结合蛋白

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心王初课题组在RSC Chemical Biology杂志上发表了题为“ Discovery of Cisplatin-binding Proteins by Competitive Cysteinome Profiling”的研究文章。在这项工作中，作者应用基于竞争的定量化学蛋白质组学策略rdTOP-ABPP，在MCF-7活细胞体系中全局性地鉴定了顺铂(cisplatin)结合蛋白与其结合顺铂的位点,发现并证明了顺铂可以结合谷氧还蛋白1(GLRX1)与具有硫氧还蛋白结构域的蛋白17(TXNDC17)的活性位点。除此之外也发现了一个全新的顺铂结合蛋白甲硫氨酸氨肽酶1(MetAP1)，并发现其对顺铂的细胞毒性有一定的保护作用。顺铂是1965年被发现的化疗药物，其在如睾丸癌，卵巢癌等癌症的治疗过程中被广泛应用。其在进入细胞后生成的活性的二价铂离子会进攻DNA上的腺嘌呤或鸟嘌呤，从而引起DNA损伤，最终杀死癌细胞，这个过程被认为是顺铂细胞毒性的主要原因。而近年来很多研究也发现活性二价铂离子除了结合DNA之外，其也会与细胞质中大量亲核性物质反应，比如GSH，RNA以及金属硫蛋白等进行结合，据统计，仅有1%左右的铂是结合到DNA上。大量游离的活性二价铂离子会与细胞中多种有功能的蛋白质结合，从而影响其正常的功能，因此对顺铂结合蛋白的研究有助于我们更完整的理解顺铂细胞毒性的机理以及帮助我们避免顺铂耐药性。目前已经有很多组学上鉴定顺铂结合蛋白的方法，例如利用Pt的特征同位素分布的特点，在一级质谱层面筛选那些潜在的顺铂结合蛋白 或者将ICP-MS与二维凝胶电泳结合，从而在组学层面鉴定潜在的顺铂结合蛋白等，但这些方法受限于较低的灵敏度和通量。对顺铂进行生物正交基团改造，从而通过生物素-亲和素富集来鉴定顺铂结合蛋白的方法也被开发，并成功在酵母细胞中鉴定到数百种潜在的顺铂结合蛋白。但由于顺铂的分子较小，并且其作为无机药物，在其上进行官能团化修饰可能会一定程度上改变顺铂本身的性质，并影响最终的鉴定结果。鉴于活性二价铂离子易与半胱氨酸残基反应并结合，因此作者考虑使用基于竞争的定量化学蛋白质组学策略rdTOP-ABPP来鉴定顺铂结合蛋白。首先作者在活细胞水平上证明了顺铂可以与半胱氨酸特异性反应的探针IAyne竞争结合蛋白质的半胱氨酸残基。在优化了质谱条件后，作者在三次重复的质谱实验中共鉴定并定量到1947个肽段，对其进行条件筛选，定义顺铂处理后肽段的色谱强度与对照组中相同肽段色谱强度比值为Ratio，作者认为三次重复的Ratio平均值与对应的p value满足-log10(p value) x log2(ratio) 1.5的是潜在的顺铂结合位点，共筛选到125个肽段归属于107种蛋白。这些蛋白显著富集于核质交换通路以及氧化还原相关通路，这与之前报道的顺铂会引起DNA损伤以及顺铂会引发细胞产生氧化应激相对应。　　随后作者在筛选的107种蛋白中，选择了归属于氧化应激通路的已知的与顺铂有关的靶点蛋白GLRX1以及TXNDC17进行验证，纯蛋白层面的竞争标记与ICP-MS结果均表明这两种蛋白为顺铂结合蛋白，并且其顺铂结合位点均是质谱鉴定到的位点，且均是两个蛋白的活性中心位点，暗示了顺铂结合可能会影响两种氧化还原相关的酶的活性，进而引起氧化应激。纯蛋白质谱实验中，二级谱也表明两个蛋白与顺铂的结合均是桥连结合，这与文献中报道过的其中一种顺铂与蛋白结合的模式是相对应的。　　之后作者选择了另一种尚未明确是否与顺铂有相互作用的蛋白MetAP1进行了后续的生化验证。纯蛋白层面的竞争标记实验与ICP-MS的实验结果证明MetAP1是顺铂结合蛋白，且其顺铂结合位点为我们鉴定到的C14位。随后我们测量了顺铂对MetAP1活性的影响，发现顺铂不会明显影响MetAP1纯蛋白的活性，但可以抑制MetAP1在体内的活性，表明顺铂会在活细胞中影响新生成蛋白的N端甲硫氨酸切割，最后通过比较MetAP1的敲除细胞系和野生型的细胞系对顺铂的MTT曲线，作者发现MetAP1在顺铂引起的细胞毒性中起到了一定程度的保护作用。　　总之，作者应用竞争性ABPP策略，在MCF-7活细胞中鉴定到了107种潜在的顺铂结合蛋白，并对其中的三个靶标进行了验证。作者发现顺铂可以结合与氧化还原相关的酶GLRX1与TXNDC17的关键酶活中心，暗示了顺铂结合可能会影响两种氧化还原相关的酶的活性，进而可能影响细胞的ROS水平。也证明了顺铂通过结合来影响MetAP1的活性从而影响新生成蛋白的N端甲硫氨酸的加工，并表明MetAP1可以作为提高顺铂细胞毒性以避免肿瘤耐药性的潜在靶点。本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心的王初教授。其指导的化学与分子工程学院2019级博士研究生王相贺为本文的第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划的经费支持。　　本文作者：WXH　　责任编辑：JGG　　原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2023/cb/d3cb00042g　　文章引用：DOI: 10.1039/D3CB00042G

近日，中国科大生命科学学院、合肥微尺度物质科学国家实验室田长麟教授和清华大学刘磊教授合作，基于蛋白质化学全合成方法制备了不同类型的双泛素蛋白，在特定位点引入光活化交联基团，并成功鉴定高选择性双泛素结合蛋白。相关研究成果以“Chemical synthesis of diubiquitin-based photoaffinity probes for selectively profiling ubiquitin-binding proteins”为题发表在《Angewante Chemie Int. Ed.(DOI: 10.1002/anie.201611659)》上，该文章于2017年2月1日在网上公开发布。　　泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰中非常复杂的一类体系，目前发现存在8种多泛素连接方式，分别在泛素蛋白的Met1、Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、ys63等不同位点上接入下一个泛素蛋白。这些不同类型的蛋白质多泛素修饰在细胞自噬、蛋白酶体降解、细胞信号传导及DNA损伤修复等生命活动中执行非常多样的功能。但是，目前针对多泛素蛋白的生物法制备较为困难，导致选择性识别并结合多泛素修饰的蛋白质的了解非常贫乏。近年来，中国科大田长麟实验室和清华大学刘磊实验室通过紧密合作，在蛋白质化学全合成尤其是含有特种标记、翻译后修饰的膜蛋白、蛋白质复合物的化学全合成及组装等方面取得了多项重要突破(Angew Chemie2013,52:9558，JACS2014, 126:3695，Angew Chemie2015, 54:14276， JACS2016, 128:3553等)，并于近期发展了蛋白质泛素化修饰的化学合成技术并应用于含泛素化修饰核小体的冷冻电镜(cryo-EM)结构解析(ChemBioChem2017, 18:176)。这些为基于蛋白质化学全合成制备含有光交联基团的不同类型双泛素蛋白制备和高选择性结合蛋白的质谱鉴定提供了重要基础。　　 含有光交联基团的双泛素蛋白化学全合成及不同类型双泛素特异性结合蛋白的质谱鉴定　　近期，中国科大田长麟实验室、严以京实验室和清华大学刘磊实验室密切合作，应用基于蛋白质化学全合成方法制备了Lys48连接、Lys63连接的双泛素蛋白，并在蛋白质化学合成过程中在Ala46位点上引入不同的光交联基团。通过和标准泛素蛋白结合实验，确认了双泛素蛋白合成的有效性，并优化了光交联基团的反应条件。在此基础上，从哺乳动物细胞HEK293裂解液中通过光激活双泛素蛋白，并应用质谱方法鉴定出多个能和Lys48-连接双泛素、Lys63-连接双泛素结合的蛋白质，为后续进一步分析这些双泛素结合蛋白在细胞自噬、DNA损伤修复等生理活动中的功能机制提供了重要的前期基础。相关工作将为分析其他蛋白质相互作用、细胞中配体-受体发现等重要科学问题提供可靠的方法学手段。　　合肥微尺度物质科学国家实验室、化学物理系博士研究生梁军为该研究工作的第一作者。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金的资助。

北京时间11月11日消息 据科学日报报道，近日德国海德堡大学的科学家与吉森大学的研究人员密切合作，首次成功的电化学检测到蛋白结合的半导体材料，这多亏了基于电荷差异而研发出的一种新的调查方法。现在物理学家正在研究光学过程以实现在显微镜下检测和定位蛋白结合，这种方法将在医学研究和诊断领域具有新的应用。　　电化学检测蛋白结合的基础是实验室产生的生物膜，后者包含所谓的支持性脂质单分子膜&mdash &mdash 一种作为分子膜至关重要的建构单元的二维分子结构。研究人员将这些膜放在半导体氮化镓(GaN)的纳米结构上，氮化镓因它的化学和电化学稳定性以及独特的光电子特性闻名(它是蓝光LED器件中的一种具有重要应用价值的半导体)。科学家们利用电化学电荷传感器首次检测到混合生物膜-氮化镓结构上的蛋白结合。传感器测量了当蛋白结合到所谓的膜的脂质锚上时的电荷差异。这种混合的生物膜-氮化镓结构的发展是基于海德堡大学田中元梦(Motomu Tanaka)教授带领的生物系统的物理化学研究小组的博士研究生娜塔莉雅&bull 弗兰科尔(Nataliya Frenkel)的研究工作。海德堡的研究人员与吉森大学的半导体物理学家们在马丁&bull 艾柯夫(Martin Eickhoff)教授的指导下进行了传感器应用方面的研究。　　这项发表在期刊《先进功能材料》上的研究为研发新的过程奠定了基础，后者可以提供蛋白结合的光学证据。生物膜将被放置在基于氮化镓的量子点上，量子点是指大小只有几纳米的结构。随后将利用光激活量子点从而释放辐射。细胞膜上的蛋白结合将改变放射的密度。研究人员已经展示了这一方法适合蛋白结合的光学检测。目前他们正在与法原子能研究中心(CEA)密切合作研究具体的实现方法。

HTRF新品发布 | G蛋白/GTP结合试剂盒和β-Arrestin相关产品Original 免疫君 珀金埃尔默生命科学 6 days ago点击上方“珀金埃尔默生命科学”关注我们获取最新产品资讯哦！GPCRs（G蛋白偶联受体）是最大的细胞表面受体家族，人类基因组中约有826个GPCR。GPCR能够识别多种细胞外信号分子，并通过细胞膜传递信号，从而触发细胞内反应。以GPCRs为靶点的药物包括激动剂和拮抗剂，几乎用于每个主要疾病领域的治疗。截至2018年1月，共有475种靶向108种GPCRs的药物获得FDA批准，约占FDA批准药物总数的34%，证明了GPCRs在治疗研究中的重要性。PerkinElmer全系列GPCR产品概览GPCR信号通路GPCR的激活主要分为两类，经典激活途径和偏向激活途径。这两种信号通路调节不同的生理效应。经典激活途径是通过激活G蛋白复合物转导信号，G蛋白(Gɑβγ)为异源三聚体主要有四种亚型，根据Gɑ亚基分为：Gɑs、Gɑi/o、Gɑq/11和Gɑ12/13。GPCR-G蛋白信号转导的复杂性和特异性在一定程度上取决于大量与Gɑ蛋白密切相关的分子。当配体可以稳定不同的受体构象，从而优先激活某些通路，我们将这类激活叫做偏向激活。其信号通过β-arrestin或其他支架蛋白传导，它们通常启动不同于G蛋白的下游信号。目前针对上述GPCR激活途径，PerkinElmer推出HTRF系列新品:GTP Gi Binding assay KitGPCR处于静息状态时，Gα亚基与GDP结合。当GPCR被配体激活后，会引发GDP/GTP交换发生以及Gα-GTP和Gβγ相互分离，Gα亚基转变为活性状态。运用HTRF原理，我们对不可水解的GTP类似物进行Eu Cryptate标记，同时对抗Gαi的单克隆抗体标记d2。当Gαi和GTP结合，便会产生FRET信号。这个特定的信号与Gαi激活态成正比。PerkinElmer提供超过70种GPCR膜。更多信息，请点击文末“阅读原文”。Beta-Arrestin recruitment kitβ-Arrestin最初被发现是调节受体的脱敏和内化。由于其具有抑制广泛的G蛋白信号和激活更直接的级联反应的能力，针对β-Arrestin的靶向药物比通常的GPCR靶向药物具有更少的副作用。β-Arrestin招募实验通过激活GPCR检测内源性β-arrestin 2和AP2的招募来判断配体对β-arrestin信号通路的影响。运用HTRF原理，对抗AP2抗体和抗β-Arrestin抗体分别标记Eu cryptate和d2 acceptor，当AP2和β-Arrestin被招募到受体时，便会产生FRET信号。Total Beta-arrestin 1 cellular kit&AP2 total kit1实验原理2操作步骤如对上述产品感兴趣，欢迎来电咨询！400-600-2712

