冷冻管盒

多歧管型冻干机是一种冻干设备，其主要特点是在于真空罩内设置有多个支路，使得多个样品可以同时进行冷冻和真空干燥。这种设计使得多歧管型冻干机在一定情境下比传统的单一冷冻管型冻干机更为高效。以下是多歧管型冻干机的一些主要应用领域：制药工业： 制药行业是多歧管型冻干机主要的应用领域之一。在制备药物时，多歧管型冻干机能够同时处理多个药物样品，提高生产效率，确保药品的质量和稳定性。 生物制品：在生物制品的制备过程中，如细胞、酶、蛋白质等的冻干，多歧管型冻干机能够更加高效地处理多个样品，保持其活性和稳定性。这对于生物制品的保存和运输至关重要。 食品工业：在食品工业中，多歧管型冻干机可用于同时处理多种食品，如水果、蔬菜、奶制品等。这有助于提高生产效率，延长食品的保质期，并保持其原有的营养成分和口感。 化学品制备：化学品制备中，特别是对于一些高纯度化学品的制备，多歧管型冻干机可以同时处理多个试剂，提高生产效率，减少制备时间，确保产品的纯度和稳定性。 实验室研究：在科学研究领域，多歧管型冻干机可以满足实验室对于同时处理多个样品的需求。这对于高通量实验和大规模样品处理具有重要意义。 医疗器械和诊断试剂：在医疗器械和诊断试剂的制备中，多歧管型冻干机能够同时处理多个样品，确保产品的质量和稳定性，适用于大规模生产和制备。 总体而言，多歧管型冻干机在需要同时处理多个样品的场景下具有显著的优势，适用于多个行业，为这些行业提供了高效、可靠的冻干解决方案。

冷冻干燥歧管配置如何进行冻干终点判定对于一个冷冻干燥工艺，准确找到冻干终点是精准控制冻干工艺成本的重要衡量。通常判定冻干终点有三种方式：温度差、压力差和压力升高，其中较常用的判定方法是通过测定样品和加热隔板间的温度差（差值 1℃）来判断是否达到初级干燥（或次级干燥）的终点。利用温度差方式判定所需要的配置有可控温加热隔板和样品温度探头，这就使得冻干机必须选择干燥箱体式结构，以保证这两个重要配件的具备。但当我们使用歧管加冻干挂瓶进行干燥时，则另外压力差或压力升高的方法进行冻干终点判定。下面我们就对这两种判定方法进行分析，帮助使用者通过视觉控制来评判样品的干燥过程，精准地结束冷冻干燥，从而缩短处理时间得到可靠的干燥结果。 1所需仪器和样品步琦无极限冷冻干燥机Lyovapor&trade L-300 Pro外置电容和皮拉尼压力计1000mL 圆底烧瓶-50℃ 实验室冰箱甘露醇（97.0-102.0 %）去离子水 2实验过程取 4 个圆底烧瓶（1000 mL），每个烧瓶中装有 150mL 浓度为 50mg/mL 甘露醇溶液装有甘露醇溶液的烧瓶都放入 -50℃ 的冰箱，冷冻 24 小时在完成 Lyovapor&trade L-300 的调节步骤后，进行目标压力 0.200 mbar 的真空测试。不同的测量技术决定了外部压力表之间的偏移值冻干方法为初级干燥(持续 24 小时，压力 0.200 mbar)和可忽略的次级干燥(持续 1 分钟，0.200 mbar)。在初级干燥阶段将压差和压力升高方法编程中均设置为“激活”从冰箱中取出已完全冷冻的烧瓶，连入 Lyovapor&trade L-300歧管上，设定压力为 0.200 mbar，且每个样品瓶内压力均可达到该值判定冻干终点的试验，按照下 表1 设置压力差和压力升高测定。表1：利用冻干机 Lyovapor&trade L-300 冷冻干燥 50 mg/mL 甘露醇溶液，其方法编程中终点测定的详细设置。压力差测试设置极限压力为 0.050mbar，测试时间 30 分钟。该试验在冷冻干燥过程开始时直接开始。对于压力升高测试，压力限制设置为 0.060mbar，测试时间 30 秒。第一次升压试验在冷冻干燥开始 12 小时后进行，每 60 分钟重复一次。3测试结果当压力设定在 0.200mbar 时，电容压力计测量的实际压力平均为 0.230mbar。在干燥过程中，实验室的温度和冷冻干燥机的环境温度平均为 20.1℃。图1 显示了甘露醇溶液在连接到歧管圆底烧瓶中冷冻干燥时的压力。皮拉尼计测得的值比电容压力计测得的值高约 1.6 倍（绿色为电容压力计，红色为皮拉尼压力计）。图1：图1 中两个压力表数值之间的数学差值显示在下 图2 中。随着干燥的进行，皮拉尼压力计的值逐渐接近电容压力计的测量值。47.6 小时后，压差低于 0.05mbar 的设定值，达到压差试验的标准(图2)。从皮拉尼和电容计压力曲线的峰值可以看出，在干燥过程中完成的压力上升测试(图1)。在干燥结束时，升华过程中最初的高压上升(峰值)大幅下降。干燥时间 49.9 小时，达到升压试验标准。作为比较，建议干燥时间为 24 小时。图2：4测试结论通过试验说明过程分析技术(PAT)在冷冻干燥过程实时监控中具有高适用性。具体而言，该研究探索了利用监测干燥室压力，并结合设置压力差和压力升高测试进行自动终点判定来估计干燥时间，无需在干燥过程中对样品进行残余水分含量分析。实验表明，这种综合方法能够控制冻干过程的时间，同时提供一种跟踪冷冻干燥运行质量及结果的方法。该综合方法可以防止干燥过程过早停止。此外，该研究通过使用 Lyovapor&trade L-300 冷冻干燥机，搭配皮拉尼和电容压力计，建立了在歧管配置中样品跟踪和终点判定的可行方法。

1月21日，内蒙古包头市稀土高新区新冠肺炎防控工作指挥部发布最新消息。1月20日，根据包头市进口冷链产品“一批一检、随到随检、不检不售”机制要求，在例行售前检测中发现，包头稀土高新区润恒物流城和昆区包钢冷库一批进口冷冻猪前肘中部分检测呈阳性，该批次进口冷冻猪前肘全部货物已封存，未流入市场，企业已暂停营业，相关人员和企业全体员工核酸检测均为阴性。包头市立即启动疫情防控应急响应，第一时间封闭涉疫冷库，对货物进行封存，外围场地环境进行彻底消杀，对该冷库管理人员、司机、搬运工及相关接触人员进行集中隔离医学观察，对上述人员和涉事冷库所在市场全体从业人员开展核酸检测，检测结果均为阴性。自从全国多地先后出现从冷链食品外包装，或冷链环境中检测出新冠病毒阳性后，冷链食品还能不能放心吃，特别是进口冷链食品敢不敢买，就成了很多消费者关心的问题。在这里提醒市民朋友，尽量避免网购、代购进口商品，减少传播风险。如需购买，一定要去正规超市，因为正规的进口冷链食品，一般都要经方舱实验室24小时检测，保证食品安全。同时要增强自我防护意识，勤洗手、戴口罩，在外做到不扎堆、少聚会、保持安全社交距离。

Eppendorf作为全球台式离心机生产商的领导者，不断追求最新科技和工艺，并以人性化设计冠绝于世。近日，Eppendorf对外推出全新5427 R小型台式高速冷冻离心机。新上市的5427R台式高速冷冻离心机设计直观、操作人性化，配备多种转子的多功能设计可以使您的日常离心工作更加高效方便。全新设计的5427 R台式高速冷冻离心机是实验室高通量高效制备样品的理想工具，并利于后续分析检测工作。5427 R小型台式高速冷冻离心机配备9款不同转子设计，适用于不同离心应用。其中，双排48孔转子可进行高通量高速离心，提高工作效率；24孔Kit管转子，适用于试剂盒和开盖离心，加宽的边缘防止离心时意外打掉离心管盖。此外，创新的动态压缩机控制技术，可以精确而有效地制冷，保护敏感样品，延长压缩机使用寿命。了解更多信息，请登录Eppendorf官方微博：http://weibo.com/eppendorfchinaEppendorf中文官网：http://www.eppendorf.cn关于艾本德(Eppendorf)德国艾本德股份公司于1945年在德国汉堡成立，是一家全球领先的生物技术公司。产品包括移液器、分液器和离心机，以及微量离心管和移液吸头等耗材，此外还提供从事细胞显微操作的仪器和耗材、全自动移液系统、DNA扩增的全套仪器。产品主要应用于科研、商业化的研发机构、生物技术公司以及其他从事相关生物研究的领域。2007年Eppendorf收购美国New Brunswick Scientific (NBS) 公司，2012年Eppendorf收购德国DASGIP公司，拓展了其细胞培养领域的产品线。关于艾本德中国(Eppendorf China Ltd.)2003年Eppendorf正式进入中国，分别在北京、广州设立分公司，启动直销的经营模式，为中国客户提供更便捷的技术售后服务。目前全国雇员数量近200名，产品销售覆盖各大中型城市，是Eppendorf全球发展最快的子公司。

