链以及胞外区部分糖基化修饰和结合的脂类分子。在高分辨结构的基础上，施一公研究组对PS1上的致病性突变体进行了研究，发现这些突变主要集中在两个较为集中的区域内。他们对于其中一些突变体进行了生化性质的研究，发现这些突变会影响γ -分泌酶对于底物APP的酶切活性，然而对切割活性的影响却有所不同。(Nature, 10 September 2015, doi:10.1038/nature14892)　　7. Nature：人类核糖体结构终于被解析!　　　　核糖体是进行蛋白质翻译的机器，能够催化蛋白质合成。目前，许多研究已经对多种生物的核糖体结构进行了原子水平的结构解析，但获得人核糖体结构一直存在很大挑战，这一问题的解决对于人类疾病的深入了解以及治疗手段和策略的开发都有重要意义。　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了法国科学家关于人类核糖体结构解析的最新研究进展。　　在该项研究中，研究人员利用高分辨率单颗粒低温电子显微镜以及原子模型构建的方法获得了人类核糖体接近原子水平的结构。该核糖体结构的平均分辨率为3.6A，接近最稳定区域的2.9A分辨率水平。这一研究成果对人类核糖体RNA，氨基酸侧链的实体结构，特别是转运RNA结合位点以及tRNA脱离位点处的特定分子相互作用提供了深入见解，揭示了核糖体大小亚基接触面的原子细节，发现在核糖体大小亚基的旋转运动过程中，其接触面发生了强烈的重构过程。(Nature, 30 April 2015, doi:10.1038/nature14427)　　8. Nature：日本科学家成功解析代谢关键因子受体结构　　近日，著名国际学术期刊nature在线发表了日本科学家的最新研究进展，他们利用结构生物学方法对脂联素(adiponectin)受体，AdipoR1和AdipoR2，进行了结构解析，发现脂联素受体具有与G蛋白偶联受体不同的七次跨膜螺旋，对于靶向脂联素受体的肥胖及其相关代谢疾病治疗方法开发具有重要意义。　　在该项研究中，研究人员对人类AdipoR1和AdipoR2的晶体结构进行了解析，分辨率分别达到2.9 ?和2.4 ?，他们通过解析发现脂联素受体是具有不同结构的一类新受体。脂联素受体的这种七次跨膜螺旋在构象上与G蛋白偶联受体的七次跨膜螺旋不同，在这种新的 七次跨膜螺旋中，由三个保守组氨酸残基协同一个锌离子形成了一个大的腔体。这种锌结合结构可能在adiponectin刺激的AMPK磷酸化和UCP2表达上调方面具有一定作用。(Nature, 16 April 2015, doi:10.1038/nature14301 )　　9. Molecular Cell：中国科学家揭示A型流感病毒RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构　　2015年1月22日，中科院生物物理所刘迎芳研究组与清华大学王宏伟研究组在著名期刊Molecular Cell杂志在线发表了题目为 “Cryo-EM Structure of Influenza Virus RNA Polymerase Complex at 4.3 ? Resolution”的论文，揭示了流感病毒RNA聚合酶复合体的结构和功能。　　生物物理所刘迎芳和清华大学王宏伟课题组等中外多方参与的实验室通过使用最新的高分辨率单颗粒冷冻电镜三维重构技术，解析了含有A型流感病毒RNA聚合酶大部分成分的4.3埃分辨率的四聚体电镜结构。该复合体涵盖了流感病毒聚合酶催化活性的核心区域。从三维重构密度图中可以清晰识别出该空腔内PB1上的催化结构域以及结合的RNA复制起始链，据此，研究人员推测这是进行RNA合成反应的区域。这一活性中心结构与正链RNA聚合酶具有相似性，研究人员也因此提出了流感病毒合成新生RNA链的机制。(Molecular Cell, 5 March 2015, doi:10.1016/j.molcel.2014.12.031)　　10. Cell：科学家获得首个中介体复合物精确结构图　　　　中介体复合物(Mediator Complex)是细胞中最大也最为复杂的分子机器之一。现在，来自斯克利普斯研究所(TSRI)的科学家们在《细胞》杂志上报告称，他们利用用电镜获得了首个中介体复合物(Mediator)的精确结构图。　　Mediator是所有动植物细胞中的关键分子机器，对于绝大多数基因的转录有着至关重要的调控作用。Mediator拥有二十多个蛋白亚基，解析它的结构是基础细胞生物学的一大进步。这一成果能够为许多疾病提供宝贵的线索(从癌症到遗传性的发育疾病)。论文资深作者，TSRI副教授Francisco Asturias表示："明确这些大分子机器的结构和作用机制，可以帮助我们理解许多关键的细胞过程。"　　在这项新研究中，研究人员获得了高纯度的酵母Mediator，并通过电镜成像得到了迄今为止最为清晰的Mediator3D模型，分辨率达到约18埃。随后他们又进行了多种生化分析，例如在逐个去除蛋白亚基的同时观察电镜图像发生的改变。他们由此确定了酵母Mediator25个蛋白亚基的精确定位。　　项新研究获得的结构图谱，全面修正了之前的Mediator' 粗略模型。论文第一作者Kuang-LeiTsai表示："定位了所有的蛋白亚基之后，我们发现头部模块应该位于Mediator的顶部而不是底部。"此外，研究人员还对人类Mediator进行了深入研究。Tsai说："大体上看，人类和酵母的Mediator总体结构颇为类似。"最后研究人员在结构数据的基础上，为人们展示了Mediator调控转录时的构象变化。(Cell, 29 May 2014, doi: 10.1016/j.cell.2014.05.015)

冷冻电镜（cryo-EM）解析了一种帮助调节血压的蛋白质，即血管紧张素转换酶（ACE）的详细结构。这些结构提供了迄今为止对ACE的最全面的看法，将有助于改善心脏病的药物设计。这项工作是由开普敦大学（UCT）的研究人员与英国同步辐射光源"DIAMOND"的电子生物成像中心（eBIC）合作完成的。研究人员在《EMBO Journal》上发表了他们的研究结果（"冷冻电镜揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化机制"）。ACE会产生激素血管紧张素II，使血管收缩并提高血压。高血压是心脏病和中风的主要风险因素。与以前的方法相比，冷冻电镜使研究人员能够在更多的功能相关状态下观察到ACE。他们的工作为其生物功能和潜在的药物结合特性提供了关键性的见解。ACE蛋白的一个副本（即单体形式）是由两个结构相似但功能不同的结构域连接而成的。二聚体化（即两个ACE单体的相互作用）发生在一个小的表面空腔附近，改变了对ACE功能至关重要的核心氨基酸的构象。研究人员提出，这种二聚体化可能像一个 "关闭开关"，触发蛋白质核心的变化，并可能抑制它。如果能设计出一种类似药物的分子在腔内结合并引起同样的效果，它就能提供一种新的手段来使该酶失活。目前，许多ACE抑制剂在临床上可用于治疗高血压。但这些抑制剂非选择性地针对两个ACE结构域，并因此会在一些患者中引发副作用。开普敦大学教授、该研究的主要研究者Edward Sturrock博士解释说:“了解这些新发现的ACE结构和动态至关重要，这可能针对结构域选择性抑制剂的设计提供新的结合位点，进而规避副作用。”ACE蛋白在Sturrock的实验室生产，在UCT的电子显微镜单元（EMU）进行成像前的准备，并在之后转运到eBIC，在Titan Krios上进行冷冻电镜成像。图像处理在南非的CSIR高性能计算中心（CHPC）和EMU进行。“即使有高分辨率的成像，ACE的独特形状、小分子量和高度动态等特征也带来了许多挑战。"该研究的共同作者之一Jeremy Woodward博士解释道。该研究的第一作者Lizelle Lubbe博士解释说："最近开发的冷冻电镜图像处理方法对解析这些结构至关重要。"我们必须通过广泛的分类来计算分离图像，这一过程相当于' 数字纯化' ，因为生化方法无法分离ACE的单体和二聚体形式。然后，我们可以将三维细化的重点依次放在结构的不同部分，从而解析这两种ACE结构"。该研究的发现独特地揭示了ACE的高度动态特征，以及其不同结构域之间发生二聚体化和交流的机制--这可能启发治疗心脏病的新药。DIAMOND科学组组长克里斯-尼克林博士说：“我们对非洲的杰出科学家团队利用eBIC先进的冷冻电镜取得的这项研究结果感到高兴。世界迫切需要针对致命的心脏病和其他慢性健康状况的可持续解决方案。我们非常高兴的是，这项研究的结构见解可以为改进抗高血压药物设计铺平道路。”相关文献：Cryo-EM Structures of a Key Hypertension Protein to Aid Drug DesignCryo-EM揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化的机制高血压（高血压）是心血管疾病的一个主要风险因素，而心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管紧张素I转化酶（sACE）的体细胞异构体在血压调节中起着关键作用，因此ACE抑制剂被广泛用于治疗高血压和心血管疾病。我们目前对sACE结构、动力学、功能和抑制作用的理解是有限的，因为截短的、最小的糖基化形式的sACE通常被用于X射线晶体学和分子动力学模拟。在这里，我们首次报告了全长的、糖基化的、可溶性的sACE（sACES1211）的冷冻电镜结构。这个高度灵活的apo酶的单体和二聚体形式都是由一个数据集重建的。单体sACES1211的N端和C端结构分别在3.7和4.1Å被解析，而负责二聚体形成的相互作用的N端结构则在3.8Å被解析。此外，观察到两个结构域都处于开放构象，这对设计sACE调节剂有意义。参考资料："Cryo-EM reveals mechanisms of angiotensin I-converting enzyme allostery and dimerization"