仪器信息网讯 据WHO官网数据显示，截至2021年8月6日，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已致全球2亿人感染，425万人死亡，这是本世纪最为严重的全球公共性卫生事件。　　刺突蛋白(Spike, S)是病毒表面重要的标志蛋白，是一种三个相同亚基以非共价键结合成同源三聚体 同时刺突蛋白存在多个N-糖基化位点，糖基通过共价键与蛋白相连组成糖蛋白，而大量糖基的存在则可通过糖基化改变蛋白质分子的空间结构而封闭或破坏抗原表位，从而抑制机体产生免疫应答，对病毒起到保护作用。刺突蛋白的序列主要包括N端结构域(N-Terminal Domain,NTD)、受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)、融合肽段(Fusion peptide，FP)、2段七肽重复序列(Heptad Repeat，HR)、中央螺旋(Central Helix，CH)、连接域(Connector Domian,CD)、跨膜结构域(Transmembrane Domain,TD)等。　　SARS-CoV-2通过高度糖基化的刺突蛋白(Spike, S)上的受体结合域(RBD)与人受体蛋白血管紧张素转换酶(ACE2)结合，进而入侵人体细胞，因此刺突蛋白糖基化在改变病毒结合/功能和感染性方面起着关键作用。然而由于传统自下而上糖蛋白组学方法分析完整糖型面临挑战，因此在刺突蛋白受体结合域(S-RBD) 上揭示新O-聚糖的分子结构和聚糖异质性仍是个难题。　　基于此，2021年7月，威斯康星大学葛瑛教授团队在《美国化学会志》(Journal of the American Chemical Society, JACS)上发表了最新的成果，题为“Structural O‑Glycoform Heterogeneity of the SARS-CoV‑2 Spike Protein Receptor-Binding Domain Revealed by Top-Down Mass Spectrometry”。该研究利用自上而下蛋白质组学方法，提供了刺突糖蛋白不同O-糖型的高分辨率蛋白质解析图，为揭示其 O-聚糖的功能作用奠定了强大的分子基础。这种蛋白质解析方法可用于揭示新出现的 SARS-CoV-2 S-RBD 变体以及其他O-糖蛋白的结构O-糖型异质性。　　该工作中，研究人员通过利用捕集离子淌度 (TIMS)-四极杆飞行时间质谱法和超高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱法解析了完整的 O-聚糖蛋白型的完整结构。自上而下的 TIMS-MS/MS 分离 S-RBD 的蛋白质构象异构体以揭示其气相结构异质性，而自上而下的 FTICR-MS/MS 提供深入的糖型分析，以明确识别聚糖结构和他们的糖基。　　该工作内容首次在结构上阐明了总共八种O-糖型及其相对分子丰度。该发现表明，这种自上而下的混合质谱分析方法可以提供S糖蛋白的不同 O-糖型的高分辨率蛋白质型解析图，这为揭示其 O-聚糖的功能作用奠定了强大的分子基础。这种蛋白质型解析方法可用于揭示新出现的 SARS-CoV-2 S-RBD 变体以及其他 O-糖蛋白的结构 O-糖型异质性。　　研究团队: https://labs.wisc.edu/gelab/　　葛瑛教授

蛋白质组学的发展方兴未艾，是后基因组时代重点关注的热点领域，新思路，新技术层出不穷，应用领域和场景不断拓展。Seer公司就是在这种大背景下诞生的一家科技新锐，其提供的Proteograph™XT平台利用经过特殊制作的纳米粒子磁珠，在跨数十个数量级丰度之间，非特异性地结合各类蛋白，无需额外去除高丰度蛋白，再利用高性能的质谱技术，达到高精度测量。在兼顾深度，增强蛋白组分析通量的情况下，实现对大规模血液蛋白的可重复性定量分析，创造了无偏差高通量探寻生物标记物的机会。在近期召开的JPM Healthcare 2024期间，Seer公司董事长兼CEO Omid Farokhzad说,Seer相信即将发布的使用其Proteograph产品组合的学术出版物将有助于推动对该平台的兴趣,并最终推动销售。然而,这个过程需要时间。Seer公司总裁兼CFO David Horn指出,关于2024年,他说公司对前景保持“相对谨慎的态度。”“外面仍有一些宏观不确定性,”Horn说。“而且......我认为我们正处于真正展示该平台所支持的生物学见解积累的阶段。”Seer的技术利用纳米粒子富集等离子样品进行蛋白质组分析,这是2023年等离子蛋白质组学取得重大进展的重要组成部分。在2023年的美国质谱学会年会上,赛默飞使用Seer的新Proteograph XT试剂盒在其Orbitrap Astral仪器上检测了近6000种等离子蛋白。在2024年的JP Morgan会议上,Farokhzad展示了一项涉及2500个样本的研究数据,显示Proteograph XT与Orbitrap Astral的组合总共识别出10000多种蛋白。他补充说,到目前为止,约50%的Seer客户已从原来的Proteograph转向XT。尽管取得这些进步,Seer公司Proteograph系统的销售速度在2023年比预期慢。6月,Seer公司启动了Seer技术访问中心(STAC)服务业务,研究人员可以通过该中心使用Orbitrap Astral上的Proteograph XT。到目前为止,STAC计划已经为48个研究组织提供服务,包括6家大型制药公司,Farokhzad说。（延伸阅读：赛默飞宣布与Seer扩大合作）最后,Seer认为Proteograph销售增长取决于论文发表展示该技术应用效果的数据。Farokhzad强调了该公司预计将在今年的同行评议出版物中发表的几篇使用Seer技术的预印本,包括诊断公司PrognomiQ的工作。推荐文章：1. 从JPM2024看科学仪器市场机会——重点趋势关键词盘点2. JPM亮点|赛默飞CEO看好这两类仪器与这一市场前景3. JPM2024亮点|布鲁克2023年营收涨13%,中国投资蛋白质组学推动增长  4. 14国科学家齐聚广州，为了这个蛋白质组学计划!

p　　strong仪器信息网讯/strong 2020年1月16日，《Science》杂志刊登了美国科学家David Hoffman和Gleb Shtengel在Hess和加州大学伯克利分校高级研究员Eric Betzig的指导下的一项关于融合超分辨率荧光和电子显微镜技术的显微表征新技术成果，该技术称为cryo-SR / EM，结合使用超低温超高分辨率荧光显微镜和聚焦离子束铣削扫描电子显微镜，可以在整个细胞的三个维度上可视化蛋白质-超结构关系。凭借其重要性，该研究也荣登本期《科学》杂志封面。/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(112, 48, 160) "Eric Betzig同时也是该文章的通讯作者，Eric Betzig何许人也？他正是2014 年诺贝尔化学奖得主，获奖理由是实现了单分子水平的超高分辨率荧光显微技术。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 159px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/5b338d9a-b6c7-40e6-b266-e27727951cdd.jpg" title="0.png" alt="0.png" width="500" height="159" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/de61b3cc-2d43-4121-bbff-f6911b77bfd0.jpg" title="01.png" alt="01.png"//pp　　封面为哺乳动物小脑颗粒神经元的半透明彩色核，这张3D效果图展示了由电子显微镜(EM)和低温超分辨率荧光显微镜所成像的组蛋白重叠所定义的特异性异染色质亚区类型。围绕细胞核的半透明薄壳代表核膜，而3D渲染的电镜数据(灰色)薄片则穿过细胞核。右下角的圆圈是线粒体的剖视图。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202001/noimg/775b649e-a426-4670-8069-b079cce58d46.gif" title="zooming_into_cell_2~2.gif" alt="zooming_into_cell_2~2.gif"//pp　　span style="color: rgb(0, 176, 240) "一种新的显微镜技术将电子显微镜和光学显微镜相结合，以生成细致的三维细胞图像，如图所示。span style="color: rgb(127, 127, 127) "图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020/span/span/pp　　有触须的的囊泡在很小的空间内穿梭负责将“货物”进行分类，相邻的神经元通过类似网络的界面相互依附。随着干细胞分化成神经元，DNA在核内重新排列。而一项新的显微镜技术可以将所有这些细节展现得淋漓尽致。/pp　　这项技术被称为cryo-SR/EM，它将电子显微镜和超分辨率光学显微镜捕捉到的图像融合在一起，以3D的形式呈现出细胞内部明亮、清晰、详细的图像。/pp　　strong技术背景/strong/pp　　多年来，科学家一直在探索细胞内部的微观世界，开发新的工具来观察这些基本的生命单位。但是每种工具都需要综合权衡。光学显微镜可以通过荧光分子标记特定细胞结构能够轻松识别，随着超分辨(SR)荧光显微镜的发展，可以更加清晰的观察这些结构。但是，在一个给定的时间内，荧光只能揭示细胞中10000多种蛋白质中的一小部分，因此很难理解这几种蛋白质与其他物质之间的关系。另一方面，电子显微镜(EM)可以在高分辨率的图片中显示出所有的细胞结构——但是仅仅通过EM来描述一个特征与其他特征是很困难的，因为细胞内部的空间是如此的拥挤。/pp　　霍华德· 休斯医学研究所珍妮莉亚研究园区的高级负责人Harald Hess说，“将这两种技术结合在一起，可以使科学家清楚地了解特定细胞特征如何与其周围环境相关联，这是一种非常强大的方法。”/pp　　Janelia科学家David Hoffman和高级科学家Gleb Shtengel在Hess和加利福尼亚大学伯克利分校HHMI研究人员Eric Betzig的高级研究员Eric Betzig的带领下率先开展了该项目。/pp　　首先，科学家在高压下冷冻细胞。这样可以迅速停止细胞的活动，防止冰晶的形成，而冰晶会破坏细胞并破坏成像的结构。接下来，研究人员将样品置于低温室中，在绝对零度以上10度的温度下，用超分辨率荧光显微镜对样品进行三维成像。然后，它们被移除，嵌入树脂中，并在Hess实验室开发的强大电子显微镜中成像，该显微镜向细胞表面发射一束离子，一点一点地研磨，同时为每一层新暴露的细胞拍照。然后，计算机程序将这些图像拼接成三维重构的图像。/pp　　最后，研究人员叠加了两个显微镜的三维图像数据。结果：令人震惊的图像以惊人的清晰度揭示了细胞的内部细节。/pp　　下面，此图像的一些示例说明了科学家如何使用该技术。 “已经引起了很多兴趣，” Hess说， “还有很多实验要做——整个世界的细胞都需要研究。”/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202001/uepic/850d6bc4-7e47-419b-8a2f-fb37e009dc71.jpg" title="1.png" alt="1.png"//pp　　strong全细胞相关成像/strong。高压冷冻细胞的低温超高分辨率荧光显微镜与聚焦离子束扫描电子显微镜(FIB-SEM)结合使用，可以在全局超微结构背景下对蛋白质进行多色三维纳米可视化。 从左上方顺时针方向：体积渲染的细胞，具有线粒体和内质网(ER)蛋白相关的正交排列(插图) 形态各异的溶酶体区室 由转录活性的蛋白质报道分子定义的异染色质亚结构域 与小脑接触处膜粗糙度相关的粘附蛋白颗粒神经元 过氧化物酶体(粉红色)与ER薄片(红色)和线粒体(青色)并置。/pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=1AD2E183304AD28E9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=5B1BAFA93D12E3DE&playertype=2" type="text/javascript"/scriptp　　在细胞开始(成年)之前(左)和之后(右)，神经元的细胞核看起来截然不同。随着细胞的成熟，DNA被重新包装在细胞核内以开启新的一组基因。这些变化反映在两个细胞内部的灰色斑点和彩色荧光的不同模式中。 “这项技术为分化前后的细胞核状态提供了惊人的详细快照，”参与该项目的圣犹达儿童研究医院的David Solecki表示。span style="color: rgb(127, 127, 127) "图片来源：D. Hoffman et al./Science 2020/span/pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=7CADAA470388AB6D9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=5B1BAFA93D12E3DE&playertype=2" type="text/javascript"/scriptp　　发育中的神经元粘在一起。这段视频准确地展示了这些细胞是如何相互粘附的，揭示了类似瑞士奶酪一样的联系，帮助年轻的神经元正确地迁移到它们在神经系统中的最终目的地。黏附蛋白的紫色和绿色超分辨荧光图像与电子显微镜下详细显示膜结构的图像相互关联。资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020/pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=09DED3BA4931A08E9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=5B1BAFA93D12E3DE&playertype=2" type="text/javascript"/scriptp　　细胞内充满了小囊泡——这是一种膜囊，帮助细胞储存蛋白质、分解细胞垃圾和运输货物。仅在电子显微镜下，这些不同种类的囊泡是无法区分的。但通过cryo-SR / EM，它们的明显特征变得清晰起来。这段视频放大了核内体，核内体负责将货物运送到细胞内的不同区域。span style="color: rgb(127, 127, 127) "资料来源: D. Hoffman et al./Science 2020/span/ppbr//p