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网

冷冻共聚焦显微镜及其在冷冻电子断层扫描中的价值 Cryo ET（电子断层扫描）是一种专用的透射电子显微镜技术，可以重建观察区域的三维体积。借助先进的冷冻EM（电子显微镜），图像分辨率可以提升到令人难以置信的亚纳米等级。因此，可以在细胞内的原生环境中研究蛋白质以及其他生物分子，从而揭示尚未探明的分子机制。由于细胞和组织必须薄到能够透过电子，样品必须进行切片以获取足够薄的样品体积（薄层）。为对样品中的靶区进行精确的三维定位，冷冻共聚焦显微镜是必不可少的工具。 以下部分，我们将描述冷冻电子断层扫描工作流程的主要步骤，以及如何通过冷冻共聚焦显微镜定位靶区并进行切片，以提高整个工作流程的可靠性。 在EM网格上培养细胞 通常，在涂有多孔碳膜（例如 QuantifoilR）或二氧化硅（SiO2）膜的金质或钛金网格上植入急性分离或培养的细胞（图1，Mahamid等人，2019）在后续步骤中，钛金属和二氧化硅似乎更加坚硬而且稳定，无需额外添加碳层（Toro-Nahuelpan 2019） 网格通过Poly-L-Lysin或纤连蛋白（Fibronectin）实现生物激活，胰蛋白酶解离细胞在前一晚植入，以便在后续步骤中附着在碳层表面（Mahamid等人，2019）。 图1：采用12纳米厚多孔二氧化硅膜（R 1.2/20，即孔径1.2微米，间距20微米）的3毫米EM金质（Au）网格的反射图像拼接图。HeLa细胞已经植入并玻璃化。实心箭头：定位用的中心标记；空心箭头：聚焦离子束进入的切片槽；虚线箭头：空的网格方格。一个网格方格的边长：90微米。 添加微型图案 为进入细胞样品以成功实现FIB切片并在冷冻TEM中开展后续分析，必须确保相关细胞位于网格方格的中心位置或其附近。但细胞喜欢在网格条上生长或者集簇生长，因此不适合进行FIB切片和电子透射分析。为了克服这一挑战，微型图案技术允许用户控制细胞在碳膜（图2）上的位置和分布，提高相关工作流程的可靠性。 网格表面涂有聚乙二醇（PEG），可防止生物材料附着。利用紫外激光移除该涂层，即可对细胞的黏附进行针对性控制，保证FIB切片以及TEM的可操作性（Toro-Nahuelpan 2019）。此外，可以创建特定图案，从而影响整个细胞结构并且有助于使用冷冻电子显微镜研究生物力学现象。 图2：有/无微型图案的细胞分布情况左图：分布不均的细胞（小鼠A9成纤维细胞，使用Alexa Fluor 488 Phalloidin标记，以显示纤维状肌动蛋白）。右图：网格方格中心定位精确的细胞，可进行FIB（成纤维细胞黏附在纤维蛋白原微型图案表面；图片由Alvéole与德国汉堡CSSB中心教授Kay Grünewald博士共同提供。） 投入冷冻 为在固定用于电子显微镜检查的同时确保样品接近原生状态，细胞必须极速冷冻，以免产生破坏性的冰晶。这个过程称为玻璃化，因为冰片变成无结晶的玻璃状（玻璃体） 为让样品细胞达到这种效果，网格必须快速投浸到适当的冷冻剂（通常为乙烷，或者乙烷和丙烷）中。1981年，Jacques Dubochet发表了首个手动吸液和投入冷冻方法，该方法仍获广泛使用以获取出色的结果（Dubochet, J.以及McDowall, A. W.，1981）。 在投入冷冻之前，必须去除多余的液体。标准技术是使用滤纸实现受控吸液（图3，Dubochet, J等人，1982；Bellare等人，1988；Frederik, P. M.等人，1989）。 图3：在投入冷冻前，通过吸液处理对多余液体进行受控移除。使用镊子固定网格，并通过单独步骤将吸液纸移向网格。吸液传感器可以自动并反复执行该过程。 市面上有多种不同的吸液设备，例如用于自动吸液和投入冷冻的Leica EM GP2。根据不同样品类型的多种需求，可以使用多种涉及吸液步骤的样品制备方案（另见此处）。 冷冻状况下的存储、装载和转移 玻璃化之后，样品必须在整个工作流程期间处于冷冻状况下。因此，必须对从存储到转移至不同成像系统的所有步骤进行冷冻处理，以免样品析晶和/或污染这尤其困难，因为这种低温冷冻样品会像磁铁一样吸引附近的湿气和灰尘。研究人员和制造商付出巨大的努力来开发并提供解决方案，以便在工作流程的不同步骤中保证样品安全。 样品通常以四个为一组存储在网格盒内，而网格盒又保存在大型液氮（LN2）罐中的Falcon多孔试管中。还可以使用更为复杂的冰球系统。 转移并装载到样品架时，通常使用液态氮（LN2）。不幸的是，LN2往往会在一段时间后，因为空气中的水分而产生结晶冰污染。在转移时，这些冰晶可能会附着到网格上，干扰随后的切片和成像过程。此外，LN2内部的能见度很低，因为它在不断移动，而且始终会有条纹。 因此，最好在LN2上部的气相部分装载并转移样品以保持冷冻条件，同时为装载步骤（图4）提供出色的可见性。 徕卡显微系统在提供GN2（气态氮）装载和转移设备方面拥有30多年的悠久历史。新的冷冻显微镜套件就在这些经验的基础上开发而成，同时融合众多客户的反馈意见打造出先进的转移舱和夹具系统。 图4：在冷冻显微镜套件转移舱的GN2（气态氮）环境中装载网格。转移舱的可见度在冷冻条件下不受干扰。 检查样品质量和靶分布 在冷冻工作流程中，一般而言，EM操作时间尤其宝贵，因此对样品进行早期质量检查至关重要。许多因素会关系到样品能否转移到下一个工作流程步骤，包括碳箔的结构完整性、玻璃化的质量（包括冰层的厚度及其分布）、目标细胞的存在、分布和可及性，以及目标结构的存在和定位。 所有这些参数均可通过基于相机的冷冻光学显微镜（例如THUNDER Imager EM Cryo-CLEM）或使用STELLARIS冷冻共聚焦显微镜上的相机模式来检查（图5）。 透射模式显示网格、箔膜和细胞质量，反射图像显示网格表面，尤其是呈现玻璃化质量和冰层厚度，而荧光图像可以提供有关不同靶蛋白的表达水平及其分布情况的信息。 图5：不同模式呈现出网格的完整性以及靶分布。A——网格表面的反射图像可以显示碳膜或二氧化硅层的缺陷以及冰层的厚度。B——绿色荧光（线粒体）。C——液滴分布以实现高精度关联D——通过Hoechst标记的细胞核E——所有模式的叠加图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 在LAS X Coral Cryo软件工作流程中，用户可以在引导下，通过不同图像模式对整个网格自动创建清晰的合焦概览图像。 标记标志点、薄片点以及液滴中心 为了关联冷冻LM（光学显微镜）的3D图像以及后续的冷冻FIB-SEM/TEM图像，首先需要获取网格的概览图像以便大致对齐两种模式的图像（图6）。这里，反射图像非常重要，因为它们类似于SEM图像，但也可以使用透射图像。中心标记以及其他标志点（例如碳层中的缺陷）有助于快速定位并对齐概览图。 图6：以不同模式获取整个网格的合焦概览图像，用于识别网格缺陷、对齐标记和靶分布。中心标记用实心箭头表示，二氧化硅层中的主要缺陷用空心箭头突出显示。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 其次，需要超分辨率的共聚焦3D图像。这些图像堆栈用于在潜在薄片位置的范围内执行高精度关联。完成概览图对齐后，可以找到3D共聚焦堆栈的正确位置以便后续进行高精度关联这样做的前提是必须提供图像相对于概览图以及相对于彼此的位置。这就是Coral Cryo软件工作流程之后的处理步骤（图7）。 图7：相机概览图像与共聚焦Z-堆栈相机和共聚焦图像的组合含有XY坐标位置，因此可以匹配。所有图像都包含在Coral Cryo软件工作流程期间创建的相关项目文件夹中。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 必须组合相机概览图像和超分辨率3D图像以检索靶区位置并在FIB-SEM上定义切片位置。这个步骤非常重要，因为在标准FIB-SEM中，无法看到荧光以及相应的靶区点位。 EM（电子显微镜）制造商近期研发出一种集成了FIB-SEM功能的荧光显微镜，可以作为在切片过程中通过检查荧光来提高工作流程的可靠性和准确性的一种绝佳选择。不过，这些系统并不具备必要的分辨率以及采集模式的灵活性，无法像单独的共聚焦系统那样实现精确的3D定位。 如何关联并检索薄片位置 作为常用的最低标准，研究人员使用LM图像的屏幕截图在EM上检索靶区的XY坐标。不幸的是，并排比较图像不仅费力耗时而且很容易出错，因此并不可靠。身为工作流程提供商，徕卡显微系统致力于通过THUNDER Imager EM Cryo-CLEM来改善这种情况。研究人员可以在图像上定位标志点和靶区标记，然后以开放EM格式的完整坐标集导出。首先，这个流程适用于2D图像，因此合乎逻辑的下一步骤就是提高分辨率并将坐标系扩展到3D坐标。 对于高精度关联和3D定位，目前广泛采用的是基于液滴的方法（Alegretti等人，2020；Klumpe等人，2021年；Bieber, A.，Capitanio, C等人，2021）液滴通常在玻璃化之前添加到细胞中，可在LM和EM中观察到，用于通过XYZ坐标对齐图像堆栈，作为图像数据相关性的基础，从而正确定位FIB切片窗口（图8）。 典型液滴的尺寸为1微米，完全呈球形，这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子，可以更清晰地观察到含有金属的微滴，从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择液滴，使其荧光发射不同于实际靶的荧光发射，以便能够更好地分辨。 图8：3D共聚焦图像（左）和俯视SEM图像（右）的最大投影。荧光液滴（1微米）在两种模式中均可以观察到，因此可以用于对齐数据。SEM图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung和Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 要使用来自冷冻LM和FIB-SEM的3D数据，在冷冻LM的引导下，进行薄片制备，可以使用一款开源软件（3D关联工具箱，简称3DCT，Jan Arnold等人，2016）。 将冷冻LM图像载入到在FIB-SEM上运行的该软件中。二维LM概览图和SEM图像之间的三点关联用于初步定位。之后，使用离子束获取相关视场，并手动点击LM堆栈和FIB图像中的相同液滴图10显示了一张LM图像和一张FIB图像，其中的靶区点位以及液滴可以在定位软件中重现其排列组合。 图9：在LM和FIB图像中关联标记。左图：点击观察结构周围的液滴，并在3D图像中执行质心定义（白圈中的绿点）计算得到的位置随后投影到FIB图像（右图）上根据液滴标记，计算目标结构的位置并标记到FIB图像中（红圈中的红点）。离子束图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 该软件通过对X、Y、Z信号进行高斯拟合，精准确定液滴的中心。近期的改进增加了半自动液滴检测功能以及其他功能，从而更加方便地执行冷冻FIB工作流程。(SerialFIB, Klumpes等人，2021）。 在网格条上选择围绕最终目标结构的几处液滴，作为切片处理的坐标系。基本计算方法是考虑缩放、旋转以及平移之后的线性仿射变换最后，在LM图像中选择目标结构并叠加到FIB图像上。 根据目标结构的位置，就可以定位切片窗口(图10)。 图10：定位切片窗口左：离子束细胞图像，含有标记液滴和目标结构根据目标结构的计算位置，在所用FIB-SEM的切片软件中，交互定位上下切片窗口的位置（细薄条纹上方和下方的红色方块）。图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 Coral Cryo工作流程具有哪些优势？ Coral Cryo软件工作流程旨在为基于液滴的靶区定位工作流程提供支持。它可以提供创建合焦相机概览图像所需的成像作业（图6和图7）。所有必要的自动对焦功能均可以正确调整并分配，并且可以标记潜在薄片位置，同时能够在定义的位置执行超分辨率共聚焦Z-堆栈。 在定位管理器（图11）中，可以确定所有必要的坐标标记，并且以开放格式（*.xml）提供。此类图像会自动保存，其数据格式可以导入任何FIB-SEM软件。 图11：Coral Cryo软件模块标记点、薄片和液滴标记均可以在软件工作流程中定义。反射图像中细胞的顶部和底部坐标值可以作为在FIB SEM中正确计算靶区3D位置的额外参考。本文前述部分图像中的相同细胞经过突出显示，用于标记定义。 对齐标记用于使用相机概览图像对标记点进行初步的粗略对齐。薄片标记具有双重用途：作为进行超分辨率共聚焦3D扫描的位置标记，或者在图像采集后，作为靶结构的精确3D标记。亚像素插值确保该阶段可以在3D图像内进行高精度定位。最后，插值方法还用于标记液滴坐标，以便在FIB-SEM上进行后续液滴关联。 冷冻FIB切片 进行必要的关联并设置切片窗口，薄片位置通常会粗略切薄至大约1微米，随后进行最终的抛光步骤以达到电子透明（图12）。 图12：目标薄片的离子束图像以及SEM俯视图图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：10微米。 采用两步方法的原因在于冰污染和/或切片材料可能会沉积在薄片上。为避免在最终薄片上发生冰污染，建议采用快速抛光工艺（Schaffer M.等人，2017）。还可以采用开源的商业软件，以自动方式进行切片。 冷冻透射电子显微镜 进行冷冻FIB切片之后，含有薄片的网格转移至冷冻TEM，通过对网格（连同薄片）逐渐倾斜，采集一系列断层扫描图像。图像经过计算处理以重建所记录体积的3D断层扫描图像。通过对样品的多个图像取平均值，可以降低固有噪点，从而对蛋白质或蛋白质复合物等颗粒获得更高分辨率的结构。这种处理方式称为亚断层图像平均（Wan和Briggs，2016；Zhang 2019）。从概念上说，这相当于通过单颗粒成像（SPA），在原位实现对大分子的亚纳米分辨率。 总 结 本文旨在表明冷冻共聚焦显微镜是冷冻工作流程中的一个重要组成部分，用于评估EM网格上玻璃化样品的质量和靶分布。在冷冻条件下记录的高分辨率共聚焦数据使科学家能够在3D荧光下识别目标结构。此外，3D体积可作为相关方法的参考，以便在FIB-SEM中检索靶结构进行切片，然后在冷冻TEM中进行电子断层扫描，以获得靶区的亚纳米分辨率图像。 Coral Cryo工作流程搭配新的共聚焦平台STELLARIS，再加上Coral Cryo软件，可以帮助新手用户创建网格概览图像、超分辨率3D图像以及精确的坐标标记，为后续的FIB切片和冷冻电子断层扫描奠定坚实基础。 参考文献：（上下滑动查看更多） 1.Allegretti M, Zimmerli CE, Rantos V, Wilfling F, Ronchi P, Fung HKH, Lee CW, Hagen W, Turoňová B, Karius K, Börmel M, Zhang X, Müller CW, Schwab Y, Mahamid J, Pfander B, Kosinski J, Beck M.: In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 2020 Oct 586(7831):796-800. doi: 10.1038/s41586-020-2670-5. Epub 2020 Sep 2. PMID: 32879490. 2.Arnold, J., Mahamid, J., Lucic, V., de Marco, A., Fernandez, J., Laugks, T., Mayer, T., Hyman, A. A., Baumeister, W., Plitzko, J. M., Biophysical Journal, Vol. 110, Feb. 2016, pp 860-869. 3.Bellare, J. R., Davis, H. T., Scriven, L. E. & Talmon, Y.: Controlled environment vitrification system: an improved sample preparation technique. J. Electron Microsc. Tech. 10, 87–111 (1988). 4.Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P.S.: Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo--Electron Tomography. J. Vis.Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021). 5.Dubochet, J. & McDowall, A. W.: Vitrification of pure water for electron microscopy. J. Microsc. 124, RP3–RP4 (1981) 6.Dubochet, J., Lepault, J., Freeman, R., Berriman, J. A. & Homo, J. ‐C.: Electron microscopy of frozen water and aqueous solutions. J. Microsc. 128, 219–237 (1982) 7.Frederik, P. M., Stuart, M. C. A. & Verkleij, A. J.: Intermediary structures during membrane fusion as observed by cryo-electron microscopy. Biochim. Biophys. Acta 979, 275–278 (1989). 8.Klumpe, S., Fung, Herman K. H., Goetz, Sara K., Zagoriy, I., Hampoelz, B., Zhang, X., Erdmann, Philipp S., Baumbach, J., Müller, C. W., Beck, M., Plitzko, J. M., Mahamid, J. A.: Modular Platform for Streamlining Automated Cryo-FIB Workflows. bioRxiv 2021.05.19.444745 doi: https://doi. org/10.1101/2021.05.19.444745 9.Mahamid J, Tegunov D, Maiser A, et al.: Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2019 Aug 116(34):16866-16871. DOI: 10.1073/ pnas.1903642116. PMID: 31375636 PMCID: PMC6708344. 10.Schaffer M, Mahamid J, Engel BD, Laugks T, Baumeister W, Plitzko JM.: Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins. J Struct Biol. 2017 197(2):73-82 doi: 10.1016/j.jsb.2016.07.010 11.Toro-Nahuelpan, M., Zagoriy, I., Senger, F. et al.: Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies. Nat Methods 17, 50–54 (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-019-0630-5 12.Wan, W., Briggs, J. A. G.: Cryo-Electron Tomography and Subtomogram Averaging. Methods Enzymol. 2016 579:329-67. Doi: 10.1016/ bs.mie.2016.04.014. 13.Zhang, P.: Advances in cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Curr Opin Struct Biol. 2019 Oct 58:249-258. Doi: 10.1016/j.sbi.2019.05.021. 相关产品 UC Enuity 超薄切片机 徕卡显微咨询电话：400-630-7761 关于徕卡显微系统 徕卡显微系统的历史最早可追溯到19世纪，作为德国著名的光学制造企业，徕卡显微成像系统拥有170余年显微镜生产历史，逐步发展成为显微成像系统行业的领先的厂商之一。徕卡显微成像系统一贯注重产品研发和最新技术应用，并保证产品质量一直走在显微镜制造行业的前列。 徕卡显微系统始终与科学界保持密切联系，不断推出为客户度身定制的显微解决方案。徕卡显微成像系统主要分为三个业务部门：生命科学与研究显微、工业显微与手术显微部门。徕卡在欧洲、亚洲与北美有7大产品研发中心与6大生产基地，在二十多个国家设有销售及服务分支机构，总部位于德国维兹拉(Wetzlar)。