发表在Nature杂志上的研究显示，在一种抑制免疫反应和阻碍癌症治疗的细胞中，脂肪酸转运蛋白2（FATP2）高水平表达。将肿瘤细胞从人和小鼠身上分离出来之后，研究人员还发现，FATP2能帮助制造产能脂质并将其运输入细胞。总的来说，这项研究指出FATP2恶意地重新改造身体常见的白细胞，而白细胞是在对抗感染方面起重要反应者的作用。当研究人员敲除一个与FATP2相关的基因时，他们发现一些癌症——淋巴瘤、肺癌、结肠癌和胰腺癌——的肿瘤在小鼠体内生长明显变慢。在2000年代中期内布拉斯加州的Concetta Dirusso发现，与一种破坏细胞复制的药物配合使用FATP2抑制剂Lipofermata同样有助于减缓甚至消除肿瘤。研究表明，在免疫抑制细胞中靶向FATP2可以阻止脂质的累积，减轻肿瘤的进展，而不会产生明显的副作用，研究小组说。“我认为主要的一点是，为什么这会引起一些兴奋，因为它不只针对一种癌症，”本研究的合作者和乔治霍姆斯大学生物化学教授DiRusso说。“能够针对不同癌症常见的一些细胞是非常需要的。”“它不能完全清除（肿瘤），但它只是计划的一部分。我们现在对联合治疗更感兴趣。它不是靶向一个目标，而是以多种方式进行靶向攻击，因为癌症是聪明的。癌症找到了绕过我们好药物的方法，这就是为什么这些药物的组合如此强大，而且，我们期望，更有效。”威斯塔研究所的Dmitry Gabrilovich及其同事几年前首次注意到实体肿瘤中FATP2的升高。他们的观察促使Gabrilovich联系了内布拉斯加州大学林肯分校主要研究脂肪分子如何穿过细胞膜的机制的生物化学家Paul Black。Black实验室对酵母的早期研究发现了一个基因片段和相关的蛋白质，它能激活脂肪酸并将其携带到细胞中，在细胞中，脂肪酸被代谢为能量或嵌入细胞膜中。这个蛋白质就是FATP2。“如果你的膜上有一个控制脂肪进入量的门，然后你开始启动这个门，它会影响下游的东西，” Black说。“如果一个癌细胞需要吃油脂，这样它就可以转移，真正成为一种严重的疾病，它必须向上调节这种蛋白质。所以这个门在所有这些代谢系统中扮演着非常关键的角色。”Black先前的研究也帮助确定了FATP2两种遗传变异体：一种是代谢的主要脂肪酸，另一种是跨细胞膜转运脂肪酸。这一重要的区别证明了DiRusso实验室的努力，该实验室筛选了超过100000个抗-FATP2的复合物，以筛选出可能有助于对抗肥胖和2型糖尿病的药物。药物Lipofermata基本上消除了组织培养中的脂肪积累，并将小鼠体内的脂质吸收率降低了60%以上，这使得Dirusso获得了该药物用于治疗代谢疾病的专利。所以当Gabrilovich联系到Black时，Black很快就和DiRusso联系上了。这两人最终为Gabrilovich提供他团队实验所需的生化方面的建议、样品和药物Lipofermata。“无论是癌症生物学还是糖尿病，或是在这个生物医学世界里你所追求的任何东西，你都不可能再自己单独去做了，”Black说。“很久以前，我们可以在某个地方做自己的事情，成为一个小筒仓。我们早期的一些机械工作就是这样做的，但现在的工作太复杂了。这是一个信息时代。我们还不知道完整的故事，但即将发布的数据将真正非常，非常迅速的推动这方面的进展。”

为什么我们会感觉到饥饿？为什么进食之后会出现饱腹感？我们能感知到大脑与肠道的紧密联系，以往的研究认为这种感知与触觉、视觉、声音、气味和味觉通过受神经支配的上皮传感器细胞传递到大脑不同，肠道刺激的感知被认为涉及消化系统和中枢神经系统之间信号传递的肠道-大脑连接（gut-brain connection）是以激素转运为基础的，这种基于激素的信号传递大约需要10分钟。在肠道中，有一层上皮细胞将腔与下面的组织分开。分散在该层内的是称为肠内分泌细胞的可电兴奋细胞，它们感知摄入的营养物质和微生物代谢物。与味觉或嗅觉受体细胞一样，肠内分泌细胞在存在刺激时会激发动作电位。然而，与其他感觉上皮细胞不同，肠内分泌细胞和脑神经之间没有突触联系的描述。人们认为这些细胞仅通过激素（如胆囊收缩素）的缓慢内分泌作用间接作用于神经。尽管它在饱腹感中起作用，但胆囊收缩素的循环浓度仅在摄入食物后几分钟达到峰值，并且通常在用餐结束后。这种差异表明大脑通过更快的神经元信号感知肠道感觉线索。来自美国杜克大学医学院的科学家们，利用Milo，揭示迷走神经（vagus nerve）可直接连接着肠道与中枢神经系统。相关研究结果发表在Science期刊上，标题为“A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction”。Milo单细胞Western Blot 验证肠分泌细胞存在神经突触相关蛋白本文使用与小肠类器官或纯化的肠内分泌细胞共培养的结节神经元，在体外重现了神经回路。并结合单细胞定量实时聚合酶链反应和单细胞Western Blot（Milo）共同对突触蛋白进行检测和评估。利用Milo在蛋白水平进行了进一步的验证：单细胞蛋白质印记结果显示83%肠内分泌细胞含有synapsin-1（分析的198 CckGFP细胞中的164个），与其他肠上皮细胞相比，纯化的CCK-肠内分泌细胞表达突触粘附基因Efnb2、Lrrtm2、Lrrc4 和 Nrxn2，表明这些上皮传感器具有形成突触的机制。为了确定与肠内分泌细胞接触的突触的神经元的来源，本文使用了一种改良后的狂犬病毒(DG-rabies-GFP，能感染神经元，但缺少跨突触传播所需的G糖蛋白)，发现在肠道类器官中，狂犬病比其他上皮细胞更喜欢感染肠内分泌细胞。并且肠内分泌细胞与迷走神经元突触，通过使用谷氨酸作为神经递质，在几毫秒内转导肠腔信号。这些突触连接的肠内分泌细胞（神经足细胞）形成的神经上皮回路通过一个突触将肠腔与脑干连接起来，为大脑打开一条物理管道，以突触的时间精度和空间分辨率感知肠道刺激。也正是这些突触信号神经足细胞告诉大脑肠道中发生的事情，对我们吃的食物做出一定的反馈。

当前，新型冠状病毒肺炎(COVID-19)仍在全球范围内持续威胁着人类的健康，截止到2021年6月初，新冠肺炎确诊病例已多达1.72亿，死亡人数超过370万。新冠爆发早期的研究主要集中在探索流行病学和发病机制上，随着人们对新冠病毒的认识逐渐加强，越来越多的临床专家开始关注新冠康复患者的预后评估。此前有研究指出新冠肺炎康复患者会持续出现不同程度的症状和意想不到的实质性器官功能障碍，然而这些后遗症发生的分子机制尚未明确。　　近日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰教授团队，和浙江大学第一附属医院郑敏教授团队开展合作研究，首次关注新冠肺炎康复患者的血清蛋白表达变化。通过蛋白质组学数据与临床数据的整合分析，提出康复患者在1个月后仍会出现胆固醇代谢紊乱和心肌受损。该研究以“Proteomic analysis identifies prolongeddisturbances in pathways related to cholesterol metabolism and myocardiumfunction in the COVID-19 recovery stage”为题于2021年6月3日线上发表在Journal of Proteome Research期刊上。　　图. 基于DIA-PASEF方法的定量蛋白质组学分析　　研究者对来自健康志愿者，COVID-19中症及重症病人的患病期和康复期的血清样本开展了基于DIA-PASEF方法的定量蛋白质组学分析。结果显示，与健康对照组相比，康复期的中症和重症患者体内分别有243和163个蛋白质发生了显著变化，其中，与患病期重合的蛋白数量分别为113和88个。进一步的研究结果表明，康复患者体内未恢复至正常水平的蛋白主要参与了胆固醇代谢、转运、酯化，及心肌肥大、心肌组织发育、心肌细胞分化、心血管系统发育等相关通路。值得关注的是，通过系统地统计600名新冠肺炎患者、1177名甲型流感患者和522名H7N9感染患者的总胆固醇水平数据，研究者发现仅新冠肺炎患者的血清总胆固醇在发病后呈上升趋势。相关研究结果有助于进一步探索针对新冠肺炎康复患者的临床治疗决策设计，未来有效改善患者的预后。本研究基于前沿的高通量DIA定量蛋白质组学技术，用高质量的数据为全面开展新冠康复患者的预后评估提供了可靠的重要分子基础和机制信息。此前，黄超兰主任领衔的多组学中心团队还与高福院士领衔的多学科团队紧密合作，揭示早期的新冠感染患者存在显著的免疫抑制，并首次提出COVID-19的发病机制或存在“两阶段”模式。多组学中心在黄超兰教授的带领下，将继续基于临床，前沿技术和基础学科的深度交叉融合，开展协同创新研究，持续为抗击新冠病毒做出多方面的贡献。 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授，浙江大学第一附属医院郑敏教授为本文的共同通讯作者 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心陈扬副研究员，浙江大学第一附属医院姚航平研究员，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心博士研究生张楠，浙江大学第一附属医院吴杰副研究员为本文的共同一作。　　原文链接：　　https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.1c00054