引言准确预测蛋白质-配体(在本文的语境中，配体意指小分子有机化合物)的结合构象是计算生物学中的一项重要任务。一方面，它有助于人们理解蛋白质与内源小分子或药物分子的互作机制。另一方面，在药物设计或药物筛选(无论是单个蛋白-多个配体的正向筛选，还是单个配体-多个蛋白的逆向筛选)的过程中，也离不开对复合物构象的准确预测：这是准确计算蛋白质-配体结合稳定性(亲和力)的必要条件。对于给定蛋白和给定配体分子，依据是否已知结合口袋(也称配体结合位点)可以将复合物构象预测任务分为两类：口袋未知的盲对接(blind docking)任务和口袋已知的局部对接(local docking)任务。其中，盲对接任务是更普遍的、更富有挑战性的任务。在传统的对接流程中，这一任务又被划分为几个子任务：先借助口袋搜索算法确定可能的结合位点(即，转化为局部对接任务) 再利用构象生成(采样)方法生成大量可能的复合物构象，并依据打分函数评价各个构象(即，进一步确定配体的位置、朝向，以及各个键对应的扭转角) 挑选出打分值最优者作为最终结果。但是，对接过程面临着打分函数不够准确、构象搜索空间巨大导致计算耗时过长等挑战。比如，对于后者，文献[1]计算结果表明：对于单个配体复合物的盲对接任务而言，借助GNINA和Glide这两款传统的对接软件，生成百万量级的复合物构象并从中挑选最优者，平均耗时分别约为150 s和1500 s。在巨型分子库的(如ZINC 15数据库，含有约数十亿个化合物分子[2])虚拟筛选过程中，使用传统方法逐一对接每个分子在计算速度上是不可接受的。而数据驱动的机器学习方法为优化各个子任务的准确性和计算效率带来希望。此外，同样基于机器学习方法，部分研究者发展出“端到端”的、更为直接的对接流程：训练一个拟合自由能面(free energy landscape)的模型，无需将原有的对接任务划分为多个子任务，以蛋白质与配体的三维结构为输入，输出即为可能的复合物构象。参照Anfinsen提出的蛋白质折叠热力学假说，可以设想：如果存在一个能量函数，能够将复合物在三维空间下的所有状态映射到它对应的自由能，那么可以将复合物构象预测问题转化为该能量函数的最优化问题[3]。这是机器学习拟合自由能面的出发点。与传统的对接方法相比，这样的方法也同样可能在准确性和计算效率等指标上得到提升。本文将针对口袋搜索、构象生成、打分函数、自由能面建模这四个方向：整理相应的评价体系，包括常用的评价指标或测试集 挑选并简要介绍部分具有代表性的机器学习模型 结合模型评估实验讨论当前模型或评价体系存在的不足以及未来可能的发展方向。1.机器学习口袋搜索 1.1 评价体系目前存在两种描述蛋白质-配体结合口袋的方式。其中一种方法借助蛋白质表面的点云(surface points)来描述。这种方法被称作以配体为中心(ligand-centric)的方法。另一种方法则借助蛋白质上的原子来描述，那些蛋白质上的、与配体重原子距离小于一定阈值的重原子被定义为配体结合原子。这种方法被称作以蛋白质为中心(protein-centric)的方法。这两种描述方法相应地衍生出两类评价指标。对于前者，通常以配体原子中心距(预测的口袋中心与配体任意原子的距离，distance between the center of the predicted site to any atom of the ligand，DCA)、配体中心距(预测的口袋中心与配体中心的距离，distance between the center of the predicted site to the center of the ligand，DCC)、体素交并比(预测的口袋体积与配体所占据的空间体积的交并比，discretized volume overlap，DVO)等指标来衡量[4][5]。直观上，在这三个指标中：DCA最为宽松(只需大致判断配体位置)，DCC更为严格(额外考察了配体大小)，DVO最为严格(额外考察了配体构象)。但在多数文献中，常使用DCA和DCC这两个指标，并以4 Å作为预测成功与否的阈值[4]。对于后者，Yan等人以原子水平的交并比(Intersection over Union)来衡量[6]。具体地，计算预测的配体结合原子与标注的配体结合原子的交集与并集的比值。这也是机器学习目标检测任务中的常用指标。1.2 模型方法目前发展的大多数口袋搜索算法，都是以搜索蛋白质表面点云为目标。例如Krivák等人于2015年提出的P2Rank[7]：刻画蛋白质Connolly点云中各个点的物化特征，并使用随机森林模型对每个点进行可靶性预测，最后对点聚类得到口袋预测结果。以DCA为评价标准，P2Rank在多个数据集上表现优于传统方法Fpocket。Krivák等人后续还提供了P2Rank的网络服务[8]，并对多种方法口袋搜索方法进行了更加全面的总结和比较，其中包括Jiménez等人于2017年开发的、使用3D网格(体素)刻画结合位点的DeepSite[9]。值得一提的是，在Krivák等人的结果中(测试数据集为COACH420、HOLO4K，评价指标DCC)，DeepSite表现不及Fpocket 而在Jiménez等人的结果中(测试数据集CHEN251，评价指标DCC、DVO)，DeepSite表现显著优于Fpocket。最近，Yan等人另辟蹊径，以鉴定蛋白质上的配体结合原子为目标，发表了PointSite方法[6]，并声称其在多个数据集上(包括COACH420、HOLO4K、CHEN251等等，以原子水平的交并比为评价指标)取得了SOTA。Yan等人将口袋搜索问题转化为计算机视觉领域的点云分割问题 此处的点以蛋白质上的原子表示，以充分挖掘原子之间的键连特征。此外，作者还指出：将PointSite方法引入到其它口袋搜索方法如FPocket、P2Rank中(具体而言，使用点云分割的结果对后者的预测结果进行过滤)，可以进一步提升配体结合位点的鉴定效果。1.3 讨论从以上几种方法的评估实验中可看出，模型在不同测试数据集上的相对表现可能存在差异，因此需要建立一套统一的、合适的数据集进行测试。另外，在训练数据集的准备过程中，将未鉴定到配体结合的位点直接划分为负样本也值得考量。2.2在具体使用建议上，最近有研究将口袋搜索方法引入到完整的对接流程中[10][11]，相较于FPocket、P2Rank等方法，PointSite表现最优。　　2. 机器学习构象生成 2.1 评价指标对于构象生成模型而言，需要考察所生成构象的多样性和准确性，由此分别衍生出两类指标：覆盖率(COV，coverage)和匹配程度(MAT，matching metrics)。针对测试集中的每一个构象：查看是否能够在生成的构象集合里找到RMSD值小于给定阈值的构象(如果能，则表示该模型能够覆盖当前测试构象)，可以计算得到覆盖率 计算生成的构象集合与当前测试构象的最小RMSD值，取平均可以得到匹配程度的值。以上是从测试集的角度衡量模型表现(召回率) 相应地，将测试集构象与生成集构象在计算中对调，则可判断模型的准确率。目前常见的测试数据集包括GEOM-QM9和GEOM-Drugs[12]。2.2 模型方法构象生成模型沿着两个思路发展：直接生成各个原子的3D坐标 先生成原子对距离、二面角等中间参数，再将分子3D坐标还原。对于前者，技术难点在于保证模型对于输入分子的旋转-平移不变性(整体改变分子坐标，得到的构象是相同的，也即对齐过程)。对于后者，则可能生成不合法的中间参数(比如违反三角几何关系)，或者中间参数的误差在训练过程中不断累积，影响分子3D坐标重构，需要进行后续的力场优化 但这是目前大多数方法所选取的道路。此处简要介绍最近发展的GeoDiff模型[13]和DMCG模型(Direct Molecular Conformation Generation)[14]。Xu等人于2022年提出GeoDiff，使用扩散模型直接生成原子坐标。GeoDiff在GEOM-Drugs数据集上测试集覆盖率可达约89%、匹配程度约0.86 Å，并且经过力场优化之后可以进一步提升模型表现。作者指出：在逆向扩散过程中(生成过程)，如果某一时刻T的密度函数具有旋转-平移不变性，且逆向生成的条件概率函数具有旋转-平移不变性，则T时刻以前任意时刻的密度函数也具有旋转-平移不变性。同年， Zhu等人提出基于变分自编码器的DMCG模型，在GEOM-QM9和GEOM-Drugs数据集上均取得最优(对于后者，覆盖率约96%，匹配程度约0.70 Å)。作者指出：模型除了满足旋转-平移不变性外，对于对称结构还应当满足置换不变性(交换对称原子的坐标，得到的构象是相同的)。为此，计算任意旋转-平移操作以及对称原子置换操作下的两个结构的距离最小值，并将其引入损失函数中，以满足以上两种不变性。消融实验表明，如果不考虑这一项损失，则覆盖率将下降约20个百分点，匹配程度将提高约0.3 Å。2.3 讨论今年3月，Zhou等人[15]基于RDKit设计了一种简单的生成算法：使用RDKit分别采样二面角、采样几何片段、采样能量并生成相应的构象，随后按照能量大小进行聚类。在GEOM-QM9和GEOM-Drugs两个数据集上，与GeoDiff、DMCG等深度学习方法相比，该算法几乎在所有指标上取得SOTA。作者认为，目前的测试基准不足以覆盖实际应用中(如分子对接中)涉及的构象生成任务。　　事实上，生成足够的分子构象不会降低测试构象集上的匹配程度和覆盖率(召回率)，但可能降低生成构象集的相应指标(查准率)。而Zhou等人(包括Zhu等人的DMCG)并未在文中给出关于后者的模型评价，因此模型的实用性仍有待考察。另外，目前的构象生成方法均以单个配体的势能极小值作为优化目标，针对(已知口袋的)复合物中配体的构象生成模型仍有待开发。最后，GeoDiff模型与DMCG模型的发展也启示我们挖掘任务目标中蕴含的性质(对称性、不变性)，在模型训练中引入合适的归纳偏置。　　3. 机器学习打分函数3.1 评价指标Su等人[16]于2019年建立了一套打分函数的基准测试数据集CASF-2016。CASF-2016及其前身CASF-2013已被广泛用于评估打分函数的表现。同时，Su等人设计了四类指标分别考察打分函数的打分能力、排名能力、对接能力和筛选能力。打分能力通常以Pearson相关系数来衡量：考察天然蛋白复合物的计算打分值与实验结合常数的对数之间的线性相关性。排名能力通常以Spearman等级相关系数或Kendall等级相关系数来衡量：对于同一蛋白、不同配体的多个天然蛋白复合物结构，考察计算打分值给出的排名与实验结合常数给出的排名之间的匹配程度。对接能力以对接成功率衡量：对于单个复合物，在天然配体结合构象和一系列计算生成的诱饵分子构象(decoy)中，若计算打分最高者与真实结合构象的RMSD小于2 Å，则认为对接成功 对于多个复合物，进一步计算对接成功率。筛选能力以筛选成功率衡量：在天然配体和一系列其它配体分子中，计算打分前1%(5%、10%)结果里包含天然配体的比例。由此可见，打分能力直接以实验数据作为参考，是评估打分函数是否可靠的基本测试。排名能力是对打分能力的补充。打分能力越好，排名能力通常也越好 反之则未必成立(存在对实验结合常数进行非线性拟合的打分函数)。对接能力测试将计算生成的构象引入测试集中，因此更贴近实际对接操作、对于打分函数的选择更具参考意义。需要指出的是，对接能力测试给出的结果通常只能代表该打分函数的对接能力上限，在CASF-2016的测试中可能呈现分数虚高的情形(在测试中能够以90%的成功率在top-1中挑选出天然配体构象，但在实际应用中却不能达到这一表现)。这主要归结于实际应用中计算生成的构象不够充分。筛选能力涉及多种配体的对接，因此可视为对排名能力和对接能力的综合考察。3.2 模型方法针对打分函数的机器学习方法，前人已给出详尽的综述[17][18][19]。本文将展开介绍经典的ΔVinaRF20打分函数[20]，以及最近发展的DeepDock[21]和RTMScore[22]。ΔVinaRF20由Wang等人于2016年提出，在CASF-2013、CASF-2016测试集上的各指标中均排名靠前[16][20]。具体地，在CASF-2016测试集上，ΔVinaRF20在打分能力和排名能力两个指标上分别以0.82和0.75取得最优，在对接能力上以89.1%(top1)仅次于Autodock Vina(90.2%)，在正向筛选能力以42.1%(top1)取得最优、逆向筛选能力以15.1%(top1)位居第五(次于最优方法ChemPLP@GOLD约2.4%)。Wang等人指出：机器学习打分函数与经典的打分函数在这些指标中各有所长，前者长于打分，后者长于对接和筛选。因此作者拟结合二者优点：一方面对训练集进行数据增强，将计算生成的诱饵结构引入训练集中(同时计算估计亲和力作为标签)，以提高机器学习打分函数的对接和筛选能力 另一方面使用随机森林方法对AutoDock Vina中的打分函数进行参数化修正(使用Δ-machine learning方法，类似残差拟合)。Méndez-Lucio等人于2021年提出的DeepDock方法在CASF-2016的正向筛选和逆向筛选能力评估中分别以43.9%和23.9%取得SOTA，但DeepDock给出的打分值与实验结合常数的对数之间不存在相关性(在训练过程中未引入实验结合常数的相关信息)。DeepDock方法使用二维分子图刻画配体、多面体网格点刻画蛋白质口袋(参考了MaSIF的编码框架[23])，分别学习蛋白质口袋与配体原子的节点表示 随后两两组合配体和靶蛋白的节点形成节点对，使用混合密度函数拟合节点对的距离分布(概率密度函数)。作者指出：相较于通过最小化距离误差来学习节点对距离的平均值，混合密度函数能够学习训练集中节点对多个可能的距离，从而更好地刻画构象预测任务中的多值特性。在DeepDock的基础上，Shen等人从两方面进行改进得到RTMScore：一方面，使用无向图编码蛋白质口袋残基，在编码过程中满足对于输入复合物坐标的旋转不变性 另一方面使用Graph Transformer模型以学习更深层次的特征。作者声称RTMScore在CASF-2016测试集上的对接能力和筛选能力达到SOTA，相较DeepDock得到大幅提升：对接成功率达到98.6%，正向筛选成功率达73.7%，逆向筛选成功率达38.9%。3.3 讨论DeepDock等方法的发展展现了图模型在捕获蛋白质-配体互作的潜力，以及直接拟合蛋白残基-配体原子距离似然函数的有效性。事实上，距离似然函数不仅能作为打分函数评估当前构象，还能够作为某种“势能面曲线”指导构象优化。此外，这些新近提出的DeepDock等方法有待更广泛的测试验证。在其它论文的评估实验中[24]，RTMScore在对接能力中依旧表现最优。但考虑到缺少打分能力、排名能力等测试数据，后续仍需要更多的测试评估(尤其是将打分函数整合到完整的对接流程中)以验证这些方法的可靠性。　　4. 机器学习自由能面4.1 评价体系拟合自由能面的模型直接处理盲对接任务，生成复合物构象。其中存在两类评价指标。一类指标评估计算准确性。通常以预测复合物(如果模型给出多个可能的构象，则选取打分值top-1者)中配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例来衡量模型对接能力。一般以2 Å作为对接成功与否的判断阈值[10]。还有通过配体质心距离小于2 Å(或5 Å)所占的比例来考察模型是否能够找到正确的结合口袋。此外，为判断生成的配体构象在化学上是否合理，Corso等人额外考察了配体构象中存在位阻冲突(steric clash，配体内部重原子之间的距离是否小于0.4 Å)的比例。另一类指标评估计算效率 这在大型分子数据库的虚拟筛选过程中同样不可忽视。以对接一个分子所需的平均CPU(如果可能，使用并行加速)或GPU时间来衡量。4.2 模型方法拟合蛋白质-配体自由能面的机器学习方法最近得到逐步发展，代表性的方法包括EquiBind[1]、TANKBind[25]、DiffDock[10]。Stärk等人于2022年提出基于图几何深度学习的EquiBind方法，在机器学习方法直接预测蛋白质-配体结合构象这一问题中做出开创性贡献。该方法以随机的配体分子构象(比如使用RDKit生成的构象)作为输入，无需经过大规模的构象采样即可在约0.1 s的时间内给出复合物结构。由此给出的结构在寻找结合口袋的能力上与传统方法(如QuickVina-W)相当(配体质心距小于2 Å的比例均约40%)，但在配体结合构象的预测上却表现不佳(配体RMSD小于2 Å的比例约6%，不及QuickVina、GLIDE等方法所达到的约20%)。虽然可以在该结构的基础上结合传统方法进一步微调配体位置和构象，但将增加预测所需的时间成本至数十秒或数百秒。同年，Lu等人提出TANKBind。相较于EquiBind，在保留推理速度(约0.5秒)的同时，TANKBind在配体构象预测上取得和传统方法相当的结果(配体RMSD小于2 Å的比例约19%)，口袋预测能力则获得较大提升(配体质心距小于2 Å的比例约56%)。不同于EquiBind对整个蛋白质进行编码的方法，TANKBind采用P2Rank寻找口袋位置，随后针对该位置的蛋白质区块(由半径20 Å内的残基构成)，拟合蛋白质残基与配体原子的距离。此外，受AlphaFold2的启发，TANKBind将三角几何约束引入残基与配体原子的距离建模中。消融实验表明，三角几何约束可以显著提升模型表现：配体RMSD小于2 Å的比例提升约15%，配体质心距小于2 Å的比例提升约12%。同年十月， Corso、Stärk等人提出DiffDock模型。该模型在对接准确性上首次实现了对传统对接模型的大幅超越。在holo态的蛋白晶体对接结果中，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例可达到38.2%，约为传统方法的两倍。这一结果对应于40次采样，消耗计算时间约40秒。与DeepDock想法类似，DiffDock使用生成模型来学习构象的概率分布并建立了一套相应的“扩散”方法(构象采样方法)。4.3 讨论今年2月，Yu等人[11]重新设计实验，考察了DiffDock等机器学习模型在盲对接任务中的哪一阶段领先传统方法、领先到何种程度。作者将盲对接任务拆分为口袋搜索和局部对接两个子任务，设计了三组实验：完全使用DiffDock等模型完成盲对接 使用其它方法搜索口袋(如前文所述的PointSite、P2Rank)，使用Uni-dock[26](一种基于AutoDock Vina 1.2的GPU加速对接方法)局部对接 使用DiffDock搜索口袋，使用Uni-dock局部对接。结果表明：DiffDock方法在口袋搜索中效果更佳(相较于PointSite等方法而言，引入了配体分子的结构信息)，但与ground truth、即表中的GT pocket相比仍存在提升空间 口袋确定，传统对接手段得到的结果优于DiffDock等机器学习模型。作者进一步指出：给定口袋下预测蛋白质-配体构象的机器学习方法是后续发展的方向(正如机器学习构象生成中所讨论的) 对于端到端的模型比较实验中，需要更审慎地评估传统方法的表现。另外，随着蛋白质结构预测方法的发展，评估模型在apo态蛋白质上的对接表现是有必要的，也是更符合实际情形的。事实上，目前几种模型所使用的训练集均为holo态蛋白(缺乏足够数量的与holo态对应的apo态蛋白结构)。为泛化模型的对接能力至apo态蛋白结构，通常采取折中方案：假定apo态与holo态的主链变动不大，而在模型编码过程中只使用主链碳原子的信息。DiffDock论文中首次评估了各种方法在ESMFold给出的蛋白质结构上的对接能力。结果显示，各模型的对接表现均显著下降(对于DiffDock而言，配体重原子RMSD小于2 Å所占的比例从38.2%下降至20.3%)。机器学习方法建模对接过程中蛋白质的结构变化仍然道阻且长。将分子动力学模拟过程中产生的动态信息引入模型中也许是一种可能的突破方向[27]。最后，正如AlphaFold2可作为打分函数评估蛋白质结构是否合理[3]，DiffDock等拟合自由能面的模型，其在打分函数的各项评价指标中表现如何也值得进一步探究。　　参考文献　　[1] Equibind: Geometric deep learning for drug binding structure prediction　　[2] Artificial intelligence–enabled virtual screening of ultra-large chemical libraries with deep docking　　[3] State-of-the-Art Estimation of Protein Model Accuracy Using AlphaFold　　[4] A Critical Comparative Assessment of Predictions of Protein-Binding Sites for Biologically Relevant Organic Compounds　　[5] Improving detection of protein-ligand binding sites with 3D segmentation　　[6] PointSite: A Point Cloud Segmentation Tool for Identification of Protein Ligand Binding Atoms　　[7] P2RANK: Knowledge-Based Ligand Binding Site Prediction Using Aggregated Local Features　　[8] P2Rank: machine learning based tool for rapid and accurate prediction of ligand binding sites from protein structure　　[9] DeepSite: protein-binding site predictor using 3D-convolutional neural networks　　[10] DiffDock: Diffusion Steps, Twists, and Turns for Molecular Docking　　[11] Do Deep Learning Models Really Outperform Traditional Approaches in Molecular Docking?　　[12] GEOM, energy-annotated molecular conformations for property prediction and molecular generation　　[13] GeoDiff: a Geometric Diffusion Model for Molecular Conformation Generation　　[14] Direct Molecular Conformation Generation　　[15] Do Deep Learning Methods Really Perform Better in Molecular Conformation Generation?　　[16] Comparative Assessment of Scoring Functions: The CASF-2016 Update　　[17] Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking　　[18] Protein–Ligand Docking in the Machine-Learning Era　　[19] From machine learning to deep learning: Advances in scoring functions for protein–ligand docking　　[20] Improving scoring-docking-screening powers of protein–ligand scoring functions using random forest　　[21] A geometric deep learning approach to predict binding conformations of bioactive molecules　　[22] Boosting Protein–Ligand Binding Pose Prediction and Virtual Screening Based on Residue–Atom Distance Likelihood Potential and Graph Transformer　　[23] Deciphering interaction fingerprints from protein molecular surfaces using geometric deep learning　　[24]: A fully differentiable ligand pose optimization framework guided by deep learning and a traditional scoring function　　[25] TANKBind: Trigonometry-Aware Neural NetworKs for Drug-Protein Binding Structure Prediction　　[26] Uni-Dock: GPU-Accelerated Docking Enables Ultralarge Virtual Screening　　[27] Pre-Training of Equivariant Graph Matching Networks with Conformation Flexibility for Drug Binding　　本文作者：ZF责任编辑：WFZ