苏昭铭：博士，四川大学生物治疗国家重点实验室博士生导师。华西生物国重创新班"一对一"指导教师。前不久，苏昭铭老师带领课题组在Nature发表文章。优秀的成绩并非偶然，从学生、学者到老师，苏昭铭一路走来，一路坚守。从“尖子生”到“好老师”从学生到学者，在求学的过程中，苏昭铭没有吝啬时间的付出，也未曾停止向更高处的探索。在离开北京大学后，苏昭铭前往美国北卡罗来纳州立大学攻读博士学位。在不断钻研的过程中，苏昭铭找到了坚守的方向。博士阶段，苏昭铭的研究方向是有机化学。“博士最后一年，随着基础知识的积累，我逐渐产生自己的想法，也发掘着自己的未来方向”，他回忆到，“在自由文献讨论的课堂上，有关生物的相关命题启发着我去探索自己真正的兴趣所在。”博士毕业后的苏昭铭并没有止步，他先后前往美国Scripps Florida研究所，美国贝勒医学院从事博士后研究。“博士后阶段帮助我从一个刚毕业的学生过渡到一个可以从事严肃科学研究的工作者”，两次转型使苏昭铭完成了研究重心从化学到生物的成功过渡，也寻找到了“让我觉得更有意义和挑战性”的科学课题。从学者到老师，时间与经验的积淀是为人师的必经之路。即使已经拥有一份华丽的简历，苏昭铭却始终“还想再去高处看看”，他质问自己，“既然我作出选择，并付出这么多时间，那为什么我不能做到世界顶尖的水平呢？”2017年，苏昭铭加入斯坦福医学院，任职高级研究员，在美国科学院院士Wah Chiu实验室从事冷冻电镜相关的研究。苏昭铭深知，对于科研，时间的积淀是必须的也是急不得的， “只有当你具有独立思考的能力和清晰的目标，才能担负起领导课题组的责任”。2019年，归国后的苏昭铭选择了四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室。“川大对于科研的纯粹吸引了我，川大‘华西生物国重创新班’以提升本科同学的科研能力和创新思维为宗旨的创新人才培养模式，也引起我极大的兴趣。我们不仅有自己纯粹的科研追求，还能为川大的优秀人才培养做出贡献”。苏昭铭说。四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室拥有西南地区唯一的冷冻电镜平台，在魏于全院士的大力支持下，课题组应用多种冷冻电镜技术，进行RNA的结构及功能的探索，缓缓揭开了“RNA结构与功能关系”这层神秘的面纱。“苏老师是一个‘可沟通’的老师”，这是苏昭铭的第一位研究生对他的评价。谈及学生管理，苏老师回忆起自己的博士生导师。导师随性而专注的工作状态无形中对苏昭铭形成了一种指引，“他让我觉得我也可以从事科研，也意识到科研的价值与乐趣所在”。在带领课题组的过程中，苏老师也将这种观点传输给自己的学生: 一是要确认同学的心态，“科研需要大量的时间付出，对于每一名学生，我都需要确认他们是否从内心选择这样的道路，这是对他们人生的‘负责’”；二是要“接地气”，不算壮大的课题组却气氛感十足，“如果让学生对科研产生一种遥不可及的距离感，会让他们对此产生抵触与畏难情绪”。除了带领课题组进行深入的探究，基于生物治疗国重的人才培养平台，苏昭铭老师也负责部分本科教学的课程。通过扩展冷冻电镜的相关知识，带领同学们认识着前沿的科学技术，受到广泛好评。“探索”，是科研的至美之境目前，苏老师团队的主要研究方向为应用冷冻电镜技术，探索生物大分子，尤其是RNA的精细结构。前不久，苏昭铭课题组在Nature发表文章，他们运用冷冻电镜单颗粒重构技术首次解析了全长四膜虫核酶的高分辨结构，揭示了外围区域结构及其远程调控催化活性的功能，阐明了在底物结合和催化过程中的内部引导构象的变化。在这项研究中，课题组成员主要负责电镜结果的数据处理。“对于我们的研究，数据处理对成果的贡献要占到50%以上的比重”，苏昭铭向我们介绍到，“数据的分析是对凌乱数据的梳理，不加分析的原始数据难以得出有意义的结论”。这项研究解析了截至目前全世界分辨率最高的纯RNA冷冻电镜结构，填补了40年来在全长四膜虫核酶结构功能研究上的空白，也为用冷冻电镜进行RNA结构研究提供了参考。攻读博士期间，苏昭铭一直聚焦于合成研究领域，学习冷冻电镜技术，而丢掉“老本行”这样巨大的转变需要勇气，也需要大量时间与经历的投入。苏昭铭用两段博士后经历完成了这个转变。第一个博士后阶段，苏昭铭瞄准了生物领域的“RNA”分子，将其与化学相联系，“在我看来，相对于蛋白质来说，RNA的研究还有很多空白，而他作为中心法则中上承DNA下启蛋白质的生物大分子，其结构与功能应得到我们更多的关注”。第二个博士后阶段，苏昭铭在贝勒医学院初步开启了RNA冷冻电镜结构功能研究之旅。回首博士后的科研探索经历，他不禁感慨道，“这样的过渡需要时间的付出，又或者说这些时间的付出成就了这样的转变”。深度、高度，是苏昭铭对待科研“纵向探索”的追求，而在选题的诞生过程中，他也总会“横向挖掘”各个领域的关联，通过冷冻电镜观测RNA的先进技术，解决现代医学的重要问题。谈到选题的诞生，他说道：“许多想法不是在办公室中凭白产生的”。读文献，帮助回顾已有的进展，而参与学术会议则是想法碰撞的重要机遇，“在交流中我们也会寻找与各个学科领域的合作关系”。“足球”，是生活之至乐所在为各学院老师所公认的，除了苏老师的科研水平，还有他精湛的“球技”。足球，是苏昭铭工作之余必不可少的娱乐方式。苏昭铭对足球的热爱要从学生时代说起，他从小对球类运动充满兴趣，足球则逐渐更成了他在科研工作之余寻找“乐子”，放松自我的不二选项。“科研工作者与其他工作所最不相同的，大概就是‘无时无处不在思考’”，苏昭铭老师笑称，“运动帮我们保持更好的身体和心理状态”。来到华西后，苏昭铭在球场结识了同样热爱足球的同事朋友，带领组建了华西国重教职工球队。每周两次的足球训练，“踢着踢着就成了习惯”，足球成为苏昭铭生活的一部分。在第二届川大教职工足球联赛中，苏昭铭所在的华西国重教职工球队获得冠军，而他也在比赛中获得“最佳射手”的称号。实验室或绿茵场，苏昭铭在科研与生活中找到自己的平衡；奔跑或思考，他似乎永远专注而充沛地，进行无止境的探索。未来，苏老师将带领课题组，继续应用冷冻电镜的技术，探索生物RNA的结构与功能，为基础医学的认知与药物疗效验证提供新的思考！