干式低温转运箱（生物样本转运）（-50℃至-70℃和-150℃至-180℃）干式低温转运箱，是美国BioLife百奥莱公司针对生物材料、低温敏感样品或者需要冷冻转运的产品开发的一款非常实用的转运工具。BioTTMULT系列转运箱是采用干冰作为冷源为低温样品材料采集、转运过程持续提供极端低温环境的一款结构紧凑、手提式的转运箱。采用专利设计DIRTM设计的冷冻支架，通过内部干冰产生可持续数小时的对流低温环境，可实现8个标准冻存盒的存放转运，凹槽设计便于了手动的搬运；采用高分子绝热保温材料，结构设计结实耐用，对液体无吸收，对于干冰的添加、去除剂样品的放置、取出操作方便，搬运舒适。BioTTM LN2系列转运箱是采用液氮作为冷源可提供极低温度存放环境的转运箱，包含了绝热腔体、带磁性的绝热箱盖、液氮吸收海棉、DIRTM金属支架，液氮被金属底部海绵完全吸收，通过导热金属架DIRTM提供持续的低温。创新点：BioTTMULT系列转运箱是采用干冰作为冷源为低温样品材料采集、转运过程持续提供极端低温环境的一款结构紧凑、手提式的转运箱。采用专利设计DIRTM设计的冷冻支架，通过内部干冰产生可持续数小时的对流低温环境，可实现8个标准冻存盒的存放转运，凹槽设计便于了手动的搬运；采用高分子绝热保温材料，结构设计结实耐用，对液体无吸收，对于干冰的添加、去除剂样品的放置、取出操作方便，搬运舒适。BioTTM LN2系列转运箱是采用液氮作为冷源可提供极低温度存放环境的转运箱，包含了绝热腔体、带磁性的绝热箱盖、液氮吸收海棉、DIRTM金属支架，液氮被金属底部海绵完全吸收，通过导热金属架DIRTM提供持续的低温。干式低温转运箱（生物样本）

Ca2+作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用，是单个细胞生存和死亡的信号。它参与了神经传导、血液凝固、肌肉收缩、心脏收缩、大脑功能、酶功能以及内分泌腺的激素分泌等各种生理机能。而人们对Ca2+在信号转导中作用的认识，则很大程度上取决于Ca2+测定技术。目前常用的Ca2+检测方法主要有：Ca2+选择性微电极测定法、同位素示踪法、核磁共振法和水母发光蛋白检测法等。01Ca2+选择性微电极测定法:Ca2+选择性微电极一种电化学敏感器。利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是Ca2+对数的线性函数，遵循Nernst方程。优点：直接、敏感地测定组织或细胞内的Ca2+，不需使用指示剂，不影响结合钙和游离钙的平衡。缺点：反应速度慢而无法测定Ca2+的快速变化，而且穿刺损伤细胞可引起渗漏，且不适用于太小的细胞。02同位素示踪法：用放射性核素45Ca2+对Ca2+进行示踪，可测量出通过细胞膜转运到细胞内Ca2+增加的速度及浓度的大小，揭示Ca2+泵的作用，目前主要用于测定跨膜Ca2+的流动。优点：测量方法简单易行，比普通化学分析法的灵敏度高。确定放射性示踪剂在组织器官内的定量分布，可以达到细胞、亚细胞乃至分子水平。缺点：静态效果差，需要特定的同位素测定仪，并且要注意示踪剂的同位素效应和放射效应问题。03核磁共振法：是一种新的、非光学技术的Ca2+检测方法。由于正常生物体内氟含量很少，为了得到足够的响应，在检测时需要使用含氟指示剂。该指示剂经过化学修饰后进入细胞，进而被水解成游离状态，然后与Ca2+结合，根据获得的波谱图计算出Ca2+的浓度。优点：具有非破坏性和无损伤性，能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测，准确反应Ca2+浓度。缺点：需要核磁共振仪，成本较高。04荧光探针法：目前常用的Ca2+荧光探针有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。这类探针本身无法进入细胞，但它的亲脂性衍生物却可以透过细胞膜进入细胞。一旦进入细胞，这类亲脂性衍生物的亲脂性封闭基团在细胞非特异性酯酶的作用下被分裂除去，在细胞内便会形成一种带负电荷的荧光染料。与胞内Ca2+结合时，其荧光强度显著增加。优点：指示剂易导入细胞，空间分辨率高，反应速度快，而且可同时检测多重离子。缺点：需要有荧光显微镜或激光共聚焦显微镜，成本较高。05水母发光蛋白检测法:最近十几年来，水母发光蛋白(Aequorin)很受人们的关注。水母发光蛋白由189个氨基酸组成，具有3个Ca2+结合的EFhand结构，所以水母发光蛋白可作为检测Ca2+的新型探针。优点：Ca2+/水母蛋白复合物能检测~0.1μm到＞100μm范围内的钙离子浓度，且复合物不会从细胞内泄露出来，可检测几小时至数十天内Ca2+浓度的变化。比荧光探针法的背景低，样本本身不会发生自荧光。腔肠素的性质腔肠素(Coelenterazine)作为海洋动物体内贮存光能的分子，它广泛存在于海洋生物体内，比如海肾、海蜇、水螅等。腔肠素是天然荧光素中最普遍的，它可作为很多荧光素酶的底物。目前研究得最透彻的以腔肠素为底物的荧光素酶来源于海肾（Renilla），即海肾荧光素酶（Renilla reniformis，简称Rluc）。腔肠素的工作原理腔肠荧光素是一个分子量约400 Da 的疏水基团，它可以自由穿越细胞膜。在一个以荧光素/荧光素酶为基础的系统中，腔肠素作为以水母发光蛋白为代表的海洋发光蛋白的辅助因子，与水母发光蛋白进行稳定的结合，引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂，腔肠荧光素(Coelenterazine)被氧化脱羧，形成腔肠酰胺（Coelenteramide），释放出CO2，同时发出波长为469nm的蓝色生物荧光，该荧光可用博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪进行测定。图1.腔肠素/水母发光蛋白检测Ca2+机制水母发光蛋白一旦和Ca2+反应即丧失发光功能，因此当一部分水母发光蛋白与Ca2+反应时，被消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca2+浓度变化，而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与Ca2+浓度之间存在线形关系。如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使遗传报告基因的功能。但是与萤火虫荧光素酶又有差异，即腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更利于生物荧光的研究。技术小结由于Ca2+在生命活动的各种生理生化反应、疾病的发生和发展中都扮演着极其重要的角色，而游离的Ca2+浓度变化又与细胞的功能、信号转导乃至细胞的凋亡有密不可分的联系，因此，研究如何检测细胞内游离Ca2+浓度显得尤为重要。Ca2+选择性微电极测定法不需要使用指示剂，但是穿刺过程会损伤细胞，进而引起渗漏。同位素示踪法简单，但是静态效果差，还需要注意同位素效应和放射效应问题。核磁共振法和荧光探针法都需要特定的仪器，成本较高。水母发光蛋白检测法不需要激发光源，因而消除了细胞自发荧光的干扰，背景荧光远低于使用钙离子指示剂的荧光。另外腔肠素具有疏水性，易于通过细胞膜，适于全细胞的研究。 腔肠素/水母发光蛋白的生物荧光反应对Ca2+浓度的变化非常敏感，但是这种发光相对较弱，因此需要使用高灵敏度的发光检测仪进行检测。 图2.Lux-T020高灵敏度管式发光检测仪 图3.Lux-P110高灵敏度板式发光检测仪博鹭腾公司的管式/板式发光检测仪采用超高灵敏度的低噪音单光子PMT，同时通过计数电子记录和分化脉冲 的单脉冲输出的能力来定义高数量级，从而实现更宽的动力学范围。高灵敏度板式发光检测仪设计了2个独立的喷射式自动进样器，精度高于97%。两款产品都适用于以水母发光蛋白为载体的 Ca2+ 浓度测定，极其微小的浓度变化也可以轻松检测。除了检测上述Ca2+ 浓度以外，博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪还可以测定活细胞内报告基因、ATP、活性氧、半胱天冬酶等指标。

大家好，本周为大家介绍一篇发表在Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A上的文章，HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding1，文章作者是华盛顿大学的Tobin R. Sosnick。　　TonB-依赖的转运体(TBDTs)广泛存在与革兰氏阴性菌的外膜上，通过其摄取营养。但TBDTs转运时的机制尚不明确，尤其是可供底物通过的跨膜β-桶孔径打开时的结构变化机理。BtuB是一种典型的大肠杆菌TBDT，其功能和生物物理环境都得到了广泛的研究。目前推测BtuB在行使转运功能时，其通道孔径形成需要BtuB与底物维生素B12结合，其N-端7个残基(称为“Ton box”)产生较大的构象转变，从β-桶中甩出进入胞质并与下游蛋白TonB发生相互作用。但孔径形成的过程具体机理存在两个具有争议的猜想：力依赖模型认为，TonB通过将BtuB从β-桶拽出到胞质，并从膜内侧将能量传递给BtuB，这些力可能重塑塞区并导致孔径形成 而非力依赖模型则认为孔径的形成跟BtuB自身保守的Ionic Lock(IL，即R14和D316间的盐桥)相互作用有关，当B12存在时只需要IL解锁TonB就能与BtuB结合产生成孔运动。晶体学研究捕捉到了Apo BtuB、BtuB:B12和BtuB:B12:TonBCTD的结构(图1)，但晶体学研究一来存在晶体堆积导致其结构与溶液态蛋白结构产生一定差异的问题，二来静态的结构“截图”无法提供动态变化过程信息。因此，本文选择氢氘交换质谱法(HDX-MS)解析BtuB和配体结合时产生结构动态变化过程，以深入推测该过程的具体机制。　　图1. BtuB腔体结构域与两个配体结合事件的构象响应模型。　　该实验共设有4组，包括：Apo BtuB、BtuB + B12、BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB。作者对BtuB + B12的HDX速率及保护因子(PF)进行了分析(图2)：其中，N-端2-29残基(包括Ton box在内及IL中的R14)、pre-SB3区域属于快速氘代区域，SB1、SB2、SB3属于中速氘代区，其他区域属于慢速氘代区。　　图2. HDX速率分区并映射至结构。　　随后作者分析了Apo BtuB、BtuB + B12的HDX-MS实验数据(图3)。其中IL区域及其相连的Fisrt Strand区域的HDX变化情况最为显著(氘代上升)，从氘代动力学图中我们可以看到添加B12后该区域的氘代速率从较慢的水平转变为较快的水平，这说明B12的结合足以使得IL区域发生较大的构象变化，该现象呼应了TonB从较为紧凑的结构转变为较为动态/溶剂可及性高的结构。除此之外，N-端前5个残基区域经历了轻微的氘代上升 底物结合区SB1、SB2和SB3经历了一定程度的氘代下降，而SB3的前端经历了一定的氘代上升。　　图3. BtuB + B12和Apo BtuB的HDX比较。　　接着作者也考察了BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB的HDX-MS结果(图4)。结果发现，只加TonB时BtuB的IL区域并未发生较大的HDX变化，而同时添加B12和TonB的BtuB IL区产生了明显的氘代变化，这些现象进一步证实了BtuB的Ton box发生结构改变是B12结合后IL解锁产生的效应。这些实验结果支持非力依赖型假说机制，即B12结合后通过別构效应使得IL处的盐桥打破，使得Ton box区被释放至胞质中，进一步跟下游蛋白结合从而打开通道孔径。　　图4. 不同组别的IL区域的HDX氘代动力学图。　　本文通过HDX-MS实验解决了大肠杆菌离子通道家族中一蛋白BtuB配体相关的动态调控机制，通过实验的方法验证了非力依赖机制假说。本文选取的体系及蛋白样品较为巧妙，实验设计合理，实验证据充分，行文逻辑严密，为离子通道的动态调控机制提供了见解，是HDX-MS方法优势的典型体现。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　原文：HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding　　李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Zmyslowski, A. M. Baxa, M. C. Gagnon, I. A. Sosnick, T. R., HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain's allostery and unfolding upon B12 and TonB binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022, 119 (20).