01研究背景膜蛋白生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点，而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点：1. 膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术，去垢剂会增加背景信号，或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。2. 膜蛋白结构复杂，且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时，膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程，或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。3. 膜蛋白的表达量低、纯化难，因此需要消耗量少的方法进行检测。本期文献解读，讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。02研究内容2024年3月15日，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构，为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析，推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点，并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。Rv3806c为膜蛋白，并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行Kd检测，每次实验均进行了5次重复。MST进行一次亲和力检测时，仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c，大大节约蛋白消耗量。此外，MST技术是在溶液条件下进行，无需固定，且兼容去垢剂，使膜蛋白能保持正确的构象，甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测，从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。图示：MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力此外，研究发现，供体底物PRPP通过一个Mg2+结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg2+对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用，作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg2+时，Rv3806c与底物PRPP的结合。NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构，无需加入外源荧光染料，兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验，结果显示Mg2+对于PRPP的结合至关重要。图示：MST分析在Mg2+存在或不存在的情况下，PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg2+的情况下，结合亲和力急剧下降，而在金属螯合剂EDTA的存在下，没有检测到结合。图示：在Mg2+、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下，纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg2+存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。03技术优势在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基，以及Mg2+在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器无需固定样品，且不限制缓冲条件，蛋白用量少，可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，无需外源荧光染料，兼容去垢剂，低浓度也可轻松表征，在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。-Monolith分子互作检测仪--PR Panta蛋白稳定性分析仪-

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

21世纪，全球各个国家都处在一个经济、信息、科技多方面高速发展的时期。经济的发展提高了绝大多数人们的生活水平，信息科技的大爆炸拓展了人们的视野和见识，科技的进步为人类的持续发展和安全提供源动力。然而，事物通常都具有两面性，给我们带来便捷和效益的同时，也将衍生诸多问题。食品安全问题愈发严峻，便是当今经济、信息、科技发展的副产物。食品企业追求经济利益最大化时，往往利用一些不法的伪科学手段来降低企业生产成本，损害人们的身心健康安全。层出不穷的食品安全事件，尤其在乳制品行业年年都接连不断地爆发，如同挥之不去的梦魇，在这个信息大爆炸的时代，迅速传播，不断地刺痛着人们越来越越敏感脆弱的神经。 日前，香港商业调查机构CER公司公布报告称，某洋品牌配方奶粉远未达到国际标准甚至是中国所能接受的最低标准，被指最差洋奶粉。质量最差门主要是该品牌1段婴幼儿配方奶粉，乳清蛋白和酪蛋白比例不合格。说明称，乳清蛋白中含有高浓度、比例恰当的必需氨基酸，还含有为新生儿必需的半胱氨酸。乳清蛋白还含有包括免疫球蛋白和双歧因子等免疫因子。对于宝宝而言，乳清蛋白是一种优质蛋白，因为它容易被消化，蛋白质的生物利用度高，从而有效减轻肾脏负担。酪蛋白中含有丰富的必需氨基酸，还含有婴儿特别需求的蛋氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸。酪蛋白中结合了重要的矿物元素，如钙、磷、铁、锌等。但是，酪蛋白是一种大型、坚硬、致密、极困难消化分解的凝乳。过量的酪蛋白会产生较高的肾溶质负荷，给宝宝肾脏带来较重的负担，对宝宝是不安全的。 乳清蛋白和酪蛋白各有好处，但合适的比例还是应该以母乳作为黄金标准。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例为60 : 40(而普通牛奶中乳清蛋白和酪蛋白的比例为18 : 82)。而此次被检测出的该品牌奶粉，乳清蛋白和酪蛋白的比列为41 : 59。国际食品法典委员会（CAC）在&ldquo 婴儿配方食品及特殊医学用途婴儿配方食品&rdquo 标准中，没有对产品中乳清蛋白的比例提出要求，而推荐以必需和半必需氨基酸的含量是否接近母乳作为婴儿配方食品中蛋白质质量的判定依据。其他国家和地区（包括美国、欧盟和澳大利亚、新西兰等）均未规定乳清蛋白在蛋白质中所占比例。我国国家标准GB10765－2010《婴儿配方食品》中，要求&ldquo 乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量应&ge 60%&rdquo ，即以乳或乳蛋白制品为主要原料的婴儿配方食品中，乳清蛋白所占总蛋白质的比例应大于等于60%。该要求主要是参考了母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例，沿用了我国GB10766－1997《婴儿配方乳粉ⅡⅢ》中关于乳清蛋白比例的相关规定。 各种品牌的婴儿奶粉都在宣称"接近母乳"，其中乳清蛋白和酪蛋白的比例是一个重要的指标，因为它能提供最接近母乳的氨基酸组合，更好地满足宝宝的成长需要。实际上，牛奶中酪蛋白含量的测定对于乳制品和奶酪制品生产商也都具有重大的经济意义。厂商通过测定酪蛋白含量，可以精确预测利用牛奶生产奶酪的产量。目前，市场上已经有一种快速测定乳清蛋白和酪蛋白比例的方法，是由美国CEM公司提出，在一些实验室应用推广。原理上是利用快速真蛋白测定仪，测得总蛋白含量后，沉淀及过滤酪蛋白，再测量乳清蛋白含量，能够快速精确得出酪蛋白含量，从而确定乳清蛋白和酪蛋白比例。整个过程仅需约15分钟,精确度和重复性相比其它凯氏定氮法和凝胶色谱法等更高，且没有污染性、腐蚀性试剂。这种高效而环保的方法值得推广，使用。 美国 CEM SPRINT 真蛋白质测试仪更多详情，请联系培安公司：电话：北京：010-65528800 上海：021-51086600 成都：028-85127107 广州：020-89609288Email: sales@pynnco.com 网站：www.pynnco.com