p　　据多家媒体报道，近日深圳国家感染性疾病临床医学研究中心/南方科技大学第二附属医院(深圳市第三人民医院)与南方科技大学联合，从临床新冠肺炎病例获取生物样本，首次使用冷冻电子显微镜观察到了新冠病毒经灭活后的真实形貌，为新冠病毒的识别、鉴定和临床相关研究提供重要的超微影像基础。该成果于当地时间3月5日发布在生物领域最大的预印本发行服务BioRxiv上。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 438px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/e56da9e8-77a3-4141-8baa-f58fd3a4ccf4.jpg" title="微信图片_20200306161804.png" alt="微信图片_20200306161804.png" width="600" height="438" border="0" vspace="0"//pp　　据介绍，联合研究团队依托深圳市第三人民医院生物安全III级实验室条件，在1月27日从1名新冠患者肺泡灌洗液中分离出病毒株，并迅速完成基因组测序和鉴定，及时向全球流感信息共享平台(GISAID注册编号：EPI_ISL_406594)注册共享信息，把其命名为“BetaCoV/Shenzhen/SZTH-003/2020”的新冠毒株。随后进一步完善了实验室病毒扩增、纯化及灭活技术，并综合应用间接免疫荧光法 (IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、和基因组序列与谱系分析多种方案核实和确认灭活的新冠病毒。/pp　　随后，南方科技大学冷冻电子显微镜中心的专家，利用冷冻电子显微镜分析技术，不仅首次观察到了真实的新冠病毒经灭活后的形貌，并且捕捉到了该病毒侵染宿主细胞中的一个重要中间状态。此时病毒正处于识别和附着宿主细胞后，准备与细胞发生融合的时期。经国内外文献检索，这是新冠肺炎疫情爆发以来，科研工作者首次在冷冻电子显微镜下观察到新冠病毒全病毒的真实形貌。据悉，联合研究团队现正在进一步揭示新冠病毒超微结构、病毒侵染人类宿主细胞的特性、与新冠肺炎临床预后关系。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 402px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202003/uepic/3d5dc27d-3b21-4a28-85f0-29045869d5d8.jpg" title="微信图片_20200306162052.png" alt="微信图片_20200306162052.png" width="600" height="402" border="0" vspace="0"//pp　　目前，在深圳市的大力支持下，联合研究团队正在打造高等级生物安全临床冷冻电子显微镜研究平台，全力推进新冠病毒以及其他致命性病毒的超微结构生物学研究，为传染病病原鉴定、公共卫生突发事件防控和潜在的抗体、疫苗和新药研发提供坚实的科学基础。/ppbr//p

据清华大学新闻网消息，1月21日，由清华大学生命科学学院李赛实验室和奥地利Nanographics公司、沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科学技术大学伊万维奥拉团队合作的新冠病毒高清科普影像问世。在纳米尺度的图像上，平均直径约为100纳米的新冠病毒像一颗奇异的星球，表面分布着硕大的、可以自由摆动的刺突蛋白“触手”。在“星球”内部，超长的核糖核酸(RNA)链致密缠绕在有序排列的核糖核蛋白复合物(RNP)上。　　刺突蛋白像一把“钥匙”，细胞上的ACE2受体则像一把“锁”。最新3D影像展示了新冠病毒入侵人体细胞之初的瞬间：在接触细胞的刹那，新冠病毒与受体结合，并与细胞膜发生了膜融合。李赛表示，此前发布的新冠病毒假想3D模型存在不少错误，比如刺突蛋白的数量、分布、相对病毒的尺寸比例不对。而本次病毒形象的每一个细节都基于由李赛团队解析的全病毒结构设计，尽最大程度尊重了前沿科研发现。　　在研究中，李赛团队发现新冠病毒的刺突蛋白分布随机且具有柔性，可以像链锤一样在病毒表面自由摆动甚至游走，这在囊膜病毒中还是首次发现。刺突蛋白摆动的特征会让新冠病毒在攻击细胞时更具灵活性，有利于刺突蛋白同细胞上的ACE2受体结合，这可能是它高传染性的原因之一。　　据悉，早在去年，国际权威学术期刊《细胞》杂志就在线发表了清华大学生命科学学院李赛实验室与浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室李兰娟院士课题组的合作成果。他们利用冷冻电镜断层成像和子断层平均重构技术成功解析了新冠病毒的全病毒三维结构。　　冷冻透射电镜是目前结构生物学广泛使用的科研利器，它以电子为“光源”穿透病毒样品，以获得病毒内部的结构信息。在清华大学的实验室中，灭活新冠病毒被置于冷冻电镜下，每旋转3°拍摄一张照片，总共拍摄41张，随后进行立体重构，就像给病毒做“全身CT检查”。　　李赛团队还向病毒内部“打手电”，穿过囊膜，清晰地照亮了病毒内部核糖核蛋白复合物的排列结构，展示出迄今为止最完整的新冠病毒形象。审稿人在评审意见里称赞道：“这项工作展示了迄今为止我所见过的最完整新冠病毒形象，这也是使用冷冻电镜断层成像方法解析完整颗粒结构的一次绝妙的应用。”

p style="text-indent: 2em text-align: left "strongspan style="text-indent: 2em "仪器信息网讯/span/strongspan style="text-indent: 2em " 2月19日凌晨，西湖大学浙江省结构生物学研究重点实验室（施一公任主任）研究团队的鄢仁鸿（一作）、周强（通讯作者）等在预印版平台bioRxiv上线最新研究成果：利用冷冻电镜技术，成功解析新冠病毒受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的全长结构。span style="text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) "成果对抗疫特效药研发具有重大指导意义，这也是全球首次成功解析ACE2的全长结构。/span/span/pp style="text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em "img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 342px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/4b257d5c-8236-478c-93f3-907498318ef9.jpg" title="00.png" alt="00.png" width="600" height="342" border="0" vspace="0"//span/pp style="text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) "（注：预印本网站bioRxiv的所有论文未经同行评议）/span/pp style="text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) "几天前，2月15日/spanspan style="text-indent: 2em color: rgb(0, 0, 0) "，/spana href="https://www.instrument.com.cn/news/20200217/522050.shtml" target="_blank" style="color: rgb(84, 141, 212) text-decoration: underline "span style="color: rgb(84, 141, 212) "美国卫生总署(NIH)与美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组合作在预印本平台bioRxiv上发表论文，报道了新冠病毒（2019-nCoV）S蛋白的首个冷冻电镜结构。/span/a/pp style="text-indent: 2em "血管紧张素转换酶2（ACE2）是SARS冠状病毒（SARS-CoV）的表面受体，与刺突糖蛋白（S蛋白）直接相互作用。 ACE2也被认为是新冠状病毒（2019-nCoV）的受体，表现为严重的呼吸综合征。 B0AT1（SLC6A19）是中性氨基酸转运蛋白，其在肠道细胞中的表面表达需要ACE2。 发表成果中，西湖大学研究团队成功解析了与B0AT1结合的全长人ACE2的2.9埃分辨率冷冻电镜结构。 该复合物组装成ACE2-B0AT1异二聚体的二聚体，由于ACE2的肽酶结构域（PDs）转移，显示出开放和封闭的构象。 ACE2上新解析的类集合域（CLD）介导了同源二聚化。 结构建模表明ACE2-B0AT1复合物可以同时结合两个S蛋白，为冠状病毒识别和感染的分子基础提供了重要线索。/pp style="text-indent: 2em "strongACE2/strong主要生理作用是促进血管紧张素的成熟，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在。但当病毒入侵时，ACE2就被病毒“绑架”了。ACE2是SARS冠状病毒和人类冠状病毒NL63的受体，可以说是多数冠状病毒侵入人体的关键。/pp style="text-indent: 2em "strong西湖大学研究团队称/strong：“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人体的过程中，ACE2就像是‘门把手’，病毒抓住它，从而打开了进入细胞的大门。”/pp style="text-indent: 2em "ACE2全长结构的解析，对于后续疫苗和抗病毒药物的研发，无疑提供了重要的结构生物学数据支撑。/pp style="text-indent: 2em "根据西湖大学公布的资料，ACE2的全貌如下：/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/noimg/8d748624-c69c-46dc-8357-e206d6d1b33a.gif" title="bf26资料图.gif" alt="bf26资料图.gif"//pp style="text-indent: 2em "上面的蓝色和灰白色部分，是ACE2的两个结构PD（肽酶结构域）和CLD（样域），但ACE2很难在体外稳定获得，常常是与肠道内的一个氨基酸转运蛋白B0AT1打包一同出现。/pp style="text-indent: 2em "strong西湖大学研究团队给出假设/strong：这个复合物极有可能稳定住ACE2，并通过共表达的方法，能够获得优质稳定的复合物，就构成了上面这种X形状。/pp style="text-indent: 2em "在确定了ACE2的这种特殊存在形态后，就在冷冻电镜下解析了它的三维结构：/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 538px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/892b1c38-aa26-4f48-a8a5-9009ef1ddfad.jpg" title="1.png" alt="1.png" width="450" height="538" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) "分辨率为2.9埃的ACE2三维结构图/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 315px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/6193d14b-1fc4-455a-8b2e-28927a0b1189.jpg" title="2.png" alt="2.png" width="450" height="315" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-indent: 2em "整/spanspan style="color: rgb(0, 176, 240) text-indent: 2em "个ACE2的结构图/span/pp style="text-indent: 2em "研究团队称，这一研究揭示了二聚体组装中全长ACE2的高分辨率结构。 建模分析表明，冠状病毒的两个S蛋白三聚体同时与ACE2二聚体结合。本研究的结构为阐明2019-nCoV感染的机制提供了一个重要的框架，并可能促进潜在疗法的发展。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 300px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/5098d370-0dd0-44d9-a878-7b7120e1e300.jpg" title="3.jpg" alt="3.jpg" width="450" height="300" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) "第一作者鄢仁鸿（左）与通讯作者周强（右）/span/pp style="text-indent: 2em "这项研究中，西湖大学的冷冻电镜和超级计算机中心分别提供了冷冻电镜和计算支持。并获得国家自然科学基金（项目31971123，81920108015，span style="text-indent: 2em "31930059）和浙江省重点研发计划（2020C04001）的资助。/span/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-size: 18px "strong▊关于浙江省结构生物学研究重点实验室/strong/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 333px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/c1dc0fa7-335f-48e8-9d1a-4addcb741fec.jpg" title="4.jpg" alt="4.jpg" width="450" height="333" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em "浙江省结构生物学研究重点实验室是西湖大学第一批获准成立的浙江省重点实验室之一。/pp style="text-indent: 2em "strong研究内容和方向/strong：旨在建设一个能够引领世界结构生物学研究方法和技术发展的重点实验室。实验室将围绕重要的生物学问题和技术需求，以冷冻电子显微学为核心（包括单颗粒冷冻电子显微镜三维重构、冷冻电子显微镜断层成像、冷冻电子显微镜交叉学科发展三个研究方向），以X-射线晶体学、化学生物学、蛋白质设计、分子动力模拟等相关学科为助力，充分发挥各前沿学科的优势，探索出一套高效的多学科人才合作研究新机制，开发出若干具有我国自主知识产权的革新技术与软件算法，取得一系列具有里程碑意义的结构生物学原创成果，促进浙江省乃至我国在相关领域内基础研究力量和创新能力的提升，以及相关研究成果的转化。/pp style="text-indent: 2em "strong人员构成/strong：国际著名结构生物学家、中国科学院院士、西湖大学校长施一公教授任实验室主任。中科院上海生科院植物生理生态研究所研究员张鹏教授任学术委员会主任。全球范围内遴选的多名优秀青年科学家担任重点实验室骨干。/pp style="text-indent: 2em "strong发展方向/strong：实验室将整合多学科优势，积极推进基础科研应用和后期成果转化，在未来5-10年开发一系列具有深远影响的结构生物学新成果新技术，促进浙江省生物技术、生物制药等相关产业的发展。/pp style="text-indent: 2em " /pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(0, 112, 192) "论文链接/span：a href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.17.951848v1" target="_blank" style="color: rgb(127, 127, 127) text-decoration: underline "span style="color: rgb(127, 127, 127) "https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.17.951848v1/span/a/p