PART.01 OAT转运体 肾脏在代谢产物的排泄、酸碱平衡、维持体内系统稳态中起关键作用，其中肾小管的分泌和重吸收功能主要由转运体介导，这也是葡萄糖、氨基酸和其他营养物质吸收及清除内源性废物和外源性生物制剂的有效机制。这些转运体主要分布于肾近端小管细胞基底膜和顶端膜，其中OATs主要负责阴离子和两性离子有机分子（包括内源性物质和许多药物）的跨膜运输，属于两亲性溶质转运蛋白家族（SLC）。 目前已报道的OAT家族成员有10余种，包括OAT1-OAT10以及尿酸转运体，大多分布于肾脏之中。OATs可以将由血液进入管周液中的多种外源性及内源性有机阴离子毒素逆电化学梯度转运至肾小管上皮细胞内，最终随尿液排出体外。而疾病、药物-药物相互作用或其他因素等均可能引起OATs表达或功能的改变，从而导致药物的肾脏分布改变，诱导有毒代谢产物的积累，最终引发肾脏毒性。因此，OATs在药物的肾脏毒性中具有关键作用。 图片出自文献“肾脏有机阴离子转运体介导的中药肾毒性研究进展” PART.02 OAT1转运体 OAT1是肾脏的主要药物转运体之一，同时也是肾脏OATs家族中分布最广的一种，被FDA列为与临床药物治疗密切相关的7个重要转运体之一，主要分布于肾近曲小管。OAT1底物覆盖范围非常广泛，主要包括叶酸等内源性物质以及对氨基马尿酸（PAH）、抗病毒药物、甲氨蝶呤、抗生素、非甾体类抗炎药等。 在联合用药方案中，底物可能彼此竞争结合转运蛋白，使药物清除率降低，药物在体内积累，从而导致潜在的不良反应。研究显示，丙磺舒可竞争性抑制OAT1对头孢类的摄取，使得头孢类药物的肾清除率下降，半衰期和血药浓度明显增加；吲哚美辛、酮洛芬可降低甲氨蝶呤的肾脏清除率，引起急性肾衰竭；马兜铃酸可抑制OAT介导的丙磺舒的摄取，马兜铃酸在肾脏蓄积，产生毒性。 药物肾毒性的传统评价方法多采用体内动物模型和体外2D肾细胞系模型，但是肾脏OATs在转运多种具有潜在肾毒性的药物中起着至关重要的作用。目前尚没有OATs晶体蛋白，主要借助特异性的人源OATs转染细胞，对OATs的配体识别结合域结构及配体结构特点进行考察，阐明OATs与药物间相互作用，以此评价药物肾毒性。基于此，IPHASE研发出了国内首家瞬时转染重组OAT1转运体细胞。 PART.03 IPHASE 转运体相关产品 IPHASE作为创新药体外研究生物试剂引领者，凭借先进的设备、专业的技术人员和多年研发经验，通过HEK293细胞系成功构建国内首家瞬时转染重组OAT1转运体细胞，推出SLC转运体家族新产品！ IPHASE技术人员以PAH为底物验证重组OAT1转运体细胞的代谢能力。结果发现，IPHASE重组OAT1转运体细胞转运PAH的能力是指导原则的9倍，表明IPHASE瞬时转染重组OAT1转运体细胞满足药物研发要求。 1 批量生产采用批量生产方式，库存充足，可保证同一批次产品的供应。 2 货期短国内现货，保障客户使用需求。 3 售后服务机制健全有专业技术人员提供全方位服务。 除瞬时转染重组SLC OAT1转运体细胞外，IPHASE同时推出了就ABC转运体囊泡和SLC转运体细胞相关产品，供客户自行选择，以满足客户对于不同药物的研究。 产品名称 产品规格 OATP1B1 转运体 8-10 million OAT1 转运体 8-10 million OAT3 转运体 8-10 million OCT2 转运体 8-10 million OATP1B3 转运体 8-10 million OATP2B1 转运体 8-10 million OCT1 转运体 8-10 million NTCP 转运体 8-10 million MATE1 转运体 8-10 million MATE2K 转运体 8-10 million OATP1A2 转运体 8-10 million BCRP 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL BSEP 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MDR1 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MRP1 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MRP1 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MRP3 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MRP4 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL MRP8 转运体 0.5 mg/mL*0.5mL IPHASE/汇智和源凭借多年的研发经验，推出了多领域、多种类的高端科研试剂，为药物早期研发提供筛选工具，为生命科学领域的探索提供新材料、新方法和新手段，为遗传毒性研究提供便捷产品。此外，IPHASE/汇智和源可提供特殊产品的定制服务，望广大科研工作者来电咨询，咨询热线400-127-6686。 发 文 章 得 奖 励 凡使用本公司产品，在国内及国际刊物上发表论文（论文发表日起一年内），并注明产品属于汇智和源/IPHASE所有，即可申请奖励。根据发表刊物影响因子不同，给予不同金额奖品： 非SCI论文及IF≤5分，500元礼品； 5分＜IF≤8分 800元； 8分＜IF≤10分 1000元； IF≥10分 2000元； 注：礼品卡也可兑换同等金额产品购买抵用券； 活动多多，礼品丰厚，快来参与吧！ 关 于 我 们 汇智和源，致力于为创新药研发企业及生命科学研究机构提供高品质的生物试剂，IPHASE为公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。

21世纪，全球各个国家都处在一个经济、信息、科技多方面高速发展的时期。经济的发展提高了绝大多数人们的生活水平，信息科技的大爆炸拓展了人们的视野和见识，科技的进步为人类的持续发展和安全提供源动力。然而，事物通常都具有两面性，给我们带来便捷和效益的同时，也将衍生诸多问题。食品安全问题愈发严峻，便是当今经济、信息、科技发展的副产物。食品企业追求经济利益最大化时，往往利用一些不法的伪科学手段来降低企业生产成本，损害人们的身心健康安全。层出不穷的食品安全事件，尤其在乳制品行业年年都接连不断地爆发，如同挥之不去的梦魇，在这个信息大爆炸的时代，迅速传播，不断地刺痛着人们越来越越敏感脆弱的神经。 日前，香港商业调查机构CER公司公布报告称，某洋品牌配方奶粉远未达到国际标准甚至是中国所能接受的最低标准，被指最差洋奶粉。质量最差门主要是该品牌1段婴幼儿配方奶粉，乳清蛋白和酪蛋白比例不合格。说明称，乳清蛋白中含有高浓度、比例恰当的必需氨基酸，还含有为新生儿必需的半胱氨酸。乳清蛋白还含有包括免疫球蛋白和双歧因子等免疫因子。对于宝宝而言，乳清蛋白是一种优质蛋白，因为它容易被消化，蛋白质的生物利用度高，从而有效减轻肾脏负担。酪蛋白中含有丰富的必需氨基酸，还含有婴儿特别需求的蛋氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸。酪蛋白中结合了重要的矿物元素，如钙、磷、铁、锌等。但是，酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳。过量的酪蛋白会产生较高的肾溶质负荷，给宝宝肾脏带来较重的负担，对宝宝是不安全的。 乳清蛋白和酪蛋白各有好处，但合适的比例还是应该以母乳作为黄金标准。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60 : 40(而普通牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的比例为18 : 82)。而此次被检测出的该品牌奶粉，乳清蛋白和酪蛋白的比列为41 : 59。国际食品法典委员会（CAC）在&ldquo 婴儿配方食品及特殊医学用途婴儿配方食品&rdquo 标准中，没有对产品中乳清蛋白的比例提出要求，而推荐以必需和半必需氨基酸的含量是否接近母乳作为婴儿配方食品中蛋白质质量的判定依据。其他国家和地区（包括美国、欧盟和澳大利亚、新西兰等）均未规定乳清蛋白在蛋白质中所占比例。我国国家标准GB10765－2010《婴儿配方食品》中，要求&ldquo 乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量应&ge 60%&rdquo ，即以乳或乳蛋白制品为主要原料的婴儿配方食品中，乳清蛋白所占总蛋白质的比例应大于等于60%。该要求主要是参考了母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例，沿用了我国GB10766－1997《婴儿配方乳粉ⅡⅢ》中关于乳清蛋白比例的相关规定。 各种品牌的婴儿奶粉都在宣称"接近母乳"，其中乳清蛋白和酪蛋白的比例是一个重要的指标，因为它能提供最接近母乳的氨基酸组合，更好地满足宝宝的成长需要。实际上，牛奶中酪蛋白含量的测定对于乳制品和奶酪制品生产商也都具有重大的经济意义。厂商通过测定酪蛋白含量，可以精确预测利用牛奶生产奶酪的产量。目前，市场上已经有一种快速测定乳清蛋白和酪蛋白比例的方法，是由美国CEM公司提出，在一些实验室应用推广。原理上是利用快速真蛋白测定仪，测得总蛋白含量后，沉淀及过滤酪蛋白，再测量乳清蛋白含量，能够快速精确得出酪蛋白含量，从而确定乳清蛋白和酪蛋白比例。整个过程仅需约15分钟,精确度和重复性相比其它凯氏定氮法和凝胶色谱法等更高，且没有污染性、腐蚀性试剂。这种高效而环保的方法值得推广，使用。 美国 CEM SPRINT 真蛋白质测试仪更多详情，请联系培安公司：电话：北京：010-65528800 上海：021-51086600 成都：028-85127107 广州：020-89609288Email: sales@pynnco.com 网站：www.pynnco.com