来自德国及美国等处的研究人员针对基因组特别大，难以进行全基因组测序的动物，提出了以转录组测序与蛋白质组分析联合以解析功能基因的策略，并以蝾螈进行实验，开辟了组织及器官再生研究的新思路。该研究成果已发表近期的《Genome Biology》杂志上。 蝾螈是一种在侏罗纪中期演化的有尾两栖动物，目前存活的约有400种。红色斑点蝾螈虽然小，但其组织工程学技艺却令人惊叹。蝾螈在失去了组织，包括心肌、中枢神经系统元件甚至眼睛的晶状体后仍能再生。一般来讲，动物的再生组织的能力是所有多细胞动物所共有的古老程序，因此，医生们一直希望蝾螈的这种能力依赖于基础遗传学程序，而该程序潜伏在包括哺乳动物在内的所有动物中，这样他们就可以在再生医学中利用蝾螈的再生机制。 然而蝾螈的基因组十分庞大，比人类基因组大十倍，要从头获得蝾螈的全基因组序列不容易。因此研究者们将目光转向基因表达所产生的RNA，他们利用454新一代测序技术对蝾螈的转录组进行了研究。经过从头组装N. viridescens的转录组，获得了超过120,000个RNA转录本，约有15,000个转录本编码蛋白质，其中有826个转录本是蝾螈所特有的。这些转录本中包含了不同器官所有再生阶段的转录本，这些转录本中的一部分与其它生物相似。通过对蝾螈胚胎和幼体的心脏、四肢、眼睛、尾、肝脏、脾脏等组织中再生过程表达的蛋白的分离以及质谱分析方法，对这些蛋白进行分类及与转录本的比对。 通过454新一代测序结果与质谱技术的结合，发现了500多个其它生物中从未被发现的肽段，接下来会进一步探索这些蛋白是否与再生能力相关。这项研究不仅为目前科学家们提供了两栖类动物的基因数据，更为基因组测序困难的动物研究，提出了一种新思路。 参考文献：Genome Biol. 2013 Feb 20 14(2):R16. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.Looso M, Preussner J, Sousounis K, Bruckskotten M, Michel CS, Lignelli E, Reinhardt R, Hoeffner S, Krueger M, Tsonis PA, Borchardt T, Braun T.

大家好，本周为大家介绍一篇发表在Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A上的文章，HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding1，文章作者是华盛顿大学的Tobin R. Sosnick。　　TonB-依赖的转运体(TBDTs)广泛存在与革兰氏阴性菌的外膜上，通过其摄取营养。但TBDTs转运时的机制尚不明确，尤其是可供底物通过的跨膜β-桶孔径打开时的结构变化机理。BtuB是一种典型的大肠杆菌TBDT，其功能和生物物理环境都得到了广泛的研究。目前推测BtuB在行使转运功能时，其通道孔径形成需要BtuB与底物维生素B12结合，其N-端7个残基(称为“Ton box”)产生较大的构象转变，从β-桶中甩出进入胞质并与下游蛋白TonB发生相互作用。但孔径形成的过程具体机理存在两个具有争议的猜想：力依赖模型认为，TonB通过将BtuB从β-桶拽出到胞质，并从膜内侧将能量传递给BtuB，这些力可能重塑塞区并导致孔径形成 而非力依赖模型则认为孔径的形成跟BtuB自身保守的Ionic Lock(IL，即R14和D316间的盐桥)相互作用有关，当B12存在时只需要IL解锁TonB就能与BtuB结合产生成孔运动。晶体学研究捕捉到了Apo BtuB、BtuB:B12和BtuB:B12:TonBCTD的结构(图1)，但晶体学研究一来存在晶体堆积导致其结构与溶液态蛋白结构产生一定差异的问题，二来静态的结构“截图”无法提供动态变化过程信息。因此，本文选择氢氘交换质谱法(HDX-MS)解析BtuB和配体结合时产生结构动态变化过程，以深入推测该过程的具体机制。　　图1. BtuB腔体结构域与两个配体结合事件的构象响应模型。　　该实验共设有4组，包括：Apo BtuB、BtuB + B12、BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB。作者对BtuB + B12的HDX速率及保护因子(PF)进行了分析(图2)：其中，N-端2-29残基(包括Ton box在内及IL中的R14)、pre-SB3区域属于快速氘代区域，SB1、SB2、SB3属于中速氘代区，其他区域属于慢速氘代区。　　图2. HDX速率分区并映射至结构。　　随后作者分析了Apo BtuB、BtuB + B12的HDX-MS实验数据(图3)。其中IL区域及其相连的Fisrt Strand区域的HDX变化情况最为显著(氘代上升)，从氘代动力学图中我们可以看到添加B12后该区域的氘代速率从较慢的水平转变为较快的水平，这说明B12的结合足以使得IL区域发生较大的构象变化，该现象呼应了TonB从较为紧凑的结构转变为较为动态/溶剂可及性高的结构。除此之外，N-端前5个残基区域经历了轻微的氘代上升 底物结合区SB1、SB2和SB3经历了一定程度的氘代下降，而SB3的前端经历了一定的氘代上升。　　图3. BtuB + B12和Apo BtuB的HDX比较。　　接着作者也考察了BtuB + TonB和BtuB + B12 + TonB的HDX-MS结果(图4)。结果发现，只加TonB时BtuB的IL区域并未发生较大的HDX变化，而同时添加B12和TonB的BtuB IL区产生了明显的氘代变化，这些现象进一步证实了BtuB的Ton box发生结构改变是B12结合后IL解锁产生的效应。这些实验结果支持非力依赖型假说机制，即B12结合后通过別构效应使得IL处的盐桥打破，使得Ton box区被释放至胞质中，进一步跟下游蛋白结合从而打开通道孔径。　　图4. 不同组别的IL区域的HDX氘代动力学图。　　本文通过HDX-MS实验解决了大肠杆菌离子通道家族中一蛋白BtuB配体相关的动态调控机制，通过实验的方法验证了非力依赖机制假说。本文选取的体系及蛋白样品较为巧妙，实验设计合理，实验证据充分，行文逻辑严密，为离子通道的动态调控机制提供了见解，是HDX-MS方法优势的典型体现。　　撰稿：罗宇翔　　编辑：李惠琳　　原文：HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain’s allostery and unfolding upon B12 and TonB binding　　李惠琳课题组网址：https://www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Zmyslowski, A. M. Baxa, M. C. Gagnon, I. A. Sosnick, T. R., HDX-MS performed on BtuB in E. coli outer membranes delineates the luminal domain's allostery and unfolding upon B12 and TonB binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2022, 119 (20).

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

摘要* 布鲁克使用 AmberGen 的 HiPLEX-IHC 肽编码抗体探针，结合全覆盖脂质组学、糖组学和代谢组学成像技术，为 timsTOF fleX 推出新型 MALDI HiPLEX-IHC 组织成像解决方案。* 新的 Canopy CellScape™ 单细胞、高度定量的空间蛋白质组学 ChipCytometry™ 平台具有全自动迭代染色功能，使用开源抗体对 TME 和转移研究的整个组织切片进行几乎无限的免疫肿瘤标记分析。* 对于癌细胞系和生物活检样本的蛋白质组学研究，在 timsTOF 4D 平台上采用 dia-PASEF 可以鉴定高达 13,000 种蛋白质（控制1% FDR）；采用库检索方式，在 35 分钟内可鉴定和定量 8000 多种蛋白质；使用新的 TIMScore 算法磷酸化肽段鉴定增加了 25% 以上。* 新型 timsTOF SCP 平台支持无偏单细胞蛋白质组学研究，是空间生物学癌症研究中 sc-RNA-seq 的重要补充。* 独特的高通量 timsTOF Pro 2 平台可以使液体活检生物标记物研究能够通过各种无偏的深层血浆蛋白质组学和 PTM 方法进行。2022年4月11日美国路易斯安那州新奥尔良——在2022年AACR年会上，布鲁克（纳斯达克股票代码：BRKR）推出并展示了针对空间多组学、单细胞蛋白质组学以及细胞系、组织和血浆蛋白质组学癌症的独特而新颖的研究。继最近对AmberGen公司的战略投资之后，布鲁克宣布建立合作伙伴关系，将Ambergen Miralys™ 肽标签抗体试剂盒应用于布鲁克timsTOF fleX新型MALDI HiPLEX-IHC工作流程，用于组织中的靶向蛋白质表达谱分析。通过将用于蛋白质识别的系列肽标签报告特征抗体探针与布鲁克灵活的MALDI成像工作流程相结合，研究人员可以在标准载玻片的组织切片中生成靶蛋白的高度多重图像。布鲁克timsTOF fleX平台将MALDI HiPLEX-IHC蛋白质图像与来自同一组织切片的小分子全谱成像（脂质、聚糖、代谢物、外源性物质）相结合，这是一种新颖独特的多组学分析能力，可用于新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片的癌细胞系、组织和肿瘤微环境（TME）成像研究。布鲁克生命科学质谱成像业务总监Michael L. Easterling博士评论说：“空间蛋白表达图谱可以阐明免疫肿瘤学以及TME和癌转移研究中的过程。基于AmberGen肽标签抗体组合的MALDI HiPLEX-IHC工作流程提供了靶向蛋白质定位，并增加了在同一组织切片上绘制重要脂质、聚糖和代谢物分子图像的能力。此外，布鲁克还展示了新的CellScape™ 高精度靶向空间蛋白质组学仪器，该仪器最近由Canopy生物科学部门推出。Canopy生物科学的CellScape是新一代的Chipcytometry™ 仪器，它能够以单细胞和亚细胞分辨率对多种样本类型中的蛋白质生物标记物进行高倍数空间成像和量化。CellScape进一步提高了空间分辨率，提供高达 8 倍的通量和无人值守自动化。CellScape在定量生物学方面是独特的，它具有 8 个量级的极高动态范围（HDR）成像，可以定量同一样本中的低表达和高表达蛋白质，解决了高复合物成像固有的一个关键挑战。在癌症生物学中的应用非常丰富，包括肿瘤微环境（TME）中各种肿瘤和免疫细胞类型的空间表型。Canopy还推出了用于芯片细胞仪平台的空间免疫分析试剂盒。空间免疫谱 试剂盒是一种用于FFPE组织的定量、多重检测，旨在为芯片细胞研究人员（例如免疫肿瘤学）提供即用型预验证抗体试剂。这些试剂盒使研究人员能够跳过检测开发，直接进行转化和临床研究检测。