p　　随着电子检测和图像处理技术的突破，近年来，电子冷冻显微镜(cryo-EM)已实现了对蛋白质结构更高精细度的图像分析。但是目前想获得蛋白质中高分辨率的单原子冷冻电镜图像还很困难。5月底英国剑桥医学研究委员会分子生物学实验室和德国马克斯· 普朗克生物物理化学研究所两个实验室分别在预印本网站bioRxiv发表论文报告了冷冻电镜产生了迄今为止最清晰的图像，并且首次识别出了蛋白质中的单个原子，巩固了冷冻电镜作为绘制蛋白质3D形状的主要工具的地位。/pp　　为了让冷冻电镜达到原子分辨率，两个团队研究了一种名为去铁蛋白的蛋白质。由于其稳定性，这种蛋白质已经成为冷冻电镜的试验台：该蛋白质结构之前的纪录分辨率为1.54× 10sup-10/sup米。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/3bb0bc38-c960-48db-bcb5-b9b02f3a8c37.jpg" title="铁蛋白Pic.jpg" alt="铁蛋白Pic.jpg"//pp style="text-align: center "strong去铁蛋白相关电镜图片/strong/pp style="text-align: right "span style="font-size: 14px "strong图片来源：论文/strongspan style="background-color: rgb(255, 255, 255) color: rgb(19, 19, 19) font-family: " gill="" sans="" letter-spacing:=""Single-particle cryo-EM at atomic resolution/span/span/pp　　随后，研究小组通过技术改进，拍摄到了更清晰的去铁蛋白照片。领导了德国该项目研究的生物化学家和电子显微镜学家Stark研究小组得到了这种蛋白质的1.25× 10sup-10/sup米结构，提高了所得图像的分辨率。英国团队获得的1.2× 10sup-10/sup米结构非常完整，领导了该项目的结构生物学家Scheres说，他们可以分辨出蛋白质和周围水分子中的单个氢原子。/pp　　Scheres和同事Aricescu还测试了对一种名为GABAA受体的蛋白质的简化形式的改进。这种蛋白质位于神经元膜，是全身麻醉剂、焦虑药物和许多其他药物的靶标。去年，Aricescu团队使用冷冻电镜将该蛋白质定位到2.5× 10sup-10/sup米。但使用新的试剂盒，研究人员获得了1.7× 10sup-10 /sup米分辨率。Aricescu说：“这就像在你的眼睛上剥去一层模糊的东西。在这个分辨率下，每0.5× 10sup-10/sup 米就打开了一个完整的宇宙。”/pp　　原子分辨率图足够精确，可以在约为1.2× 10-10米的分辨率下清楚地分辨出蛋白质中单个原子的位置。这些结构对于理解酶是如何工作的，以及利用这些见解来识别能够阻止其活性的药物特别有用。/pp　　Scheres说，这些突破可能会巩固冷冻电镜作为大多数结构研究首选工具的地位。但Stark认为，X射线晶体学仍保留一些吸引力。如果一种蛋白质可以结晶，那么它就能在很短时间内相对高效地生成与数千种潜在药物相结合的结构，不过仍然需要数小时到数天的时间，才能为极高分辨率的低温电磁结构生成足够的数据。/ppbr//pp　　相关论文：/ppspan style="background-color: rgb(255, 255, 255) color: rgb(19, 19, 19) font-family: " gill="" sans="" font-size:="" letter-spacing:=""/span/pp　　a href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.22.110189v1.full-text" target="_blank"Single-particle cryo-EM at atomic resolution/a/pp　　a href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.21.106740v1.full-text" target="_blank"Breaking the next Cryo-EM resolution barrier – Atomic resolution determination of proteins!/a/p

目前冷冻固定是固化细胞成分而不导致显著结构变化的唯一途径，而高压冷冻仪能够捕捉精细结构和细胞动力学的错综变化。高压冷冻结合光刺激是您发现奥妙的平台：同步到毫秒的冻结和刺激能够冻结您最感兴趣的那一刻 以纳米尺度和毫秒时间精度冻结和解析高动态过程在高压下冷冻固定您的含水样品，并发现世界的秘密为什么采用光刺激？同步光刺激和高压冷冻让您能够以纳米级的分辨率和毫秒级的精度来查看高动态过程或光敏样本的结构变化。这将为生命科学和工业领域的研究人员带来新的可能性。将光刺激施加在任何光敏化合物上，例如洗剂、化妆品或食品以及光活化的样本（如蛋白质或各种生物样本）推动我们对高动态过程（如突触神经传递）的理解。左： 冻结的防晒乳液，奥地利维也纳自然资源和生命科学大学 d. pum 教授和奥地利维也纳徕卡显微系统 c. tomova, s. mimietz-oeckler | 右：对称突触，德国柏林夏丽忒大学医学院 shuwen chang 医生为什么采用徕卡 em ice？因为它是唯一能够以毫秒尺度冻结动态现象的工具因为它是唯一完全集成了光刺激的高压冷冻仪因为它的功能为生命科学和工业领域的研究人员带来新的可能性因为它是唯一一款允许冷冻 9 个后续样本的高压冷冻仪因为它是唯一一款能够为您提供最舒适操作的高压冷冻仪选择徕卡 em ice；因为它是您在您的领域找到颠覆性发现的平台。新工具，新视角。五种颜色蓝光、紫外光、绿光、红光和琥珀光：您可以使用不同波长的 5 种 led 模块来激发您的样本。光刺激的完全整合造就了光脉冲之间的精确关系（即从刺激到冻结时间）只需一次点击即可将 led 模块连接到仪器。每个模块都具有不同的波长，并自动由软件识别，记录在日志文件中专注于您的样本您只需一步操作即可在徕卡 em ice 中加载样本。当您关上装载台的盖子时，就会触发完美对齐的卡盒组件和冷冻过程不需要额外的操作：加样和冷冻过程完全自动化在实际冻结前一秒钟您都可以观察和处理样本提高效率使用徕卡您可以快速、高效地工作。从冷冻循环中恢复只需要一分钟 - 无需等待样本储存杜瓦以 ln自动重新填充 无需维护 使用 3 个可容纳多达 3 个不同样本的位置执行多达 9 次连续冷冻循 选择每个位置的样本数量，可编程旋转并区分样本和条件ln杜瓦瓶自动排干无需操作灵活并可随时升级徕卡 em ice 为您带来您所需要的研究灵活性。定义您的显微镜配置徕卡 s6 e或徕卡 m80和环境控制（装载站、工作台和室内温度控制）随时升级仪器成光刺激模式可随时在您需要的时候升级环境设置（工作台加热和/或环境室）所有的升级（光刺激模块和环境设置）可以直接由徕卡服务团队在您实验室完成。您并不需要将仪器返回工厂。环境责任我们的电子显微镜样品制备系统不仅符合最高的技术和人体工学的需求，而且其设计对环境影响最小。每天的 ln消耗量（包括设备冷却）仅为 30 升，这比以前的机型大约少了 65%冷却过程中 ln 的消耗量比之前的机型减少了大约 70%压力和冷却同步不需要使用酒精或其它液体徕卡 em ice 采用可持续包装：多次使用包装箱，内含在工厂中运输以及送货给客户的过程中使用的斜坡道。该包装于 2014 年 11 月被授予“智能包装”奥地利国家奖。我们采取负责任的行动，并在 2015 年获得了 din en iso 14001 环境管理认证。开发徕卡 em ice 的团队在 em 样本制备方面拥有合计 145 年的经验他们团结合作，共享一个愿景为您的工作提供完美的仪器！

我国海洋领域首个冷冻电镜中心建成，目前已全面对外开放共享，为用户提供样品制备、数据解析等服务。冷冻电镜也称低温电子显微镜，是一种能够对生物样品实现高分辨三维结构解析的高精尖设备。“如果说天文望远镜观测的是极宏观的天体，那么冷冻电镜则是针对极微观的生物大分子，观测水平达到十分之一纳米（百亿分之一米）级别。” 海洋试点国家实验室冷冻电镜中心主任沈庆涛教授说，冷冻电镜技术目前还非常新颖，但已经在生物学领域产生了极大影响，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”的技术。自2013年开始，冷冻电镜成为诸多诺奖级论文成果的得力助手。海洋试点国家实验室建设的冷冻电镜中心，是山东省首个冷冻电镜中心，也是我国乃至全球首个聚焦海洋生命科学的冷冻电镜中心。“生命来源于海洋，但目前国内外对陆地生物的研究比海洋生物更全面更系统，冷冻电镜的工作也多集中在陆地模式生物上。” 沈庆涛介绍，针对生命科学回归海洋的趋势，充分发挥海洋试点国家实验室的“向海”特长，他们建立了海洋领域首个冷冻电镜中心，以海洋生物为研究目标，推动海洋生物学从宏观走向微观，从生态、细胞水平走向分子水平。为了保证冷冻电镜的高分辨率解析能力，海洋试点国家实验室同时配备了冷冻电镜中心环境适配系统。“冷冻电镜设施昂贵精密，对于每个样品通常需要花费2-3天拍摄成千上万张照片，提取近百万生物大分子颗粒进行后续的图像处理。” 沈庆涛表示，在此过程中，环境适配系统能够对温度、湿度、磁场、震动等因素进行控制并适配，从而保证冷冻电镜自始至终状态稳定。

7月4日，清华大学-北京大学生命科学联合中心青山湖平台挂牌暨2022年暑期学校启动及水木未来冷冻电镜项目投用仪式在青山湖科技城举行。清华大学校长助理、清华大学-北京大学生命科学联合中心主任王宏伟，西湖大学校长助理王廷亮，北京大学生命科学学院副院长、教授高宁，清华大学生命科学学院副院长欧光朔，杭州城西科创大走廊党工委委员、管委会副主任施黄凯，临安区领导杨泽伟、陈立群、蔡萌、裘凯，以及临安区有关部门、清华大学、北京大学、浙江大学等高校师生参加活动。活动现场青山湖科技城是浙江建设科技强省和创新型省份的重大工程，也是杭州城西科创大走廊的重要一极。自成立之初起，青山湖科技城就高度重视科技创新，集聚了36家科研院所，拥有众多共享仪器设备和研发平台；近年来，更是聚焦高端装备制造、未来微电子、新材料等领域，打造成为城西科创大走廊“硬科技”创新策源地。水木未来冷冻电镜项目投用仪式在杭州市临安区政府推动下，水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”设立于青山湖科技城，旨在建立全球最大的冷冻电镜平台和生物大分子高精度结构数据库，面向全球科研机构和创新药企提供服务和创新疗法共同开发；与清华大学和国内外顶级科研机构合作，提升基础科研水平，整合基础研究、技术开发和成果转化，打造全球化结构与AI药物创新发现基地。水木未来源自清华，是一家基于冷冻电镜和AI的精准创新药和疗法研发企业，拥有亚太区第一个商业化冷冻电镜服务平台，在小分子、抗体药、RNA药物、蛋白降解、基因治疗等领域，助力全球创新药企药物研发。经过一年的紧张筹备，水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”在青山湖科技城投用。参观水木未来冷冻电镜实验室目前，6台300kV高配电镜已就位，结合自主研发的AI驱动的新一代电镜结构解析和建模软件平台、GraFuture™ 石墨烯载网冷冻制样技术，水木未来青山湖基地在推动冷冻电镜效率、分辨率和产业化方面，又向前迈出一大步。据青山湖科技城管委会相关负责人介绍，该项目的投用，将有力提升科技城乃至临安、城西科创大走廊的生物医药创新研发水平，并加快生物医疗领域产业集聚，助力城西科创大走廊打造生命健康产业创新策源地，以“结构+计算”助力加速全球创新药物发现。会议期间，与会人员参观了水木未来冷冻电镜项目实验室、青山湖科技城规划展览馆，并举行了政校深化合作座谈。笔者注：据了解，此次在青山湖科技城投用的水木未来冷冻电镜研发平台，规划了20台高规格300KV冷冻电镜，不久的未来还将引入用于原位高分辨解析的新型高端电镜。水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”一期正在装机6台300KV新型高端冷冻电镜、2台200KV冷冻电镜，旨在建立全球最大的冷冻电镜平台和生物大分子高精度结构数据库，推动新一代AI精准化药物和疗法的源头创新。据悉，电镜平台综合实验室由上海音宁电子科技有限公司设计施工一体化建设。有关负责人透露，全球已有多家顶尖实验室表达合作意愿。