日前，国际蛋白质学会(Protein Society)将2015年&ldquo 青年科学家奖&rdquo 授予清华大学医学院教授颜宁博士，表彰她在跨膜物质运输的结构生物学领域所做出的一系列杰出工作。　　该学会网站发布的声明指出：颜宁博士独立开展研究工作不到十年，但却在膜蛋白、特别是跨膜转运蛋白的结构生物学研究领域取得了一系列令人叹为观止的出色成果，这其中包括具有里程碑意义的人类葡萄糖转运蛋白GLUT1的三维晶体结构。此外，她在离子通道研究领域也卓有建树，为钠离子通道研究贡献了主要结构之一 最近她还利用最新冷冻电镜技术解析了高通量钙离子通道RyR1的高分辨率结构。颜宁博士不仅敢于挑战结构生物学研究中的&ldquo 硬骨头&rdquo ，而且致力于通过结构信息全面揭示蛋白质的功能与生物学意义。　　国际蛋白质学会&ldquo 青年科学家奖&rdquo 前身为&ldquo 鄂文西格青年科学家奖&rdquo (The Irving Sigal Young Investigator Award)，设立于1989年，每年颁给一至两位处于独立科研生涯早期(独立领导实验室一般不超过8年)、但已对蛋白质研究领域作出重要贡献的优秀科学家。2004年之前的获奖者、包括第一位华裔获奖者施一公教授(2003年)，绝大多数都已经入选美国科学院。颜宁博士是该奖设立27年来的第30位获奖者。　　颜宁教授将于2015年7月在西班牙巴塞罗那召开的国际蛋白质学会年会上领奖，并作获奖学术报告。　　颜宁指导学生做实验　　颜宁，1996-2000年就读于清华大学生命科学与技术系，获学士学位 2000-2004年于美国普林斯顿大学分子生物学攻读博士学位， 2005年获得由《科学》杂志和美国科学促进会评选的北美地区&ldquo 青年科学家奖&rdquo 2007年10月受聘清华大学医学院教授 2012年入选美国霍华德休斯医学研究院首批&ldquo 国际青年科学家&rdquo ，同年获得基金委&ldquo 杰出青年基金&rdquo 2015年入选教育部&ldquo 长江学者&rdquo 。

摘要* 布鲁克使用 AmberGen 的 HiPLEX-IHC 肽编码抗体探针，结合全覆盖脂质组学、糖组学和代谢组学成像技术，为 timsTOF fleX 推出新型 MALDI HiPLEX-IHC 组织成像解决方案。* 新的 Canopy CellScape™ 单细胞、高度定量的空间蛋白质组学 ChipCytometry™ 平台具有全自动迭代染色功能，使用开源抗体对 TME 和转移研究的整个组织切片进行几乎无限的免疫肿瘤标记分析。* 对于癌细胞系和生物活检样本的蛋白质组学研究，在 timsTOF 4D 平台上采用 dia-PASEF 可以鉴定高达 13,000 种蛋白质（控制1% FDR）；采用库检索方式，在 35 分钟内可鉴定和定量 8000 多种蛋白质；使用新的 TIMScore 算法磷酸化肽段鉴定增加了 25% 以上。* 新型 timsTOF SCP 平台支持无偏单细胞蛋白质组学研究，是空间生物学癌症研究中 sc-RNA-seq 的重要补充。* 独特的高通量 timsTOF Pro 2 平台可以使液体活检生物标记物研究能够通过各种无偏的深层血浆蛋白质组学和 PTM 方法进行。2022年4月11日美国路易斯安那州新奥尔良——在2022年AACR年会上，布鲁克（纳斯达克股票代码：BRKR）推出并展示了针对空间多组学、单细胞蛋白质组学以及细胞系、组织和血浆蛋白质组学癌症的独特而新颖的研究。继最近对AmberGen公司的战略投资之后，布鲁克宣布建立合作伙伴关系，将Ambergen Miralys™ 肽标签抗体试剂盒应用于布鲁克timsTOF fleX新型MALDI HiPLEX-IHC工作流程，用于组织中的靶向蛋白质表达谱分析。通过将用于蛋白质识别的系列肽标签报告特征抗体探针与布鲁克灵活的MALDI成像工作流程相结合，研究人员可以在标准载玻片的组织切片中生成靶蛋白的高度多重图像。布鲁克timsTOF fleX平台将MALDI HiPLEX-IHC蛋白质图像与来自同一组织切片的小分子全谱成像（脂质、聚糖、代谢物、外源性物质）相结合，这是一种新颖独特的多组学分析能力，可用于新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的癌细胞系、组织和肿瘤微环境（TME）成像研究。布鲁克生命科学质谱成像业务总监Michael L. Easterling博士评论说：“空间蛋白表达图谱可以阐明免疫肿瘤学以及TME和癌转移研究中的过程。基于AmberGen肽标签抗体组合的MALDI HiPLEX-IHC工作流程提供了靶向蛋白质定位，并增加了在同一组织切片上绘制重要脂质、聚糖和代谢物分子图像的能力。此外，布鲁克还展示了新的CellScape™ 高精度靶向空间蛋白质组学仪器，该仪器最近由Canopy生物科学部门推出。Canopy生物科学的CellScape是新一代的Chipcytometry™ 仪器，它能够以单细胞和亚细胞分辨率对多种样本类型中的蛋白质生物标记物进行高倍数空间成像和量化。CellScape进一步提高了空间分辨率，提供高达 8 倍的通量和无人值守自动化。CellScape在定量生物学方面是独特的，它具有 8 个量级的极高动态范围（HDR）成像，可以定量同一样本中的低表达和高表达蛋白质，解决了高复合物成像固有的一个关键挑战。在癌症生物学中的应用非常丰富，包括肿瘤微环境（TME）中各种肿瘤和免疫细胞类型的空间表型。Canopy还推出了用于芯片细胞仪平台的空间免疫分析试剂盒。空间免疫谱 试剂盒是一种用于FFPE组织的定量、多重检测，旨在为芯片细胞研究人员（例如免疫肿瘤学）提供即用型预验证抗体试剂。这些试剂盒使研究人员能够跳过检测开发，直接进行转化和临床研究检测。