本文由中国药科大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室所作，发表于Bioanalysis (2015) 7(7), 885–894。 目的：建立生物样品中治疗性肽的定量分析方法。材料与方法:以奥曲肽为模型治疗肽，合成氧化奥曲肽作为内标。采用蛋白沉淀结合液-液萃取技术，有效提高了回收率，减少了内源性干扰。根据FDA指南，对血浆中奥曲肽的LC-MS/MS定量方法进行了优化和验证。结果:线性、选择性、准确度、精密度、稳定性、基质效应和回收率均符合FDA指南生物分析方法验证验收标准。该方法已成功地应用于奥曲肽的研究。结论:该方法可用于奥曲肽和其他治疗性肽的药代动力学研究。 图 大鼠血浆中一种奥曲肽样品制备过程 图 奥曲肽和氧化奥曲肽的代表性质谱图。(A)乙腈蛋白沉淀法制备的空白血浆 (B)蛋白沉淀结合液液萃取法制备的空白血浆 (C)加入奥曲肽(50.0 ng/ml)和内标的空白血浆 (D) 加入奥曲肽(0.5 ng/ml)和内标的空白血浆 (E)大鼠静脉注射奥曲肽0.1 mg/kg后2h采集血浆。AQT: 奥曲肽 C-A: 氧化奥曲肽图 大鼠血浆中奥曲肽的校准曲线，浓度范围为0.5-500.0ng/ml表 大鼠奥曲肽静脉注射0.1 mg/kg和灌胃45 mg/kg后的主要药代动力学参数 在临床研究中，已经发表了几种用于奥曲肽定量的生物分析方法。然而，由于这些文献在样品处理技术、内标选择和检测方式等方面的差异，很难选择一种稳定的检测方法。此外，就我们所知，对奥曲肽的临床前药代动力学特征知之甚少。 • 开发的以氧化奥曲肽为内标的大鼠血浆中奥曲肽的LC-MS/MS定量方法已根据美国指南进行了充分验证。• 线性、准确度、精密度、基质效应和回收率符合FDA指南中的生物分析方法验证验收标准。• 所建立的LC-MS/MS方法在大鼠血浆中表现出优异的性能。• 上述方法已成功应用于奥曲肽的药代动力学研究。• 目前奥曲肽在大鼠体内的药代动力学研究将为奥曲肽的开发和合理使用提供有益的信息。• 目前开发的方法只需稍加修饰，可以用于其他治疗性肽类的药代动力学研究。 文献题目《PK study of octreotide based on LC-MS/MS combining protein precipitation and impurity extraction technique》 使用仪器岛津LCMS-8050 作者Qian Wang**,1, Yan Liang*,1,Tai Rao**,1, Lin Xie1. Wei Ye1, Hanxu Fu1, Liiun Zhou1,Rong Xing1,2, Yuhao Shao1,Jingcheng Xiao1, Dian Kang1&Guangji Wang11 Key Lab of Drug Metabolism&Pharmacokinetics, State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Tongjiaxiang 24, Nanjing 210009, China2 Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu, Anhui, 233004,China* Author for correspondenceTel.:+862583271128FaX:+862583302827liangyan0679 @hotmail. com**Authors contributed equally

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Journal of The American Chemical Society上的文章，A Chemical Proteomic Map of Heme−Protein Interactions1。该文章的通讯作者是美国斯克利普斯研究所的Christopher G. Parker研究员。高铁血红素（heme）是人体中许多蛋白质的辅助因子，也是血液中氧气的主要转运体。最近的研究也证实了高铁血红素可以作为一种信号分子，通过与伴侣蛋白质结合而不是通过其金属中心反应来发挥其作用。然而，目前关于血红素结合蛋白的注释还不够完整。因此，本文采用化学蛋白质组学的方法去揭示人体中与高铁血红素发生互作的蛋白质谱。化学蛋白质组学是揭示蛋白质功能和发现药物靶标的重要工具。其中，最常用的是基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling，ABPP），通过结合活性分子探针标记及串联质谱分析，实现对靶标蛋白的鉴定。如图1b，本文设计了一个“全功能”活性分子探针（HPAP），共包含3个部分：1. Hemin母核，用于与靶蛋白非共价结合；2.光活化基团-双吖丙啶，可在UV光照下生成卡宾，促使分子探针与蛋白发生共价交联；3. 炔基，可在铜催化下与含有叠氮的试剂（荧光标签，生物素）发生点击化学反应，后两者组成FF-control。具体实验流程如下图1a所示，用HPAP处理不同细胞（In Situ）或不同细胞来源的蛋白质组（In vitro），HPAP中的hemin母核可与靶蛋白发生非共价结合，经UV光照，HPAP-蛋白间形成共价交联，再利用点击化学可将HPAP-蛋白与荧光素（TAMRA）或者生物素标签相连，用于后续的荧光成像（In-gel fluorescence）或者链霉亲和素纯化、LC-MS鉴别定量（MS-based I.D. and quantitation）。 图1. (a)使用基于高铁血红素的光亲和探针(HPAP)识别血红素结合蛋白的流程示意图。(b) HPAP、hemin和FF-control的结构；(c) HEK293T裂解物中与HPAP结合的蛋白的荧光成像；(d) hemin加入对HPAP与蛋白结合的影响。作者首先使用了SDS-PAGE去评估了HPAP标记蛋白的能力。如图1c所示，随着HPAP浓度的提高，胶图上条带颜色也逐渐加深，说明HEK293T细胞裂解液中与HPAP结合的蛋白在逐渐增加。如图1d所示，在10 μM HPAP的条件下，逐渐加入hemin，可以看到胶图上条带颜色逐渐变浅，说明hemin与HPAP之间发生了竞争，HPAP模拟了hemin与蛋白的结合过程。随后，作者又使用已知的hemin结合蛋白来确认HPAP捕获目标蛋白的能力。如图2所示，这些已知蛋白被HPAP成功的标记上，但由于hemin的加入，条带的颜色在逐渐变浅（TAMRA）。Western blot的结果显示，蛋白的总量并无太大变化，但hemin的竞争结合，导致与HPAP结合的蛋白量在下降。以上实验均说明，HPAP具有较好的选择性标记能力，能够模拟hemin与靶蛋白的结合，并以共价交联的方式标记在蛋白上。 图2. 用已知的高铁血红素结合蛋白确认HPAP捕获目标蛋白的能力。验证了方法的可行性后，作者将HPAP与定量蛋白质组学结合用于绘制高铁血红素-蛋白质互作谱。考察了多种细胞系，包括：人胚胎肾细胞（HEK293T）、人慢性髓系白血病细胞（K562）以及人原代外周血单个核细胞（PBMCs）。每种细胞系设置了两种实验形式：1）特异性结合实验（Enrichment）：通过将HPAP识别出蛋白与FF-Control识别出的蛋白进行对比，排除非特异结合的干扰（图1b），如果同一蛋白通过HPAP富集到的量是FF-control富集到的量4倍以上，则认为该蛋白是HPAP特异性结合蛋白。2）竞争性结合实验(Competition)：观察HPAP富集的蛋白在hemin和HPAP同时存在时富集到的量的变化，变化大于3倍且具有显著性差异（p＜0.05)的蛋白被认为是HPAP与hemin竞争性结合的蛋白。最终确定的高铁血红素结合蛋白应满足以上两种实验的筛选标准(图3a)。如图3b-d所示，总共鉴定出378个的高铁血红素结合蛋白，其中214个来自HEK293T, 182个来自K562, 107个来自PBMC。尽管三种细胞类型之间的结合蛋白有一些重叠，但大多数靶点蛋白只存在于一种或两种细胞类型中(图3b)，这暗示血红素在不同细胞中可能发挥不同的功能。其中，19个靶点蛋白是在UniProt上已经注释为高铁血红素的结合蛋白，剩余都是未揭示的结合蛋白。这些结合蛋白按照功能可划分为：转运蛋白，转录因子，支架蛋白和酶（图3c），根据代谢通路又可进一步划分（图3d）。作者最后对几个新发现的结合蛋白进行了验证，并选择IRKA1进行进一步的作用机制研究。IRKA1在调节炎症信号通路中起着关键作用，IRAK1被IRAK4磷酸化，然后自磷酸化，产生NFkB介导的炎症反应。经实验确认（图4），hemin是IRKA1的一种变构活化配体，可增强其酶活性，促进IRAK1的自磷酸化。 图3. 基于蛋白质组学的HPAP-蛋白互作分析。 图4. Hemin对IRKA1的调节作用。总之，本文设计开发了一种基于高铁血红素的光亲和探针，它可以与化学蛋白质组工作流程结合，以识别不同蛋白质组中的高铁血红素结合蛋白。利用该方法也可拓展至其他分子配体靶标蛋白的识别。 撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions参考文献1. Homan, R. A., Jadhav, A. M., Conway, L. P., & Parker, C. G. (2022). A Chemical Proteomic Map of Heme-Protein Interactions. Journal of the American Chemical Society, 144(33), 15013–15019.

近日，中国科学院武汉物理与数学研究所研究员唐淳课题组利用基于973重大科学研究计划“蛋白质动态学研究的新技术新方法”建立的研究技术，协助华中农业大学教授殷平课题组首次解析了N6腺嘌呤甲基转移酶METTL3-METTL14蛋白复合体结构，该研究成果发表于《自然》杂志。　　该工作揭示了RNA N6腺嘌呤甲基化修饰过程中的结构基础，是表观遗传学领域的一项重大突破。唐淳、武汉物数所副研究员龚洲和博士后刘主参与该项目，利用课题组发展的新技术新方法，通过结合小角X光散射与计算机模拟的手段，为该蛋白复合体的结构解析提供了研究方法上的帮助。　　经过近3年的努力，唐淳课题组发展、建立了包括核磁共振波谱、小角X光散射、化学交联质谱分析、单分子荧光检测和成像等技术在内的多种生物物理化学手段，并开发相应的整合计算方法，用于蛋白质动态结构及其转换过程的研究。课题组除了完成自身的科研项目外，积极开展广泛的合作与交流，与国内外同行共享研究技术和方法。目前，得益于“蛋白质动态学研究的新技术新方法”项目的实施，课题组已助力多个重要蛋白质结构的解析，取得了一系列的研究成果，研究成果发表于《自然—化学生物学》、eLife 等国际一流杂志。

赛默飞与蛋白设施达成战略合作，助力蛋白质科学创新发展赛默飞色谱与质谱中国 // 近日，科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）携手中国科学院上海高等研究院国家蛋白质科学研究（上海）设施（以下简称：蛋白设施）在上海举办蛋白质动态分析联合实验室签约仪式。双方在蛋白质动态分析研究领域，及通过蛋白设施联合上海临床研究中心开展的临床应用等领域，基于良好的合作意向，同意共建实验室及建立战略合作伙伴关系，并在2024年上海市产业技术创新大会得到会议举办方及与会代表众多领导、专家和学者的见证。本次战略合作基于赛默飞全球领先的高分辨质谱、电镜等平台及蛋白组学解决方案基础上，结合了蛋白设施在蛋白组学领域领先的科研能力、研发成果和强大的技术团队。双方围绕蛋白组学解决方案合作、技术培训交流、人才培养等方面达成了共识，旨在整合双方优势资源，共同提升蛋白组学研究、临床样本队列研究和生物医药领域产业的发展，共创技术新生态，为科研的新质生产力注入活力。高分辨质谱+冷冻电镜打造蛋白质科学创新平台赛默飞高级副总裁、亚太和拉美地区总裁Mark Smedley先生，赛默飞分析仪器事业部中国区商务副总裁周晓斌先生，蛋白设施主任吴家睿教授等出席了本次签约座谈仪式。双方领导共同讨论了高分辨质谱结合冷冻电镜技术，电镜技术结合AI，以及高分辨质谱、电镜技术与Olink方案的整合在蛋白组学领域的创新应用，并探讨了未来共同建立临床质谱标准数据库的落地化方案。滑动查看更多强强携手 加深合作全面推动蛋白质科学创新发展在报告环节，吴家睿主任介绍了蛋白设施成立的背景、技术系统、平台设备、重点方向以及近年来取得的成果。赛默飞材料与分析业务生命科学市场销售发展总监陈昉和色谱与质谱业务科学研究市场高级商务总监周昕分别对之前的技术及培训合作进行了回顾，并对未来计划进行了展望。蛋白组学领域自问世以来，取得了令人瞩目的进展。基于质谱和电镜平台，已经诞生了许多重要的发现。这些发现不仅深化了我们对蛋白质结构、功能和相互作用的理解，还为疾病诊断、药物研发和个体化治疗等提供了重要的指导。 此次合作，将共同推动Orbitrap质谱技术和Cryo-EM冷冻电镜在蛋白组学领域的应用，为蛋白质科学研究和生物医药相关领域产业的发展贡献更多华丽的成果。在未来的合作中，双方将共同努力，充分发挥赛默飞的全球领先技术和蛋白设施的科研实力，为蛋白质科学的创新突破和应用推广开辟更加辉煌的前景。关于中国科学院上海高等研究院国家蛋白质科学研究（上海）设施 蛋白质设施是国家“十一五”规划建设的国家重大科技基础设施项目，是全球生命科学领域首个综合性的大科学装置。蛋白质设施主体位于上海市张江科学城，于2008年经国家发改委批复，2014年建成并开放试运行，2015年通过国家验收正式开放运行。蛋白质设施的目标是建设国际一流的蛋白质科学研究体系和成为我国蛋白质科学及技术发展的重要创新基地。主要任务包括：开展蛋白质科学相关研究；研究蛋白质的多尺度时空结构；分析蛋白质修饰和相互作用；阐释蛋白质与化学小分子之间的相互作用；研究蛋白质相关的计算生物学与系统生物学；发展蛋白质研究的新方法和新技术学；结合创新药物的发展，研究蛋白质药物靶标的功能活动的结构特征等。蛋白质设施将聚焦世界科技前沿领域，在不断创新中实现跨越和发展，充分发挥大科学设施平台效能，全面支撑我国蛋白质科学研究和生物医药相关领域产业的发展。如需合作转载本文，请文末留言。