p style="text-indent: 2em "strong style="text-indent: 2em "仪器信息网讯/strongspan style="text-indent: 2em " 2月19日（美国时间），美国卫生总署(NIH)与美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组首次利用冷冻电镜解析新冠病毒刺突蛋白分子结构的成果在《Science》上发表，该研究已于/spanspan style="text-indent: 2em text-decoration: underline "a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200217/522050.shtml" target="_blank" style="color: rgb(0, 112, 192) "span style="text-decoration: underline text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) "2月15日发表在预印本网站bioRxiv/span/a/spanspan style="text-indent: 2em "，并快速通过同行审议发表于《Science》期刊。该成果将对开发新冠疫苗提供帮助。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 239px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/794c954f-0ee6-4f4f-a0d1-b640cc39ded3.jpg" title="1.png" alt="1.png" width="600" height="239" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "▊ strong style="text-indent: 2em "研究背景/strong/span/pp style="text-indent: 2em "此前多项研究从不同角度证实，新冠状病毒（2019-nCoV）感染人体细胞的方式与SARS-CoV类似：利用span style="color: rgb(0, 112, 192) "刺突蛋白（S蛋白）/span与span style="color: rgb(0, 112, 192) "ACE2受体/span作用来感染人体细胞，即新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2受体。/pp style="text-indent: 2em "于是，S蛋白和ACE2受体成为研究的两大关键目标，本次《Science》成果正是利用冷冻电镜技术解析了S 蛋白三维结构；而同一天（19日）a href="https://www.instrument.com.cn/news/20200219/522240.shtml" target="_blank" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "西湖大学周强团队预印版平台bioRxiv发表成果/span/a则是利用冷冻电镜技术解析了人ACE2受体三维结构。/pp style="text-indent: 2em "strong什么是S蛋白？/strong/pp style="text-indent: 2em "刺突蛋白（S蛋白）是疫苗开发、治疗性抗体和诊断方法的关键目标。根据S 蛋白的蛋白结构功能可以将其分成两个功能单位：S1和S2蛋白亚基。S1能够促进病毒结合到宿主细胞受体的能力，其含有一个重要的C端受体结合结构域（RBD），正是这个位置负责和受体结合。/pp style="text-indent: 2em "strong什么是ACE2受体？/strong/pp style="text-indent: 2em "血管紧张素转换酶2（ACE2）是SARS冠状病毒（SARS-CoV）的表面受体，与S蛋白直接相互作用。 ACE2也被认为是新冠状病毒（2019-nCoV）的受体，表现为严重的呼吸综合征。ACE2主要生理作用是促进血管紧张素的成熟，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在。但当病毒入侵时，ACE2就被病毒“绑架”了。/pp style="text-indent: 2em "西湖大学研究团队称：“在SARS病毒和‘新冠病毒’侵入人体的过程中，ACE2就像是‘门把手’，病毒抓住它，从而打开了进入细胞的大门。”/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong▊ 研究要点/strong/span/pp style="text-indent: 2em "strong1）新冠状病毒的S蛋白结构是疫苗应对的关键区域/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/noimg/30cffae4-c39e-4246-9782-b5482cd37733.gif" title="1.gif" alt="1.gif"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="text-indent: 2em color: rgb(0, 176, 240) "预融合构象中的2019-nCoV S的结构：/spanspan style="text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) "（A）2019-nCoV S一级结构示意图，按域着色；（B）具有向上构象的单个RBD的2019-nCoV S蛋白的预融合结构的侧视图和俯视图。/span/pp style="text-indent: 2em "2019-nCoV利用密集的S蛋白进入宿主细胞。S蛋白是一种三聚体I类融合蛋白，存在于亚稳态的预融合构象中，该构象经过剧烈的结构重排以使病毒膜与宿主细胞膜融合。当S1亚基与宿主细胞受体结合时，触发该过程。受体结合会破坏融合前三聚体的稳定性，导致S1亚基脱落，并使S2亚基转变为稳定的融合后构象。为了与宿主细胞受体接合，S1的受体结合域（RBD）经历了铰链状构象运动，该构象运动暂时隐藏或暴露了受体结合的决定因素。这两个状态分别称为“向下”构象和“向上”构象，其中向下对应于受体不可及的状态，向上对应于受体可及的状态，受体结合状态不太稳定，是抗体介入的较好目标。因此，预融合S蛋白结构的表征将提供原子水平的信息，并指导疫苗的设计和开发。/pp style="text-indent: 2em "strong 2）2019-nCoV具有与冠状病毒科相同的触发机制/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 249px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/f0fd5f19-1760-47df-8b75-c5c6cebfda7c.jpg" title="2.png" alt="2.png" width="450" height="249" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "2019-nCoV S蛋白的表达与纯化/span/pp style="text-indent: 2em "研究组制备获得了约0.5 mg / L的重组前融合稳定Sectodomain，并通过亲和层析和尺寸排阻层析将蛋白质纯化至均质（上图）。使用这种纯化的、完全糖基化的S蛋白进行冷冻电镜表征。/pp style="text-indent: 2em "收集并处理了3207张显微照片后，获得了一个3.5 埃分辨率的非对称三聚体的三维重构图像，其中一个RBD在此构象中被观察到。通过在cryoSPARC v2中使用3D可变性功能，我们观察到RBD经历了铰链状运动时S1亚基的呼吸（见以下视频），这可能是导致S1的局部分辨率较差（与稳定的S2亚基相比）。这种看似随机的RBD运动已在密切相关的β冠状病毒SARS-CoV和MERS-CoV以及更远相关的α冠状病毒猪流行性腹泻病毒（PEDV）的结构表征中捕获。在2019-nCoV S中对该现象的观察表明，它具有与冠状病毒科相同的触发机制，其中受体与暴露的RBD结合导致不稳定的3 RBD-up构象，并导致脱落S1和S2的重新折叠。/pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=1B199D4CA921B34B9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=5B1BAFA93D12E3DE&playertype=2" type="text/javascript"/scriptp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="color: rgb(0, 176, 240) "从侧面沿着病毒膜看2019-nCoV S三聚体/span/pscript src="https://p.bokecc.com/player?vid=E04E1CFC8919135A9C33DC5901307461&siteid=D9180EE599D5BD46&autoStart=false&width=600&height=490&playerid=5B1BAFA93D12E3DE&playertype=2" type="text/javascript"/scriptp style="text-align: center text-indent: 0em "span style="color: rgb(0, 176, 240) "从顶部朝病毒膜方向看2019-nCoV S三聚体/span/pp style="text-indent: 2em "因为S2亚基是一个对称的三聚体，研究者对其进行了3D优化，增加了C3的对称性，得到了一个3.2 埃分辨率的图，S2亚基的密度非常好。利用这两种图谱，构建了大部分2019-nCoV S胞外域，包括每个三聚体的66个N联糖基化位点中的44个的聚糖(见下图)。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 275px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/8ee887a6-0ebf-4c8f-aebf-9b531c05d95c.jpg" title="3.png" alt="3.png" width="500" height="275" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="text-indent: 0em color: rgb(0, 176, 240) "冷冻电镜图和N-联糖基化位点：/spanspan style="text-indent: 0em color: rgb(127, 127, 127) "（A）经C3处理的2019-nCoV S的未锐化低温EM密度图的不对称单位显示为透明分子表面/span/pp style="text-indent: 2em "strong3）2019-nCoV的S蛋白与ACE2受体亲和力高于SARS-CoV：更易人传人？/strong/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/noimg/14e101df-d76e-4d41-add4-a3985d5af210.gif" title="4.gif" alt="4.gif"//pp style="text-indent: 2em "strong/strongbr//ppbr//pp style="text-indent: 0em text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) "2019-nCoV S以高亲和力结合人ACE2/span/pp style="text-indent: 2em "最近的报道表明2019-nCoV S和SARS-CoV S具有相同的功能宿主细胞受体-血管紧张素转换酶2 (ACE2)，这促使研究者通过表面等离子体共振(SPR)来量化这种相互作用的动力学。ACE2与2019-nCoV S外域结合，其亲和力约为15 nM，比ACE2与SARS-CoV S结合的亲和力高出10- 20倍(上图A)。研究者还制备了与2019-nCoV S胞外域结合的ACE2的复合物，并通过负染色电镜技术对其进行了观察，冷冻电镜高分辨观察发现（上图B），它与SARS-CoV S和ACE2之间形成的复合物非常相似。表明2019-nCoV S对人ACE2的高亲和力可能有助于使2019-nCoV S在人与人之间传播变得明显容易，但还需要更多研究来研究这种可能性。/pp style="text-indent: 2em "strong4）针对SARS-CoV的多克隆抗体不能与2019-nCoV结合/strong/pp style="text-indent: 2em "基于SARS-CoV和2019-nCoV之间的整体结构同源性和共同的受体，研究者测试了已发表的3种针对SARS-CoV RBD区域的多克隆抗体（S230、m396和80R），对其交叉反应性进行评估。结果显示此3种抗体在新冠病毒中完全没有结合力。表明针对SARS-CoV的多克隆抗体对于2019-nCoV不一定奏效。/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong▋小结/strong/span/pp style="text-indent: 2em "了解2019-nCoVS蛋白原子水平结构将有助于进一步的蛋白质工程研究，以改善抗原性和蛋白质表达，从而助力疫苗开发。这些结构数据也有助于评估2019-nCoV突变，该突变将随着病毒的遗传漂移而发生；并有助于确定这些残基是否有表面暴露，并映射到其他冠状病毒突变蛋白的已知抗体表位。此外，原子水平的细节将使设计和筛选具有熔合抑制潜力的小分子成为可能。这些信息将为精确疫苗设计和抗病毒治疗的发现提供支持，从而加速医学对策的发展。/pp style="text-indent: 2em "McLellan在接受新华社记者采访时表示，他们已将这一结构的原子坐标数据发送给全球多家实验室，其中多数来自中国，目前已有大约25家中国实验室要求获取相关资料。/pp style="text-indent: 2em "并表示，这一成果可帮助研究人员展开三个方面的工作。第一，展开潜在药物筛查，发现可与这种刺突蛋白结合并破坏其功能的小分子；第二，设计可以与刺突蛋白结合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗体；第三，设计出这种刺突蛋白的变体，例如使其拥有更高表达水平或热稳定性，从而诱发更强的免疫反应，以加快疫苗开发。/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strong附：研究中应用到的部分主要仪器设备/strong/span/pp style="text-indent: 2em "strong冷冻电镜/strong：配置K3相机（Gatan）的a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C14739.htm" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Titan Krios/span/a（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100537/" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Thermo Fisher/span/a）/pp style="text-indent: 2em "strong透射电镜/strong：配置Ceta 16M相机的FEI a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C11108.htm" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Talos TEM/span/a（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100537/" target="_blank" style="text-indent: 32px white-space: normal color: rgb(0, 176, 240) "Thermo Fisher/aspan style="text-indent: 32px "/span）/pp style="text-indent: 2em "strong冷冻制样设备/strong：Vitrobot Mark IV（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100537/" target="_blank" style="text-indent: 32px white-space: normal color: rgb(0, 176, 240) "Thermo Fisher/aspan style="text-indent: 32px "/span）/pp style="text-indent: 2em "strong生物大分子相互作用分析仪/strong：a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C273350.htm" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Biacore X100/span/a（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100324/" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "GE Healthcare/span/a）/pp style="text-indent: 2em "strong色谱柱/strong：Superose 6 10/300（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100324/" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "GE Healthcare/span/a）/pp style="text-indent: 2em "strong等离子清洗仪/strong：a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C234401.htm" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Solarus 950/span/a（a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/SH102493/agent_11714.htm" target="_blank" style="color: rgb(0, 176, 240) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 176, 240) "Gatan/span/a）/pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongspan style="color: rgb(0, 0, 0) "/spanbr//strong/spanbr//pp style="text-indent: 2em " /ppbr//p