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p style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "在分子水平上，一个生物体的生理功能在很大程度上由它所表达的蛋白质决定，并且在大多数疾病病例中，蛋白质的功能失常往往是疾病的根本原因。/pp style="text-align: center"img width="450" height="253" title="1.jpg" style="width: 450px height: 253px max-height: 100% max-width: 100% " alt="1.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/67177d96-8d66-49b6-a9b3-805788370fe0.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "与传统的故障排查和维修一样，蛋白质的功能失常要找到问题根源进行修复，必须了解它是如何构建的，以及维持其各个功能的组件。而冷冻电镜技术（cryo-EM）正是可以帮助我们解读蛋白质等重要细胞机制的结构生物学。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "近期，国外媒体采访了格罗宁根大学(University of Groningen) 结构生物学系高分辨率cryo-EM负责人Cristina Paulino（助理教授），请其介绍了cryo-EM在其团队研究膜蛋白结构和功能方面所发挥的重要作用。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strong媒体：研究膜转运蛋白的机制及结构的重要意义？您通常研究哪些特定类型的膜转运蛋白？为什么？/strong/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strongCristina Paulino（CP）：/strong获得结构性见解是解开蛋白质作用机制的基础。将蛋白质功能和生理数据相结合时，我们能够详细了解这些蛋白质如何运作，了解它们为什么以及如何发生故障，疾病的原因是什么以及我们如何解决它。我喜欢将蛋白质结构比作“组装机器的蓝图”。虽然遗传学和生物化学有助于理解蛋白质的生理作用，但结构生物学揭示了这些纳米机器的外观以及它们的连接方式。只有这样，我们才能理性地理解它们并利用这些知识来修复、设计或阻止它们。例如，基于结构的药物设计等。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "我的研究重点是阐明嵌入膜中的蛋白质的作用机制，特别是膜转运蛋白和通道的作用机制。尽管膜蛋白具有高药理学相关性（目前超过60％市售药物的目标膜蛋白），但对膜蛋白的结构-功能-关系的研究还很少，需要生物学、化学和物理学等跨学科方法交叉研究。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "虽然我的小组主要研究关于这些蛋白质如何发挥作用的基本问题，但研究结果可以带来额外的社会经济应用。这在我们对人类ASCT2的研究中得到证实，人类ASCT2是人体细胞中谷氨酰胺摄取的主要来源，与癌细胞生长，患者生存率低以及癌症治疗的新热靶点密切相关。除了解开其运输机制细节的工作外，我们还与药物化学家合作，以确定新的抑制剂并指导基于结构的药物设计。其他研究模糊了传统运输机制中存在的传统概念边界。例如，KdpFBAC复合物，即细菌中的紧急钾摄取系统，结合了主要活性转运蛋白和通道的特征。在TMEM16家族中，成员既可以作为钙激活的氯离子通道，也可以作为脂质打乱酶，甚至两者兼而有之。我们的研究表明，在进化过程中，保守蛋白结构不仅相互进化，而且可以融合在一起，以适应不同的环境和细胞需求。img title="" class="qi_image" style="margin-bottom: 0px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 0px " alt="" src="http://qi.mofangyu.com/qi/core/static/ueditor/themes/default/images/spacer.gif"//pp style="text-align: center"img width="450" height="325" title="2.jpg" style="width: 450px height: 325px max-height: 100% max-width: 100% " alt="2.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/beafbf0b-0730-4485-8a5f-42a70493cd60.jpg" border="0" vspace="0"//pp style="margin: 5px 0px text-align: center color: rgb(0, 0, 0) text-transform: none text-indent: 32px letter-spacing: normal font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 text-decoration: none word-spacing: 0px white-space: normal orphans: 2 -webkit-text-stroke-width: 0px background-color: transparent "span style="color: rgb(0, 176, 240) "TMEM16家族的膜蛋白研究成果发表在2019年3月12日的eLife期刊上的两篇背靠背论文中/span/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strong媒体：cryo-EM对你工作的重要性如何？对团队能力提升有哪些影响？/strong/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strongCP：/strong在过去几年中，cryo-EM已被证明是结构生物学中不可或缺的技术，提供了超过X射线晶体学的几个优点，即(i)只需要少量的蛋白质 （ii）不受蛋白质晶体形成的限制 (iii)几乎不受缓冲成分的限制，并允许在冻结前诱导构象变化 (iv)不受样本成分或构象异质性的影响，使我们得以一窥结构动力学 （v）能够确定低分辨率和高分辨率结构 (vi)允许使用模拟天然脂质环境的工具，如纳米盘。值得注意的是，虽然冷冻电镜获得的分辨率平均低于x射线晶体学，但对于膜蛋白获得的共同分辨率是相似的（约3-4埃）。事实证明，这些优势对于解决使用膜蛋白时面临的几个挑战至关重要，可以进行前所未有的研究，并使cryo-EM成为研究膜蛋白结构的首选技术。因此，cryo-EM是我们小组采用的主要技术。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strong媒体：使用cryo-EM推断一个膜蛋白结构的实验周期大概需要多久？/strong/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strongCP：/strong在比较理想环境条件下，有一个比较理想的样品，一个性能良好的高端显微镜，有一套强大的图像处理集群，你可以在几天内解决一个高分辨率的结构。然而，在现实实验中，特别是在处理具有挑战性的膜蛋白时，时间周期通常是几周或几个月。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strong媒体:你最近用cryo-EM测定了TMEM16蛋白家族的结构。在新闻稿中，您声明这种方法“允许您对活动结构动态进行采样”。能详细谈谈吗?为什么cryo-EM优于其他可用的方法?/strong/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strongCP: /strongcryo-EM的优点之一是样品经过震荡冷冻，保留了溶液中的所有构象。这与x射线晶体学形成了强烈的对比，x射线晶体学的定义是，晶体中的所有蛋白质都处于相同的状态，而这种状态通常局限于能量优先构象。此外，我们还可以在图像处理的层面上处理cryo-EM图像中存在的构象异质性。因此，我们可以从相同的样品中确定蛋白质在溶液中的几种结构，它们代表不同的功能状态。在我们最近关于脂质scramblase TMEM16的研究中，我们能够在激活条件下获得几种超燃酶结构。我们将这些不同的构象解释为该蛋白逐步激活机制的快照，并提出其中一种中间状态可能与某些TMEM16蛋白中观察到的非选择性离子传导有关。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strong媒体:在您的研究领域里使用cryo-EM有什么限制吗?如何才能克服这些限制?/strong/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "strongCP:/strong cryo-EM在过去几年里发展得如此之快和如此之多，我感到非常兴奋。尽管该技术不断地重新定义其局限性并变得更加用户友好，但我们仍然面临一些挑战。然而，对于x射线晶体学来说，获得完全可操作和维护的同步加速器束流线基本上是免费的，而cryo-EM的总体成本和操作所需的专业水平一直是一个障碍。在一定程度上，政府对cryo-EM设备的补贴缓解了这一问题，但并没有完全解决。/pp style="background-color: transparent color: rgb(0, 0, 0) font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 letter-spacing: normal margin-bottom: 5px margin-left: 0px margin-right: 0px margin-top: 5px orphans: 2 text-align: left text-decoration: none text-indent: 32px text-transform: none -webkit-text-stroke-width: 0px white-space: normal word-spacing: 0px "在我的小组中，我们有一个内部的高端cryo-EM供我们使用，我们确保对所有小组成员进行彻底的培训。其他障碍包括图像处理集群的获取和成本、数据管理(每天可以记录几个TB数据)和图像处理方面的专门知识。幸运的是，它的成本随着时间的推移而降低，而图形处理单元驱动软件的实现使成本保持在可承受范围内。当然，样品制备有很大的改进空间(例如，需要更少量的蛋白质并避免空气 - 水界面)，几个团队和公司正在致力于解决这个问题。/pp style="margin: 5px 0px text-align: left color: rgb(0, 0, 0) text-transform: none text-indent: 32px letter-spacing: normal font-family: sans-serif font-size: 16px font-style: normal font-variant: normal font-weight: 400 text-decoration: none word-spacing: 0px white-space: normal orphans: 2 -webkit-text-stroke-width: 0px background-color: transparent "最后，解决一个结构所需的总时间，以及尺寸和平均分辨率的限制，仍然对基于结构的药物设计所需的高通量方法构成挑战和阻碍。这些问题正在通过结合更稳定的电子显微镜、更好和更有效的电子探测摄像机和改进的处理算法得到解决。br//p

pstrong仪器信息网讯/strong　 第六届全国冷冻电子显微学与结构生物学专题研讨会在北京隆重召开，研讨会由中国生物物理学会冷冻电子显微学分会(以下简称：中国冷冻电镜分会)主办，北京大学承办，中国电子显微镜学会低温电镜专业委员会协办。18日上午，生物大分子复合物的高分辨率动态结构专题报告会作为大会三大专题之一，在中国科学技术大学蔡刚教授和国家蛋白质科学中心(上海)丛尧研究员联合主持下，顺利召开。上午的会议围绕“膜蛋白复合物”共安排了11个专题报告，吸引了来自海内外400多名代表与会。/pp style="text-align: center "img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/9ac8f2be-f797-4b8b-925c-19f6d71f8f94.jpg" title="会场.jpg" alt="会场.jpg"//pp style="text-align: center "　　研讨会现场/pp　　抗生素耐药性已成为全球健康威胁，革兰氏阴性细菌是最难对付的病原体之一，主要是由于它们独特的“外膜”阻止了大多数抗生素进入细胞。脂多糖(LPS)是外膜的主要成分，在限制抗生素的进入中起着至关重要的作用。美国哈佛医学院廖茂富教授的《High-resolution views of lipopolysaccharide transport driven by bacterial ABC transporters》报告使用高分辨率单粒子Cryo-EM来揭示这些分子机器的机制。理解和靶向LPS生物合成对于开发新型抗生素以穿透外膜并杀死革兰氏阴性细菌至关重要。在组装到外膜之前，LPS必须穿过内膜、周质和外部构件，这个非凡的旅程由两个必需的ATP-binding cassette(ABC)转运蛋白来提供动力：MsbA和LptB2FGC。/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/3d990b6a-e671-45cc-b619-27fa72ad4d41.jpg" title="廖茂富.jpg" alt="廖茂富.jpg" width="450" vspace="0" height="283" border="0"//pp style="text-align: center "　　廖茂富作《High-resolution views of lipopolysaccharide transport driven by bacterial ABC transporters》报告/pp　　在植物中，高渗性刺激能触发渗透通道的开放，导致细胞溶质钙浓度升高而引发快速的下游信号级联。拟南芥中OSCA家族的成员，被认为在高渗应激反应的初始阶段发挥关键作用。 在这里，中国科学技术大学孙林峰教授《Structure of the hyperosmolality-gated calcium permeable channel OSCA1.2》报告通过单粒子冷冻电子显微镜确定了拟南芥OSCA1.2的原子结构。 拟南芥OSCA1.2是含有11个跨膜螺旋并形成的同型二聚体，处于灭活状态下，被清楚地识别出孔隙里残留物 其胞质结构域包含RNA识别基序和两个独特的长螺旋，这两个螺旋之间的连接体在脂质双层中形成锚，并且可能是渗透传递所必需的。 研究显示，AtOSCA1.2的结构可作为研究渗透胁迫响应和机械传感潜在机制的平台。/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/bbaafb19-ff20-4ad7-b76f-295737c6953c.jpg" title="孙林峰.jpg" alt="孙林峰.jpg" width="450" vspace="0" height="283" border="0"//pp style="text-align: center "　　孙林峰作《Structure of the hyperosmolality-gated calcium permeable channel OSCA1.2》报告/pp　　北京大学李龙副教授作《Structure of a substrate engaged SecASecY protein translocation machine》报告。通过蛋白质传导通道SecY / Sec61的蛋白质易位是原核生物和真核生物的常见细胞过程。在原核生物中，SecY通道与ATP酶SecA合作，在蛋白质翻译后将分泌蛋白质移过膜。目前尚不清楚SecA-SecY复合物如何转移其高度多样化的蛋白质底物。李龙组装了由SecA，SecY和多肽底物组成的蛋白质易位中间体，并确定了其在脂质环境中的Cryo-EM结构。研究结果显示，多肽底物被捕获在复合物的中心 SecA的夹子紧紧地保持多肽，SecA的双螺旋指状物将多肽引导至SecY的中央通道。李龙认为，该结构定义了ATP水解驱动蛋白质易位的关键步骤。/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/8ece8079-a629-4258-b296-571ef9db56a3.jpg" title="李龙.jpg" alt="李龙.jpg" width="450" vspace="0" height="283" border="0"//pp　　李龙作《Structure of a substrate engaged SecASecY protein translocation machine》报告/pp　　β-氧化是分解脂肪酸分子以产生能量的基本代谢途径。TFP在此过程中催化三种反应，并且TFP亚基中的突变会引起诸如TFP缺乏和妊娠急性脂肪肝的疾病。尽管TFP催化反应几乎在所有主要的生物化学教科书中都有详细记载，但人类TFP的结构尚不清楚。北京大学肖俊宇研究员作《Cryo-EM structure of human mitochondrial trifunctional protein》报告，研究中使用cryo-EM单粒子重建方法，确定了人类TFP的4.2Å 2四聚体结构。研究结果为TFP功能研究提供了结构基础，并对脂肪酸氧化相关疾病具有重要意义。/pp style="text-align: center "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/aa32d868-23c6-449b-94c0-9ee6f4482019.jpg" title="肖俊宇.jpg" alt="肖俊宇.jpg" width="450" vspace="0" height="283" border="0"//pp style="text-align: center "　　肖俊宇作《Cryo-EM structure of human mitochondrial trifunctional protein》报告/pp　　围绕会议主题，主办方还组织了其他7个专题报告，中国科学技术大学陈宇星教授作《Cryo-EM structure and transport mechanism of a wall teichoic acid ABC transporter》报告 浙江大学张岩教授作《Conformational dynamics and heterogeneity of GPCR signaling complexes》报告 美国哈佛医学院李宗利教授作《Cryo-EM structures of TRPC4/TRPC5 ion channels》报告 香港科技大学党尚宇作《Investigation of TMEM16 family proteins using single particle Cryo-EM》报告 美国国立卫生研究院吴雄武教授作《Cryo-EM and molecular simulation study of glutamate receptor activation mechanism》报告 西湖大学周强研究员作《Structure of the human LAT1-4F2hc heteromeric amino acid transporter complex》报告 南方科技大学龚欣副教授作《Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm》报告。/ppbr//p