Olink 于 2023 年 7 月 12 日 宣布发布 Olink Explore HT 新产品，该变革型高通量蛋白组学解决方案以全方位的已验证特异性、可扩展性和简化流程。Olink Explore HT 代表了新一代蛋白组学的重大进步，科学家们仅需 2 μl 样品即可准确检测超过 5,300 种蛋白标志物，且重新设计后的整个流程更简化。与上一代 Explore 产品相比，新品不仅将特异蛋白标志物检测数量提高了 80%，同时将样品检测通量提高 4 倍，数据输出能力提高 8 倍，并以更简化的操作流程进一步提高了从样品到数据产出效率。更重要的是，这些创新也缩减了环境空间，所有组件降低了 6 倍，外部包装降低了 10 倍。　　Olink CEO Jon Heimer说到：“Olink Explore HT 展示了我们秉承持续创新的承诺，为科学研究提供强有力的解决方案。在几年前，Olink Explore HT 的强大功能几乎是难以想象的。而现在，这是 Olink 迄今为止提供的最先进的高通量蛋白组学产品，其卓越性能将赋能 21 世纪医疗健康提供重要新发现。”　　Olink Explore HT 旨在全方位解锁所有规模蛋白质组学的巨大价值，以推进多组学研究。并可广泛应用于疾病治疗领域，加深疾病发生、进展及结果进程中，在分子信号通路水平的全面理解。Olink Explore HT 还将推动药物研发新发现，从基于疾病致病蛋白鉴定的靶点发现，到对作用机制研究的实操见解，以及通过对临床试验中现有样品的重新审查来重新利用扩展治疗方法。　　瑞典乌普萨拉大学的Ulf Gyllensten教授说到：“我们对 Olink Explore HT 新平台感到非常兴奋。凭借 Olink 变革型 PEA 多重标记检测技术，Olink Explore HT 使得我们能从微量临床样品中进行高通量、超多重和极其精准的蛋白分析。将 PEA 技术与 NGS 读数结合后，Olink Explore HT 将以其前所未有的能力，进一步揭示全人类蛋白组。作为早期用户，我们已经成功地使用该平台发现识别妇科癌症的诊断和预后蛋白生物标志物。使用 Olink Explore HT 具有的更大规模的蛋白标志物库进行蛋白组学分析，定会加速新型生物标志物的发现，并揭示重要的生物学新见解。更广泛地说，从基础科研到转化研究的整个药物开发过程中，该平台将开启一种强大的基于多组学的新方法。”　　Olink Explore HT 代表了 Olink PEA 技术与 NGS 读数相结合的前沿创新。每一个经过充分验证的分析实验，都再次验证 Olink 用户所信任的特异性和灵敏度的卓越标准。

在世界经济论坛发布的《2023年十大新兴技术报告》中，空间组学被评选为未来最有潜力对世界产生积极影响的十大新兴技术之一。这标志着空间组学不仅在科研领域取得了显著成果，更有望为医学、农业等多个领域带来革命性的突破。在这一技术浪潮中，景杰生物以其卓越的科研实力和前瞻性的战略布局，成为空间蛋白质组学领域的佼佼者。自2021年6月首次推出空间蛋白质组以来，景杰生物不断对技术与体系进行全面优化，一次次刷新着空间蛋白质组学的研究边界。如今，景杰生物再次重磅推出“全息空间蛋白质组学”，为空间蛋白质组学研究提供了更为强大的工具。全息空间蛋白质组学依托于景杰生物创新的10X Proteomics平台，该技术能够支持组织微环境的全覆盖高深度蛋白质组空间检测。在实验中，景杰生物研发团队选择了癌症石蜡样本，运用全流程的先进仪器设施，如徕卡冷冻切片机、数字玻片扫描系统和蔡司激光捕获显微切割仪，进行一站式操作。经过烤片、脱蜡、复水、HE染色等一系列步骤后，成像技术精准定位目标区域，并进行无间隔地切割取样。酶解后使用Orbitrap Astral / timsTOF 最新款高性能质谱平台进行蛋白质组学检测，从而得到与组织微环境图像匹配的全覆盖空间蛋白质组学数据。通过对目标区域进行全覆盖检测，得到了带有空间位置信息的100份蛋白质组学数据，每份数据对应精细组织，无间隔地构成了“全息”的空间蛋白质组学数据集。这些数据集共检测到5500多个蛋白，平均每个样本可检测到4100多个蛋白，是目前最大最全面的全息空间蛋白质组学数据集之一。对于全息空间蛋白质组学得到的庞大数据集而言，如何有效地利用生信分析手段进行挖掘和展示是大家的重要关注点。为此，景杰生物生信和人工智能团队借鉴空间转录组的分析经验，针对全息空间蛋白质组学开发了一系列工具，帮助我们“看得见、挖得深、画得漂亮、画得清晰”。通过以上数据分析方案，可实现与空间转录组学类似的：全息空间样本点无监督聚类分析、类间差异分析/差异蛋白功能注释、单个差异蛋白空间可视化、基于清晰的组织病理特征注释和指定病理分组差异分析、基于反卷积等算法注释细胞类型得分/比例等等个性化分析。相信这样一套分析的组合拳，一方面可以将蛋白信息清晰还原到组织空间微环境中，另一方面也可以与临床病理信息精准结合，定会成为空间蛋白质组学研究的标杆，加速精准医学和基础研究。随着本次全息空间蛋白质组学发布，景杰生物已搭建成全球首个结合空间蛋白质组学、空间磷酸化修饰组学以及全息空间蛋白质组学的一站式空间组学平台。包含了既可以满足个性化选取不规则点位进行蛋白质组精准检测的空间蛋白质组学，又可以进行个性化选取不规则形状点位进行磷酸化修饰精准检测的空间磷酸化修饰组学，本次又实现对组织微环境进行高分辨率全覆盖式蛋白质组精准检测的全息空间蛋白质组学，满足蛋白质组研究的多项需求，为空间蛋白质组学研究提供更多选择。展望未来，全息空间蛋白质组学将在癌症研究、神经科学、免疫学等多个领域发挥重要作用。而景杰生物作为空间蛋白质组学的先驱和引领者，将不遗余力全面推进空间蛋白质组学的技术进步，为前沿研究保驾护航！

天美（中国）科学仪器有限公司参加 &ldquo 饲料及液态奶中蛋白及非蛋白氮检测技术研讨会&rdquo 2008 年11月20日至21日，&ldquo 饲料及液态奶中蛋白及非蛋白氮检测技术研讨会&rdquo 在西安时代大酒店召开。此次会议是由中国农业科学院饲料研究所主办，由农业部饲料质量监督检验测试中心（西安）协办，共有全国各地的饲料质量监督检验测试中心和大型饲料企业的110多位专家和检验人员参加了此次会议。 会议开幕式由中国农科院饲料研究所秦玉昌副所长主持，国家及陕西省畜牧饲料主管单位多位领导出席。 天美（中国）科学仪器有限公司及日立高新技术公司积极支持并参与了此次盛会，天美公司副总裁夏奕生先生在会议开幕式主席台就坐。 会上，来自全国各地饲料质量监督工作一线的多位技术人员就&ldquo 蛋白及非蛋白氮分析&rdquo 这一话题，做了多场技术交流和专题讲座。日立高新技术公司技师井上阳子女士、我公司色谱产品经理姜振喜先生、产品专家石欲容女士也结合我们的氨基酸分析仪和高效液相色谱仪，分别做了关于氨基酸、三聚氰胺分析的专题报告，题目分别为《饲料中氨基酸分析》、《液相色谱法分析饲料中三聚氰胺&ldquo 假阳性&rdquo 结果判断》、《几种不同的色谱柱分析三聚氰胺的结果比较》，获得了参会代表的一致好评。 同时，我们还邀请国内知名食品分析专家撰写文章，结合我们一些日常工作中的经验与体会，为参加会议的代表编写了一本《饲料及液态奶中蛋白及非蛋白氮分析技术文集汇编》的小册子，使大家感觉获益匪浅。 会议期间，天美公司及日立公司技术人员与广大新老用户共同交流、解决疑难问题，给大家留下了良好印象。大会主办方还邀请参会人员参观了西安饲料所的L-8800氨基酸分析仪。 天美（中国）科学仪器有限公司一向关注食品安全问题，不断地与各方专家合作，研究更好更科学的检测方法，为食品安全事业积极做出自己的贡献。 随着我公司的全自动氨基酸分析仪和高效液相色谱仪的用户数量越来越多，公司在为用户的服务方面也投入了更多的精力，不断努力为用户提供更专业的应用方案和更好的服务。

概念蛋白质芯片技术是在ＤＮＡ芯片技术基础上发展的一项蛋白质组学技术。其原理是将大量不同的蛋白质分子（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等）通过微阵列的形式有序排列在固相载体表面，利用蛋白质与蛋白质或者蛋白质与其他分子之间的特异性结合，获得与之特异性结合的待测蛋白（如血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等）的相关信息，便于我们分析未知蛋白的组分、序列，体内表达水平、生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等。蛋白质芯片技术的出现，为我们提供了一种比传统的凝胶电泳、Western blot和Elisa更为方便和快速研究蛋白质的方法。该方法具有高通量，微型化和快速平行分析等优点，不仅对基础分子生物学的研究产生重要影响，也在临床诊断、疗效分析、药物筛选及新药研发等领域有着广泛应用。特点①蛋白芯片具有高特异性、重复性、准确性。这是由抗原抗体之间、蛋白与配体之间的特异性结合决定的。②蛋白芯片具有高通量和操作自动化的特点，在一次实验中可对上千种目标蛋白同时进行检测，效率极高。③可发现低丰度、小分子量蛋白质，并能测定疏水蛋白质，特别是膜蛋白质。④蛋白芯片具有高灵敏性，只需0.5-5μL样品，或2000个细胞即可检测。蛋白芯片技术在分子生物学及生物化学基础研究中的应用01 在蛋白质水平上检测基因的表达由于基因转录产物mRNA数量并不能准确反映基因的翻译产物蛋白质的质与量，因此在蛋白质水平上检测基因的表达对于了解基因的功能非常重要。蛋白质芯片技术产生前，蛋白质双向电泳技术是蛋白质组规模上进行蛋白质表达研究的唯一方法，但这种技术操作繁琐而且难以快速检测样品中成百上千种蛋白质的表达变化。蛋白质芯片的特异性、灵敏性和高通量等特点，在检测基因表达终产物蛋白质谱的构成及变化中发挥着不可替代的作用。02 高通量筛选抗原/抗体相互作用目前蛋白质芯片检测利用最广泛的生物分子相互作用是抗原抗体的特异性识别和结合，单克隆抗体是蛋白质芯片检测中使用最广泛的生物分子。运用蛋白质芯片可以研究不同抗原/抗体的特异性作用，而且对于检测样品中极微量的抗原/抗体分子作用非常有利。03 蛋白质/蛋白质相互作用分析酵母双杂交系统是近年来基因组规模上研究蛋白质相互作用的主要方法，但存在体内操作、假阳性、假阴性和外源蛋白质折叠、修饰等局限。蛋白质芯片技术不依靠任何生物有机体而在体外直接检测目标蛋白质，实验条件可随意控制，同时实验步骤自动化程度高，一次分析的蛋白质数量巨大，因而成为目前除酵母双杂交系统外进行大规模研究蛋白质相互作用的主要方法。04 酶/底物作用分析耶鲁大学的Snyder小组用蛋白芯片对酵母基因组编码的119种蛋白激酶的底物专一性进行了研究。实验中将蛋白激酶表达为谷胱甘肽转移酶（GST）融合蛋白，针对17种不同的底物，平行测定了119种GST2蛋白激酶融合蛋白的底物专一性，发现了许多新的酶活性，大量蛋白激酶可以对酪氨酸进行磷酸化，而这些激酶在催化区域附近有共同的氨基酸残基。也证明了蛋白质芯片可作为高通量筛选酶-底物作用的良好平台。蛋白芯片的检测目前蛋白芯片的检测主要有两种方式。一种是以质谱技术为基础的直接检测法，采用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术，用激光解析电离的方法将保留在芯片上的蛋白质解离出来。具体过程为：芯片经室温干燥后，加能量吸附因子如芥子酸，使其与蛋白质结合成混合晶体，以促进蛋白质在飞行时间质谱检测中的解析和离子化，利用激光脉冲辐射使芯池中的分析物解析成荷电粒子，根据不同质荷比离子在仪器场中的飞行时间长短不一，通过飞行时间质谱来精确地测定出蛋白质的质量，并由此绘制出一张质谱来，以分析蛋白质的分子量和相对含量。另一种为蛋白质标记法，样品中的蛋白质预先用荧光染料或同位素等标记，结合到芯片上的蛋白质就会发出特定的信号，用CCD照相技术及荧光扫描系统等对激发的荧光信号进行检测。与飞行时间质谱相比，该方法定量更加准确，操作也更加简便。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴含着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件进行图像分析、结果定量和解释。其中应用最广的是荧光染料标记法，原理较为简单、使用安全、灵敏度高，且有很好的分辨率。可直接用广州博鹭腾 GelView 6000Plus进行拍摄。图1.GelView 6000Plus智能图像工作站GelView 6000Plus 配备600万像素科学级制冷CCD相机，制冷温度为环境温度下 55℃，极低的暗电流，很大程度降低背景干扰。而且独有的红外感应开关，自动控制样品台的开启与关闭，同时也减少了实验时对仪器的污染。