p style="text-indent: 2em "strong style="text-indent: 2em "仪器信息网讯/strongspan style="text-indent: 2em " 2020年2月15日，美国卫生总署(NIH)与美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组合作在预印本平台bioRxiv上发表论文：Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation（span style="text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) "DOI: 10.1101/2020.02.11.944462/span），报道了新冠病毒（2019-nCoV）S蛋白的首个冷冻电镜结构，利用冷冻电镜技术分析了新型冠状病毒表面S蛋白的近原子结构。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 206px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/29be9fbf-7286-475f-807a-ea01b409b72a.jpg" title="1.png" alt="1.png" width="600" height="206" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(127, 127, 127) "（注：预印本网站bioRxiv的所有论文未经同行评议， bioRxiv在所有2019-nCoV相关论文页面增加了突出字体说明（上图黄底黑字）：“bioRxiv收到了许多关于2019年ncov冠状病毒的新论文。提醒一下:这些是没有经过同行评审的初步报告。他们不应被视为结论性的，指导临床实践/健康相关的行为，或在新闻媒体中作为既定信息进行报道。”）/span/pp style="text-indent: 2em "作者通过生物物理以及结构方面的证据发现，新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）的亲和力要远高于SARS-CoV的S蛋白，或解释了新型冠状病毒传染性很强的主要原因。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 322px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/4ad16a73-5442-4584-899c-bca9a93d4e04.jpg" title="2.png" alt="2.png" width="450" height="322" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " 预融合构象/spanspan style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "中的2019-nCoV S结构/span/pp style="text-indent: 2em "新型冠状病毒（2019-nCov）的爆发代表了一种流行病威胁，已宣布为国际关注的突发公共卫生事件。CoV突刺（S）糖蛋白是疫苗、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标。此前的大量研究均基于2019-nCoV突刺蛋白的预测结构或相关病毒（如SARS）的突刺蛋白的已知结构展开。为促进医学对策（MCM）的开发，论文中确定了预融合构象中的2019-nCoV S蛋白三聚体冷冻电镜结构，为3.5埃分辨率。三聚体的主要状态为三个受体结合结构域（RBD）之一向上旋转为受体可及构象。同时，生物物理和结构证据表明， 2019-nCoV S以比SARS-CoV S更高的亲和力结合ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）。此外，作者测试了几种已发布的SARS-CoV RBD特异性单克隆抗体，发现它们与nCoV-2019没有明显的结合。这表明两种病毒RBD之间的抗体交叉反应性可能受到限制。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 200px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/96b62197-7abe-467b-b461-e70a6a2a6f3f.jpg" title="3.png" alt="3.png" width="450" height="200" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "2019-nCoV S.和SARS/spanspan style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "-CoV S.之间的结构比较（A）/span/pp style="text-indent: 2em "span style="text-align: center text-indent: 0em color: rgb(0, 0, 0) "新型冠状病毒利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞。S蛋白经历结构变化将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜。此过程包括病毒的S1亚基结合到宿主细胞受体上，引发三聚体不稳定性的发生，进而造成S1亚基脱落S2亚基形成高度稳定的融合后结构。/span/pp style="text-indent: 2em "通过该结构分析，作者发现S1亚基中的RBD经历铰链类似运动，此移动特点与SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型管冠状病毒中则RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其S蛋白中3个RBP中的1个会向上螺旋突出从而让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。这也说明，新型冠状病毒引发病毒的机制虽然与其他的冠状病毒科的病毒机制异曲同工，但传染性更强。/pp style="text-indent: 2em "论文受到业界的广泛关注，研究中，John Ludes-Meyers博士对细胞转染给予很大帮助，德克萨斯大学奥斯汀分校Sauer结构生物学实验室的Aguang Dai博士在显微镜对准方面做了大量工作。/pp style="text-indent: 2em "论文链接：a href="https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml" target="_self" style="color: rgb(127, 127, 127) text-decoration: underline "span style="color: rgb(127, 127, 127) "https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml/span/a/p