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

近日，中国科学院武汉物理与数学研究所研究员唐淳课题组利用基于973重大科学研究计划“蛋白质动态学研究的新技术新方法”建立的研究技术，协助华中农业大学教授殷平课题组首次解析了N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白复合体结构，该研究成果发表于《自然》杂志。　　该工作揭示了RNA N6腺嘌呤甲基化修饰过程中的结构基础，是表观遗传学领域的一项重大突破。唐淳、武汉物数所副研究员龚洲和博士后刘主参与该项目，利用课题组发展的新技术新方法，通过结合小角X光散射与计算机模拟的手段，为该蛋白复合体的结构解析提供了研究方法上的帮助。　　经过近3年的努力，唐淳课题组发展、建立了包括核磁共振波谱、小角X光散射、化学交联质谱分析、单分子荧光检测和成像等技术在内的多种生物物理化学手段，并开发相应的整合计算方法，用于蛋白质动态结构及其转换过程的研究。课题组除了完成自身的科研项目外，积极开展广泛的合作与交流，与国内外同行共享研究技术和方法。目前，得益于“蛋白质动态学研究的新技术新方法”项目的实施，课题组已助力多个重要蛋白质结构的解析，取得了一系列的研究成果，研究成果发表于《自然—化学生物学》、eLife 等国际一流杂志。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

蛋白质组学的兴起带动了质谱技术的快速发展，而质谱技术的进步则拓宽了蛋白质组学研究问题的广度。随着蛋白质组学的兴起，特别是质谱技术的快速发展，蛋白质组学研究中产生的数据规模越来越大。依靠简单的手工处理已经远远不能满足问题的需求，通过先进的计算机算法与软件工具来自动处理大批量的蛋白质组数据已经成为蛋白质组学研究的重要分支，这就是“计算蛋白质组学”(Computational Proteomics)。　　仪器信息网讯 为了总结交流近年来我国计算蛋白质组学领域的基础研究与前沿动向，推动计算技术在蛋白质组研究中发挥更加切实的作用，2010年11月10-11日，由中国科学院计算技术研究所主办的“首届中国计算蛋白质组学研讨会”在北京中国科学院计算技术研究所召开。来自全国高等院校、科研机构、企事业单位的150余位从事计算蛋白质组学及其相关研究的专家学者参加了此次会议。会议现场　　会议主办方代表贺思敏研究员在会上表示：一般来说，计算蛋白质组学以计算技术为主要手段，是基于质谱技术的规模化蛋白质表达分析，也包括结构与功能的高通量分析。近年来，随着“精密蛋白质组学”概念和LTQ Orbitrap等技术的诞生，计算蛋白质组学的的研究发展迅速。　　从2005年开始美国相继举办了3次蛋白质组学研讨会，欧洲也陆续开展了3次蛋白质组学研讨会，其他国家会议也相继设立蛋白质组学的专题会议。同时，国际上专业的学术期刊也相继刊载了蛋白质组学的综述文章，这标志着计算蛋白质组学已经取得了学术界的普遍重视，首届中国计算蛋白质组学研讨会也正是应运而生。　　在我国，一些从事生化领域研究的专家几乎从不“上岸”，而部分毕业于信息领域的专家又从不“下水”，当然也存在着一批学者教授属于“两栖”作战，这样的研究现状不利于计算蛋白质研究的快速发展，因此，本次研讨会也是为了促进计算技术与生化领域的专家交流沟通。中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员　　同时，大会还邀请了20多位计算蛋白质领域的著名专家学者做了精彩的学术报告，报告内容涉及质谱数据分析、蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质定量、蛋白质相互作用、蛋白质定位、蛋白质结构、蛋白基因组学等。上海复旦大学杨芃原教授报告题目：糖蛋白结构的质谱数据库　　目前，通过各种技术构建专业性强、针对性明显的糖链结构数据库已经引起了关注。杨芃原教授的研究基于生物质谱的数据分析，建立了蛋白质糖基化位点以及糖链结构数据库。并开发了一套糖蛋白鉴定和糖链结构确立的理论算法，并将理论算法在我们创建的软件GRIP(Glycopeptide Reveal & Interpretation Platform)中全部实现。分析表明，该方法可有效进行通量化的糖蛋白结构质谱分析，展现了比较好的应用前景。加拿大西安大略大学张凯中教授报告题目：利用串联质谱技术解析多糖结构　　张凯中教授主要介绍了生命科学中蛋白糖结构及其和串联质谱与计算机科学的关系。张凯中教授表示，蛋白质中糖结构的变化是一种重要的蛋白质转录后修饰；蛋白质被酶处理后，经色谱分离，可用串联质谱解析其多糖结构。基于糖肽序列从头测序算法，张教授通过分析花生类蛋白质中的多糖结构得到了一种多项式时间算法简单模型，实践表明，该方法更具启发性。美国加州大学旧金山分校关慎恒教授报告题目：利用稳定同位素代谢标记研究哺乳动物动态蛋白质组的数据处理平台　　据关慎恒教授介绍，放射性同位素标记与稳定同位素标记是目前用于研究蛋白周转的主要工具。关慎恒教授利用稳定同位素代谢标记，通过测量小数组织中的1000多个蛋白的代谢常数，建立了复杂生物体系蛋白代谢周转组动力学的试验和信息处理平台。通过此平台，可以处理无标定量、SILAC。氢氘交换的实验数据。华大基因张勇先生报告题目：从新一代测序技术的组学到基于质谱仪的蛋白质组学--华大基因的生物信息学　　张勇先生介绍到，对于海量数据的信息分析和挖掘成为华大基因立足世界基因组领域的根本。除了测序仪，质谱仪无疑成为蛋白质组领域的高通量仪器。目前，华大基因通过利用海量数据的信息学分析从而识别关键要素，发挥了高通量、低成本的仪器特性。华大基因也逐步从 DNA、RNA水平，向蛋白质水平研究发展。。加拿大滑铁卢大学马斌教授报告题目：利用质谱和同源数据库进行全蛋白测序　　马斌教授首先谈到了，蛋白质数据库搜索和传统同源查找时遇到的问题，并分别给出了“分两步走”和“兼听则明”的两个解决办法。另外，串联质谱(MS/MS)的在该领域的应用仍然是一个非常具有挑战性的问题。马斌教授提出了一种新算法和自动化软件(CHAMPS)，实验表明，该方法具有大于99%的序列覆盖率和100%的蛋白质序列准确性。中科院计算所孙瑞祥副研究员报告题目：电子转运裂解质谱特征及其在蛋白质鉴定中的应用　　孙瑞祥研究员指出，近10年内，肽段或完整蛋白质在质谱仪中的裂解技术-电子捕获裂解(ECD)与电子转运裂解(ETD)逐渐发展起来。其中，目前市场上ETD主流仪器的供应商主要有赛默飞世尔、布鲁克、安捷伦、ABI、日立等公司。ECD和ETD在蛋白质组学中的应用，特别是在蛋白质的翻译后修饰鉴定和“自顶而下”的完整蛋白质裂解研究中已经展示出了诱人的前景。中科院大连化学物理研究所叶明亮研究员报告题目：基于质谱的蛋白质组学数据处理新方法和平台发展　　叶明亮研究员介绍到，在蛋白质组学数据处理方法和平台方面分别发展了针对非修饰肽段和磷酸化肽段鉴定的数据筛选方法。此外，还发展了一种结合二级质谱(MS2)和三级质谱(MS3)图谱以及正伪数据库检索的自动磷酸化肽段鉴定方法。该方法结合了MS2和MS3的高灵敏度和可信度，可以自动的对磷酸化肽段进行鉴定而无需进一步的人工验证。参会者合影留念　　另外，为了使参会人员能够获得有关蛋白质组质谱数据分析的基本技能，同时了解到本学科发展的最新动态，本次会议还安排了质谱技术与蛋白质组学基础培训，共有72人注册参加了此次培训课程，培训现场提问的听众络绎不绝，气氛十分活跃。培训人员与专家交流探讨