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4, G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(20%的序列覆盖率)。此外，在MS2的谱图中并没有观察到单体的峰，这说明共价键的断裂比蛋白质的展开和亚基的分离更快，这种效应也在之前的可溶性蛋白和膜蛋白研究中呈现。为了探究位点裂解的偏好，作者将片段离子丰度通过电荷态进行了归化一，发现了高频的断裂位点来自于经典的选择性断裂位点X|P和D|X，而剩余的断裂往往发生在A|G、F|G和V|G的位点，说明N端到甘氨酸有更高的断裂偏好。为了观察断裂的位置和蛋白质的二级结构之间的关系，作者沿着氨基酸序列构建了每个片段相对于原点位置的相对丰度图，多个电荷态的离子则通过归化一的方法进行求和。(图3)由此观察到了大多数的片段断裂出现在跨膜区域的α-螺旋处，其中8号α-螺旋的T|P和V|G，以及6号α-螺旋的L|G和F|G断裂产生了丰度最高的几个片段。此外，将这些片段的相对丰度映射到三聚体的结构上发现，片段来自于蛋白质的内部而非表面。分子动力学的研究表明了其中的机制，在高温下蛋白质的跨膜区域的α-螺旋保持了稳定的结构，而非跨膜区域的α-螺旋则失去了大部分的螺旋结构。先前的研究表明了α-螺旋外侧的质子化的氨基酸可以稳定α-螺旋的结构。由此，作者推测质子不光可以稳定蛋白质的螺旋结构，而且可以沿着蛋白质的骨架迁移来诱导电荷远程破碎。　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

基因工程提供了人们改变蛋白质性质的机会，因而可以借此改善蛋白质的纯化特性。通过在目的DNA的3’端或5’端插入DNA序列，可以改变蛋白质两端的氨基酸序列，进而作为可纯化的融合蛋白。这些融合子可帮助蛋白质形成包含体，用于稳定蛋白质，免受蛋白酶的攻击，还可以赋予蛋白质特定的纯化性质，使其适用于免疫亲和、金属螯合、离子交换、疏水色谱以及其他分离操作。此外，对于已知特性的蛋白质，改变其中特氨基酸可引入具有特定基质吸附亲和力的片段。市面上有两种很常见的标签，分别为组氨酸标签和GST标签，这两种标签可插入蛋白形成重组蛋白，月旭科技现有针对这两种标签蛋白纯化的填料可供选择。His-Tag（组氨酸标签）是重组蛋白表达最常用的标签，无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析纯化。6×His-tag是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。纯化组氨酸标签蛋白最常用的配体是亚氨基二乙酸（IDA）和次氨基三乙酸（NTA），可使用月旭科技Ni Tanrose 6FF（NTA）或Ni Tanrose 6FF（IDA）来纯化。技术参数✦✦谷胱甘肽-S-转移酶（GST）是一种亲和标签，用GST标记真核蛋白可增强融合蛋白的溶解性。此外，带有 GST 标签的蛋白可以在细菌中高水平表达，但可能会由于蛋白聚集而形成包涵体。一般将GST标签添加到目标蛋白质的N或C末端。 GST对谷胱甘肽具有很相对强的亲和力，这意味着可以在固定的基质（如键合谷胱甘肽的填料）上捕获GST蛋白融合物。这种结合特性可用于蛋白质纯化以及通过蛋白质的结合，来捕获对应的蛋白质。因此可使用月旭科技GST Tanrose 4FF来纯化GST标签蛋白。

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）具有抗体活性，是脊椎动物在对抗原刺激的免疫应答中，由淋巴细胞产生的，能与相应的抗原发生特异性结合的或化学结构与抗体相似的一类球蛋白。它普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液和体外分泌液中，是主要的液体免疫物质。1890年，德国学者Behring和日本学者北里首次发现免疫球蛋白。随后人们用电泳技术证明了血液中抗体的活性存在于γ区、β2区、β区和α区。为了避免名称上的混乱，1964年WHO命名委员会统一将抗体和一些化学结构、抗原性与其有关的蛋白统称为免疫球蛋白。免疫球蛋白广泛应用于开发新型功能性食品添加剂，仔畜饲料以及生物新药和医药生化诊断、检测试剂等，已经成为研究和商业等部门重要的物质。所以免疫球蛋白的纯化也备受关注。由于免疫球蛋白对金属螯合色谱的亲和力最da，因此可采用增加上样量使其突破饱和点再用强洗脱液洗下吸附的免疫球蛋白。据报道，此法得到的免疫球蛋白的纯度可达95%，活力几乎没有损失。金属螯合色谱是一种利用金属离子与蛋白质中的某些氨基酸，如组氨酸等特有的亲和力进行分离纯化的新型色谱分离技术，它具有条件温和，分离的蛋白质活性回收率较高。同时操作较为简单，具有较高的处理能力，使用寿命也较长，适宜于生物活性蛋白的分离纯化。月旭推出的Chelating Tanrose 6FF金属螯合亲和介质，由亚氨基二乙酸（IDA）偶联到琼脂糖而成，相当于未螯合Ni离子的Ni Tanrose 6FF(IDA)。Chelating Tanrose 6FF介质的配基可提供3个配位位点同金属离子螯合，同时提供三个离子键结合部位高亲和的纯化目的蛋白，亲和力要强。可广泛应用于分离提纯蛋白质和多肽。其原理是利用蛋白质的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸的侧链与多种过渡金属离子如Cu2+，Zn2+，Co2+，Fe3+的相互作用，从而达到分离纯化的目的。

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。　　作为会议议题的主要内容之一，糖蛋白广泛存在于生物体内，是重要的生物活性物质，具有很多重要功能，关于其的最新研究进展已受到国内外科学家们的高度关注。在本次大会上，南京大学的梁亮博士、美国约翰霍普金斯大学李岩博士、上海交通大学系统生物医学研究院的张延研究员等多位专家学者作了关于糖蛋白最新研究进展的报告，本文对关于糖蛋白研究的部分报告主要内容进行简要报道：　　报告题目：应用糖蛋白质组学和糖组学的方法筛选癌症分子标记物　　报告人：美国约翰霍普金斯大学李岩博士李岩博士　　李岩博士在报告中表示，目前分子标记物研究主要面临的挑战主要是，样品的复杂性与患者的个体差异性，应对其建立高准确度、高灵敏度、高通读、高重复性的分析检测方法。糖蛋白在分子标志物研究中的重要意义，大部分分泌蛋白、跨膜蛋白、和细胞表面蛋白是糖基化蛋白，他们涉及大量的生物学功能，并且，美国FDA已批准的生物标记物几乎全是糖蛋白。　　在其报告中，分别通过糖蛋白质组学糖组学的方法对分子标记物进行了分析比较分析。　　在糖蛋白质组学研究中，其分别采用多维色谱-质谱法(MALDI-TOF/TOF)和SRM-MS对糖蛋白进行了定量检测 在糖组学研究中，其表示，现有的糖组学方法不能用于临床样本检测，而新方法有待确立，李岩博士通过凝集素-抗体反应方法检测了糖的motif在前列腺组织中的表达水平。通过对糖蛋白质组学和糖组学方法的分析比较，其建立了适用于临床的检测方法，对于在前列腺中发现可能的分子标志物选择临床治疗方案有很大的帮助。　　报告题目：用于糖蛋白富集的团队硼亲和方法研究　　报告人：南京大学梁亮博士梁亮博士　　梁亮博士在报告中首先提到，糖蛋白(包括糖肽)的富集是糖蛋白质组学研究中的一个关键科学问题。目前用于糖蛋白富集的主要方法有凝集素亲和法、肼化学法、亲水作用色谱法和硼亲和色谱法等。和其他些方法比较，硼亲和方法虽具有显著的优点，但也有两个明显的缺点：(1)在中性pH下的亲和能力极弱，必须在碱性pH下才能与顺式二羟基化合物结合，这造成了操作上的不便，增加了样品变性的危险 (2)在碱性pH时取代硼酸带负电，与样品及样品基体间存在静电相互作用，因而导致专一性的下降。　　为了同时解决以上两个问题，其科研团队提出了“团队硼亲和”的原理以及相应的方法。该方法要求分子团队成员在分子的另一端带上氨基，通过与环氧开环形成多孔整体材料，分子团队固定到整体材料的表面。该方法只需要一步反应即可制备得到所需的整体柱，操作十分简单，对操作者和环境友好。制备得到的整体柱可以直接应用于生理样品中的核苷等生物分子的专一性富集。最近，其科研团队提出了构建团队硼亲和的另一个绿色化学路线：分子自组装法。分子团队成员在分子的另一端带为噻吩或巯基，利用在金表面的分子自组装，一步反应即可得到团队硼亲和材料。利用该方法，制备了团队硼亲和磁性纳米颗粒和团队硼亲和MALDI靶板，其优异的亲和力和专一性得到验证，成功实现了在中性pH条件下对糖蛋白的专一性富集和纯化。利用团队硼亲和磁性纳米颗粒作为微萃取探针，通过MALDI-TOF MS检测，在生理pH条件下，存在于浓度高100倍的非糖蛋白基体中的糖蛋白能被专一性地萃取。　　报告题目：蛋白质的O-糖基化修饰研究　　报告人：上海交通大学系统生物医学研究院张延研究员张延研究员　　糖链修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰。细胞内50%以上的蛋白质都有糖链修饰。糖链参与了细胞识别、细胞分化、发育、信号传导、免疫应答等各种重要生命活动。按糖链与氨基酸的糖苷键结合方式的不同，真核生物中蛋白质糖基化可分为N-糖基化修饰和O-糖基化修饰，蛋白质的O-糖基化修饰中最主要的O-GalNAc修饰。　　张延研究员通过对O-GalNAc糖基转移酶的糖基化修饰特性进行研究，利用UDP-GalNAc衍生物糖探针的荧光标记技术，结合质谱及多肽蛋白质芯片技术，建立了一种高通量发现蛋白质O-糖基化的新策略。

尽管针对病毒感染的高度敏感诊断测试取得了很大进展，但其仍需要复杂的技术来准备样本或解释结果，这使得它们在医疗资源稀缺地区的推广变得不切实际。发表在15日《ACS中心科学》杂志上的一种灵敏的方法，可在短短20分钟内分析病毒核酸，且可使用“夜光”蛋白质一步完成。萤火虫的闪光，琵琶鱼发光的“诱饵”，浮游植物覆盖的海滩出现幽灵般的蓝色，都是由同一种被称为生物发光的科学现象驱动的。涉及萤光素酶蛋白的化学反应会产生发光的效果。这种萤光素酶蛋白已被整合到传感器中，当它们找到目标时，这些传感器会发出易于观察的光。这种简便操作性使这些类型的传感器成为现场即时诊断测试的理想选择，但到目前为止，它们还缺乏高灵敏度，而CRISPR基因编辑技术需要许多步骤和额外的专门设备来检测复杂、噪音样本中的低信号。荷兰埃因霍温理工大学研究小组使用CRISPR系统相关的蛋白质，将它们与一种生物发光技术结合起来，这种技术的信号只需一台数码相机就能检测到。为了确保有足够的RNA或DNA样本进行分析，研究人员进行了重组酶聚合酶扩增（RPA)，这是一种在大约38℃的恒温下工作的简单方法。使用发光核酸传感器（LUNAS）的新技术，两个CRISPR/Cas9 蛋白对病毒基因组的不同相邻部分具有特异性，每个蛋白都有一个独特的萤光素酶片段附着在它们上面。如果研究人员正在测试的特定病毒基因组，这两个CRISPR/Cas9蛋白将与目标核酸序列结合并相互靠近，从而使完整的萤光素酶蛋白在化学底物存在的情况下形成并发出蓝光。当对从鼻拭子收集的临床样本进行测试时，RPA-LUNAS在20分钟内成功检测到新冠病毒RNA，即使在每微升200份拷贝的浓度下也是如此。

style type="text/css".TRS_Editor P{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor DIV{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TD{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TH{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor SPAN{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor FONT{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor UL{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor LI{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor A{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }/stylestyle type="text/css".TRS_Editor P{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor DIV{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TD{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TH{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor SPAN{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor FONT{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor UL{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor LI{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor A{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }/stylep　　近日，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所陈勇研究组的最新研究成果，以emStructural basis for DAXX interaction with ATRX/em为题，发表在emProtein & Cell/em上，该成果揭示了组蛋白分子伴侣DAXX蛋白与染色质重塑蛋白ATRX相互作用的结构基础。/pp　　ATRX蛋白是染色质重塑蛋白SNF2家族中的一员，与地中海贫血症、智力发育迟缓、癌症等疾病密切相关。DAXX蛋白（死亡结构域相关蛋白）作为组蛋白H3.3的分子伴侣，介导含H3.3组蛋白变体的核小体的组装，参与细胞核内基因转录、调控细胞周期等生理过程。此外，DAXX能与多种细胞因子、细胞蛋白和病毒蛋白相互作用，抑制病毒转录，具有内在的抗病毒防御作用。ATRX和DAXX蛋白对于H3.3组蛋白变体定位到异染色质位置均非常重要，但具体机制尚不清楚。/pp　　陈勇研究组找到ATRX与DAXX蛋白相互作用的最小作用单元和关键的作用位点，解析了DAXXsubDHB/sub-ATRXsubDBM/sub蛋白复合物的结构，得到清晰全面的相互作用机制。进一步结构比较发现，DAXXsubDHB/sub是一个普适性的蛋白质结合模块，能通过保守的作用模式和多种底物蛋白质结合。该项研究为后续研究ATRX-DAXX复合物如何介导H3.3组蛋白变体在异染色质的堆积和组装打下坚实的基础。/pp　　研究工作得到中科院战略性先导科技专项、国家科技部、国家自然科学基金委和上海科学技术委员会的资助。/ppbr//p

本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！