不法商人添加非法添加物的根本原因是，本来劣质产品中蛋白质含量就很低，需要添加用凯氏定氮法查不出的含氮物质充数。因为现行的凯氏定氮蛋白质测定方法局限于：只能测试总有机氮含量，而非特定的蛋白质中氮含量，因此，方法缺陷被不法商人所投机利用，使伪劣产品蒙混达标。 传统上，蛋白质的测定一直采用凯氏定氮法。该法的误区是：通过氧化还原反应，把低价氮氧化并转为氨盐，再通过氨盐中氮元素的量换算成蛋白质的含量。凯氏定氮针对有机氮化合物，主要是指蛋白质，aa，核酸，尿素等N3-化合物。非蛋白质的含氮化合物，，如三聚氰胺等，在凯氏定氮过程中，被同样消化成(NH4)2SO4，造成蛋白值虚高，我们统称这些化合物为假蛋白氮（NPN）。 从食品安全控制可靠性上考虑，解决问题的根本方法，是直接测试食品中的真蛋白质含量。因为，如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含量，那么就堵住了市场监管上的漏洞，使伪劣产品无所遁形。因此添加假蛋白质物质，如三聚氰胺等就毫无意义了。区别蛋白质与NPN的意义在于可以获得真实准确的蛋白质含量。从根本上解决了问题，厂商只能提供达标产品。这对需要进行蛋白质检测行业如食品、饲料及蛋白研究和管理领域具有重要的价值。呼吁中国国家有关部门将真蛋白质检测尽快纳入预防性安全监控标准。 1．食品行业的蛋白质问题 监控食品加工过程中的所有流程节点，包括原料采购、浓缩、勾兑、干燥、储存等。如假劣奶粉的危害就在于产品未达到国家蛋白标准限定，但在&ldquo 国标&rdquo 的凯氏定氮法检测后通过检测，其原因就在于搀加大量的NPN，造成蛋白质含量虚高。所添加的NPN大部分是化工产品，严重威胁食品安全。 2．饲料行业的蛋白质问题 饲料行业同样面临NPN造成的危害。例如最近引起社会关注的三聚氰胺。三聚氰胺含氮量达66%，白色无味，与蛋白粉外观相似，是被不法厂商大量使用的NPN。与&ldquo 瘦肉精&rdquo 、&ldquo 苏丹红&rdquo 等少数违禁添加剂一样，损害动物机体健康，并最终通过食物链转移到人体内。三聚氰胺高温下会形成氰化物，长期或反复接触对肾脏器官形成巨大损害。 3．其他研究领域的蛋白质问题 植物原料中NPN的含量随季节、地域及品种变化很大。精确检测蛋白质含量，排除NPN干扰对于保证科学研究的严谨性具有重要意义。 美国CEM 公司的真蛋白质SPRINT分析仪，是目前唯一的真蛋白质测试仪,其主要特点： 1.直接测量&ldquo 真蛋白质&rdquo ，而非总氮含量 2.所有类型样品检测（液体、固体、粉末状、奶油、肉类、坚果类、谷物、种子等）； 3.测量时间只需两分钟；全自动操作，无需有经验的化学家； 4.对三聚氰胺等非法添加剂，不会产生错误的蛋白质测量结果,精确性和准确度等优于凯氏定氮法； 5.对非氮蛋白质的测定无需校准，直接测量； 6.无需化学试剂；相比目前的检测方法，具有更低的操作成本；http://www.analyx.com.cn/products/list.asp?classid=122

赛默飞与蛋白设施达成战略合作，助力蛋白质科学创新发展赛默飞色谱与质谱中国 // 近日，科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）携手中国科学院上海高等研究院国家蛋白质科学研究（上海）设施（以下简称：蛋白设施）在上海举办蛋白质动态分析联合实验室签约仪式。双方在蛋白质动态分析研究领域，及通过蛋白设施联合上海临床研究中心开展的临床应用等领域，基于良好的合作意向，同意共建实验室及建立战略合作伙伴关系，并在2024年上海市产业技术创新大会得到会议举办方及与会代表众多领导、专家和学者的见证。本次战略合作基于赛默飞全球领先的高分辨质谱、电镜等平台及蛋白组学解决方案基础上，结合了蛋白设施在蛋白组学领域领先的科研能力、研发成果和强大的技术团队。双方围绕蛋白组学解决方案合作、技术培训交流、人才培养等方面达成了共识，旨在整合双方优势资源，共同提升蛋白组学研究、临床样本队列研究和生物医药领域产业的发展，共创技术新生态，为科研的新质生产力注入活力。高分辨质谱+冷冻电镜打造蛋白质科学创新平台赛默飞高级副总裁、亚太和拉美地区总裁Mark Smedley先生，赛默飞分析仪器事业部中国区商务副总裁周晓斌先生，蛋白设施主任吴家睿教授等出席了本次签约座谈仪式。双方领导共同讨论了高分辨质谱结合冷冻电镜技术，电镜技术结合AI，以及高分辨质谱、电镜技术与Olink方案的整合在蛋白组学领域的创新应用，并探讨了未来共同建立临床质谱标准数据库的落地化方案。滑动查看更多强强携手 加深合作全面推动蛋白质科学创新发展在报告环节，吴家睿主任介绍了蛋白设施成立的背景、技术系统、平台设备、重点方向以及近年来取得的成果。赛默飞材料与分析业务生命科学市场销售发展总监陈昉和色谱与质谱业务科学研究市场高级商务总监周昕分别对之前的技术及培训合作进行了回顾，并对未来计划进行了展望。蛋白组学领域自问世以来，取得了令人瞩目的进展。基于质谱和电镜平台，已经诞生了许多重要的发现。这些发现不仅深化了我们对蛋白质结构、功能和相互作用的理解，还为疾病诊断、药物研发和个体化治疗等提供了重要的指导。 此次合作，将共同推动Orbitrap质谱技术和Cryo-EM冷冻电镜在蛋白组学领域的应用，为蛋白质科学研究和生物医药相关领域产业的发展贡献更多华丽的成果。在未来的合作中，双方将共同努力，充分发挥赛默飞的全球领先技术和蛋白设施的科研实力，为蛋白质科学的创新突破和应用推广开辟更加辉煌的前景。关于中国科学院上海高等研究院国家蛋白质科学研究（上海）设施 蛋白质设施是国家“十一五”规划建设的国家重大科技基础设施项目，是全球生命科学领域首个综合性的大科学装置。蛋白质设施主体位于上海市张江科学城，于2008年经国家发改委批复，2014年建成并开放试运行，2015年通过国家验收正式开放运行。蛋白质设施的目标是建设国际一流的蛋白质科学研究体系和成为我国蛋白质科学及技术发展的重要创新基地。主要任务包括：开展蛋白质科学相关研究；研究蛋白质的多尺度时空结构；分析蛋白质修饰和相互作用；阐释蛋白质与化学小分子之间的相互作用；研究蛋白质相关的计算生物学与系统生物学；发展蛋白质研究的新方法和新技术学；结合创新药物的发展，研究蛋白质药物靶标的功能活动的结构特征等。蛋白质设施将聚焦世界科技前沿领域，在不断创新中实现跨越和发展，充分发挥大科学设施平台效能，全面支撑我国蛋白质科学研究和生物医药相关领域产业的发展。如需合作转载本文，请文末留言。

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4, G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(20%的序列覆盖率)。此外，在MS2的谱图中并没有观察到单体的峰，这说明共价键的断裂比蛋白质的展开和亚基的分离更快，这种效应也在之前的可溶性蛋白和膜蛋白研究中呈现。为了探究位点裂解的偏好，作者将片段离子丰度通过电荷态进行了归化一，发现了高频的断裂位点来自于经典的选择性断裂位点X|P和D|X，而剩余的断裂往往发生在A|G、F|G和V|G的位点，说明N端到甘氨酸有更高的断裂偏好。为了观察断裂的位置和蛋白质的二级结构之间的关系，作者沿着氨基酸序列构建了每个片段相对于原点位置的相对丰度图，多个电荷态的离子则通过归化一的方法进行求和。(图3)由此观察到了大多数的片段断裂出现在跨膜区域的α-螺旋处，其中8号α-螺旋的T|P和V|G，以及6号α-螺旋的L|G和F|G断裂产生了丰度最高的几个片段。此外，将这些片段的相对丰度映射到三聚体的结构上发现，片段来自于蛋白质的内部而非表面。分子动力学的研究表明了其中的机制，在高温下蛋白质的跨膜区域的α-螺旋保持了稳定的结构，而非跨膜区域的α-螺旋则失去了大部分的螺旋结构。先前的研究表明了α-螺旋外侧的质子化的氨基酸可以稳定α-螺旋的结构。由此，作者推测质子不光可以稳定蛋白质的螺旋结构，而且可以沿着蛋白质的骨架迁移来诱导电荷远程破碎。　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.