6月29日，中国政府采购网发布《中国疾病预防控制中心公共卫生创新计划项目-病原冷冻电镜结构研究平台和高通量数字玻片成像系统公开招标公告》，中国疾病预防控制中心拟以9260万元人民币采购一批仪器设备，包含300kv冷冻透射电子显微镜1台（套），200KV冷冻透射电子显微镜1台（套），冷冻双束电镜1台（套），120kv透射电子显微镜1台（套），工作站1台（套），高压冷冻仪1台（套），冷冻电镜投入式冷冻制样设备2台，辉光放电仪1台（套），等离子清洗仪1台（套），真空离子溅射仪1台（套），正置荧光显微镜 （FIB光电联用光镜）1台（套），倒置荧光显微镜1台（套），液氮罐1台（套），高通量数字玻片成像系统1台（套）。以上仪器均接受进口产品。采购需求：包号品目号品目名称数量（台/套）是否接受进口产品分包预算金额（人民币万元）备注11-1300kv冷冻透射电子显微镜1是9000非单一产品采购包核心产品1-2200KV冷冻透射电子显微镜1是1-3冷冻双束电镜1是1-4120kv透射电子显微镜1是1-5工作站1是1-6高压冷冻仪1是1-7冷冻电镜投入式冷冻制样设备2是1-8辉光放电仪1是1-9等离子清洗仪1是1-10真空离子溅射仪1是1-11正置荧光显微镜 （FIB光电联用光镜）1是1-12倒置荧光显微镜1是1-13液氮罐1是22-1高通量数字玻片成像系统1是260单一产品采购包交货期合同签订后12个月内交货地点/项目现场中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所指定地点用途实验备注：本项目采购标的对应的《中小企业划型标准规定》所属行业为：工业采购标的需满足的质量、安全、技术规格、物理特性等要求：第1包 品目1-1 300kv冷冻透射电子显微镜一、技术参数：1、分辨率 ▲1.1、信息分辨率：≤0.12nm1.2、点分辨率：≤0.25nm1.3、线分辨率：≤0.14nm2、电子枪2.1、采用场发射电子枪2.2、使用寿命≥1年2.3、束斑漂移：≤0.5nm/min （10分钟内平均束斑漂移）2.4、亮度：≥7.5*107 A/m2srV2.5、辐射安全：≤0.5uSv/hr@距离0.1米电子枪3、加速电压3.1、最高加速电压：≥300kV3.2、在80kV至300kV间加速电压连续可调4、照明系统4.1、完全平行光系统，可实现多模式照明，在TEM模式中对大视野和可变视野都能够平行照明。▲4.2、线性畸变≤0.5% (TEM模式在18k×和155k×放大倍数之间)5、控制系统：控制软件具备应用脚本软件，用户可自行编写程序控制电镜进行特定或某些复杂的实验。6、真空系统：无油真空系统。7．放大倍数7.1、TEM模式放大倍数范围100×-700,000×7.2 在任何放大倍数实现完全无旋转成像8、物镜8.1、相机长度范围：300mm-2,500mm8.2、焦距≥3.5mm 8.3、物镜极靴间距≥10mm8.4、球差系数：≤3mm8.5、色差系数：≤3mm8.6、物镜光阑：70um、100um9．样品台系统9.1、计算机控制≥4轴样品台9.2、X/Y轴行程≥2mm9.3、Z轴行程≥0.4mm9.4、最大倾斜角度：不少于±70°9.5、最大图像漂移：X/Y方向 ≤1μm(+/- 70°内倾转)9.6、重复性：≤ 400nm(3次重复测试 ) 10. 自动进样系统10.1、一次能够装载≥10个样品，并能够自动更换和转移样品，所有样品均可回收并重复使用。10.2、待用样品在低温样品停泊装置保持在冷冻状态≥120小时。10.3、能够自动补充液氮。10.4、冰生长率：≤1%/24小时 (透射信息损耗)10.5、最低温度：≤-170 ℃10.6、样品交换后漂移：交换40分钟后：≤0.035nm/s▲10.7、同一样品在镜筒内可以保持在冷冻状态，连续收集数据时间≥72小时。11、电镜操作 11.1、具有低剂量曝光功能。11.2、可设置多个用户的等级，每个用户之间的参数 设置相对独立。11.3、要求电镜安装所需房间高度≤4m。12、直接电子探测系统 12.1、像素数≥4000×4000像素。12.2、像素大小≥5μm12.3、电子计数读出模式下量子转化效率（300kV）：0 Nyquist，DQE≥ 0.85；1/2 Nyquist，DQE，≥ 0.65；1 Nyquist，DQE≥0.25。 12.4、超分辨读出模式下，最大画幅≥10000×8000像素。12.5、辅助相机：可伸缩式；采集矩阵≥4K×4K, 像素物理尺寸≥5μm。12.6、原厂集成数据采集软件。12.6.1、能够自动进行单颗粒数据收集包括自动扫描整个样品、测定冰层厚度、进行低剂量数据收集。12.6.2、能够进行自动化电子断层扫描数据采集。13、能量过滤器探测系统 (300kV)13.1、温度稳定性（狭缝漂移/24h）：≤1.5ev13.2、能量狭缝最小宽度：≤2ev13.3、图像几何畸变：≤0.5%13.4、图像色差畸变：≤0.4%13.5、探测器内部帧率：≥200fps14、相位板系统14.1、对比度增强≥140%14.2、采用无孔相位板系统14.3、可自动加热恢复14.4、可用区域≥80%14.5、相位偏转：40-80nC剂量时，≥0.2πRad二、主要配置：1、300kV冷冻电镜主机：1套2、直接电子探测器：1套（含辅助相机）3、能量过滤器系统：1套4、三维重构软件：1套 5、相位板：1个6、备用场发射灯丝：1根7、冷冻电镜配套UPS电源（断电情况下维持一小时）：1台 8、冷冻电镜上样专用耗材：1000套三、验收和培训1、工作流验证工作：采用标准样品，达到出厂要求。2、10天应用专家现场培训。3、根据项目进展情况进行安装。安装调试完成，符合厂家性能参数验收标准，培训后2个月内，用户进行验收，验收合格后开始计算质保期。 4、供货周期：合同签订后12个月内。5、质保期：3年（包括电镜主机，包括相机，循环水机和空压机）。6、负责电镜安装场地（≤80㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-2 200KV冷冻透射电子显微镜一、技术参数：▲1、信息分辨率：≤0.23nm。2、加速电压2.1、最高加速电压：≥200kV2.2、加速电压通过软件控制切换2.3、高压稳定性：≤1ppm/10min3、电子枪3.1电子枪类型：场发射超亮型电子枪，使用寿命≥1年▲3.2 束流：≥0.5nA@1nm束斑4、放大系统4.1 放大倍数：低倍≤100倍；高倍≥650,000倍 4.2 相机长度范围：250mm-2.5m5、真空系统5.1、采用无油真空系统，由机械泵、涡轮分子泵和离子泵等构成5.2、真空度：电子枪真空度≤5 x10-7 Pa；样品区真空度≤2.7 x10-5 Pa6、物镜6.1、球差系数：≤3mm6.2、色差系数：≤3mm7、自动进样系统7.1 一次能够装载和更换≥10个样品，并能够自动更换和转移样品。待用样品在低温样品停泊装置保持在冷冻状态连续无污染存放时间≥72小时。样品可以回收和重复使用。7.2、能够自动补充液氮。7.3、冰生长率：≤5%/24小时 (透射信息损耗)7.4、最低温度：≤-170 ℃7.5、样品交换后漂移：交换60分钟后，≤0.05nm/s8、样品台 8.1、X/Y轴行程：不少于±1mm；8.2、Z轴行程：不少于±0.35mm；8.3、最大倾斜角度：不少于±70°；9、直接电子探测系统 9.1、像素矩阵≥4000×4000像素9.2、像素大小≥5μm9.3、超分辨读出模式下，最大画幅≥ 10000×8000像素9.4、原厂集成数据采集软件。9.4.1、能够自动化地进行单颗粒数据收集——自动扫描整个样品，测定冰层厚度，进行低剂量数据收集。9.4.2、能够进行自动化的电子断层扫描数据采集。10、相机系统10.1、像素数≥4000 ×4000像素10.2、像素大小≥10μm10.3、读取速率：≥1 fps@4kx4k；≥25 fps@512x51211、电镜操作11.1、具有低剂量曝光功能。11.2、可设置多个用户等级，每个用户之间的参数设置相对独立。二、主要配置：1、200kV冷冻电镜主机：1套2、直接电子探测器系统：1套3、相机：1套4、备用场发射灯丝：1根 5、配套UPS电源（断电情况下维持一小时）：1套6、三维重构软：1套 7、电镜主机配套操作和数据收集软件:1套三、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤60㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-3 冷冻双束电镜一、设备用途： 用于冷冻电子断层三维重构样品的制备工作。二、技术参数1、电子源： 1.1、肖特基场发射电子枪；1.2、使用寿命：≥9个月；1.3、束流范围：1.5pA-300nA；1.4、加速电压范围：500V-30kV；▲1.5、冷冻状态分辨率（冷台）：≤6nm@ 2kV2、 离子源 2.1、离子源寿命：≥1000小时；2.2、加速电压范围：500V -30kV； 2.3、离子束流：1.5pA–50nA范围内≥12挡可选；2,4、具备针对非导电样品的漂移抑制模式；▲2.5、离子束分辨率（冷冻状态）：≤7.0nm@30kV3、真空系统 3.1、无油真空系统；3.2、仓室真空度：室温，≤4*10-4 Pa；冷冻，≤8*10-5 Pa；4、冷冻样品台 4.1、可旋转冷台，冷冻条件下旋转范围：≥360°；4.2、冷冻降温时间：≤30min；4.3、XY轴行程：≥50mm；4.4、Z轴行程：≥40mm；4.5、冷冻状态下倾斜角范围：-10°~ +50°；4.6、冷冻温度：≤ -170℃；5、图像处理 5.1、图像存储格式：TIFF（8bit, 16bit或24bit）、BMP、JPG；5.2、图像存储矩阵：≥ 6000×4000像素；5.3、电子扫描旋转：≥360°5.4、驻留时间范围（扫描）：25ns/pixel-25ms/pixel；6、冷冻机械臂6.1、机械臂针尖温度：≤-160°6.2、机械臂漂移：≤250nm/min6.3、集成红外观测相机，用于样品和腔室观测；6.4、内置样品沉积保护层，可以待剪薄切片层保护，避免被离子束损伤； 6.2、内置喷镀装置，对冷冻下的剪薄切片进行导电化处理。三、主要配置：1、双束主机：1套2、空压机、循环水机、UPS电源：1套3、光电联用软件：1套4、电镜主机操作系统软件：1套5、耗材5.1、备用场发射灯丝：1根5.2、备用离子源：2个5.3、上样耗材：100个四、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤40㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-4 120kv透射电子显微镜一、技术参数：1、物镜1.1、线分辨率≤0.2nm 1.2、放大倍数：30×-600,000×，放大倍数全程连续可调，包含所有模式。1.3、恒定功率双物镜设计，具备高对比度模式，配置物镜高对比度极靴。1.4、焦距≥3mm1.5、极靴间距：≥10mm2、电子源2.1、热电子型电子源 ▲2.2、加速电压：20 kV-120kV2.3、高电压切换时间：≤1分钟3、照明系统3.1、照明模式：具备平行光模式和汇聚束模式3.2、透镜级数：≥2级聚光镜，用户可选强度限制（用于样品保护）和缩放限度（用于恒定屏幕强度）。4、成像系统▲4.1、成像系统：CPU控制≥6级透镜系统，物镜、中间镜和投影镜均≥2级。4.2、图像不随放大倍数放大而旋转， XY样品移动方向，XY坐标不变。4.3、衍射长度：0.1-8m。4.4、探测相机（速度≥40fps）和主相机，探测相机实现远程控制电镜。4.5、全自动控制聚光镜光阑、物镜光阑系统。4.6、可自动聚焦，并调整欠焦量。4.7、自动补偿：可以自动补偿合轴、自动补偿图像旋转。5、真空系统5.1、配置机械泵、分子泵和离子泵构成的无油真空系统。5.2、镜筒真空度：冷却温度下，≤2×10-5 Pa；环境温度下≤3.5×10-5 Pa6、样品台6.1 样品杆：单倾样品杆6.2、样品移动：6.2.1、样品移动：CPU控制≥5轴马达驱动。6.2.2、样品位移：X/Y：≥2 mm，调节步长≤0.05 μm；Z：≥0.70 mm。6.3、样品台倾斜角：不少于±80◦，调节步长≤0.5◦6.4、漂移：≤1 nm/min（标准样品杆）7、主相机 7.1、像素矩阵：≥4k×4k 7.2、像素大小：≥10um7.3、冷却方式：水冷7.4、图像存储模式：tiff、jpg、bmp、gif等各式自由转换。二、主要配置要求：1、120kV冷冻电镜主机：1套2、主相机：1套3、备用六硼化镧灯丝：3支4、备用钨灯丝：50支 5、120kv配套 UPS电源：1台6、主机配套标准操作软件：1套三、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤20㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-5 工作站一、用途：用于300kv和200kv 冷冻电镜的数据存储和数据处理。二、技术参数： 1. 工作站：4台1.1架构：4U机架式服务器 1.2内存：32*32G DDR4 ECC1.3 GPU：8*英伟达 V100 1.4 CPU：2*英特尔Gold 6230R CPU1.5 SSD：2*4TB；机械硬盘≥14T1.6网络连接：2*万兆网口 1.7电源和风扇：配置2000W冗余电源及风扇2.存储服务器：1台2.1架构: 4U机架式服务器 2.2内存: 4*32G DDR4 ECC2.3 CPU:2*英特尔Silver 4210 CPU2.4 SSD:2*480G2.5加速盘：4*480G SSD2.6机械硬盘：1P 2.7网络连接: 2*万兆网口 2.8电源和风扇: 配置2000W冗余电源及风扇3. 下载服务器：1台3.1 CPU：1*英特尔W-22453.2 内存：2*32GB DDR4 ECC 3.3 硬盘：1*480G SSD；2*8T HDD4.提供配套的机柜，万兆网线，交换机，服务器搭建的配套附属设备。5.提供配套的软件部署，数据采集，数据处理等技术支持培训的服务。6. 负责工作站安装场地（≤40㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-6 高压冷冻仪一、主要技术指标：1. 电量消耗2. 维持主机运行液氮消耗≤80L/天。3. 高压冷冻每样品液氮消耗≤80mL。4. 允许冷冻不同样品，≥9（3x3）个冷冻循环。5. 样品存储杜瓦瓶可自动旋转定位多个存储位置。6. 无需乙醇等溶液作为冷冻同步溶液。7. 每次冷冻循环之间的复原时间≤1分钟。8. 维持主机运行时噪声值9. 高压冷冻样品时噪声值10. 玻璃化厚度（有效冷冻固定厚度），≥200μm。11. 工作压力2000-2600 bar。12. 彩色图像触摸屏设计控制面板，（用户可自行设置工作流程），冷冻完成后数据可通过USB导出。13. 冷冻速率：12000K/s -25000K/s。14. 剩余液氮自动排放。15. 设有工作照明灯：LED环形照明。16. 样品冷冻杜瓦瓶监测液面高度，自动填充。17. 配备观察用显微镜。 17.1光学系统：变焦，变倍式光路系统，保证在任何倍率下都可以呈现鲜明、清晰的图像。17.2变焦比≥6.3 ：1，变焦范围：0.65X-4X。17.3观察镜筒：高眼点双目镜筒，大倾角（≥35°），瞳距可调节。 17.4配备宽视野*10倍目镜、视场数≥23 mm，屈光度可调节。17.5 至少内置1倍物镜，且工作距离≥110mm。品目1-7 冷冻电镜投入式冷冻制样设备一、数量：2套二、主要技术指标：1. 工作温度：18-25℃2. 相对湿度：90%-100%3. 液氮环境下栅格从冷却剂转移至栅格盒:半自动4. 双面拍合或单面拍合5. 可编辑拍合时间6. 吸附压力可调7. 有杜瓦瓶液氮可烘烤8. 触屏控制和踏板控制9. 一次可转移≥2个Grid box10. 小体积样品：可使用吸液管通过人工气候室左侧和右侧的小口手动应用11. 应用时间和等待时间：由软件控制，可在用户界面设置。12. 多样品应用、吸干动作和玻璃化时间控制：精确定时控制13. 吸干设备14. 样品吸干方式: 过滤纸吸15. 吸干动作次数和吸干持续时间：≥10次/样品，由软件控制，可在用户界面设置。16. 吸干补偿及排液时间：软件控制，可由用户定义17. 玻璃化18. 自动遮板控制19. 冷却剂容器和微栅样品杆温度控制:同步降低温度可保持微栅浸没在冷却剂内20. 冷却剂容器包括整合式抗污染圈品目1-8 辉光放电仪一、主要技术指标1. 辉光放电电流 0-30mA2. 样品台直径≥75mm，带玻片用滑槽3. 样品台高度1-25mm可调4. 样品腔内腔尺寸：直径≥100mm，高度≥90mm5. 工作真空范围1.1-0.20mbar 品目1-9 等离子清洗仪一、主要技术指标1. 清除系统：芯片控制系统2. 工作模式：真空清除透射样品杆和污铜网样品的污染3. 样品杆：TEM4. 时间设定：0-30min , 1min/步5. 真空系统：干泵无油真空系统6. 真空级别：120秒内达到最高真空7. 室温控制：15℃-30℃8. 电源：AC100V-240V，50Hz±1 Hz品目1-10 真空离子溅射仪一、主要技术指标1. 真空度：5x10-5 mbar2. 样品仓大小：硼硅酸盐玻璃工作腔室，内径≥100mm，高≥125mm3. 靶面至样品台距离：可调范围为20-50mm4. 溅射电流：0-40mA5. 溅射时间：0-999s6. 溅射速率：（在压力为7Pa,放电电流40mA，靶材距离样品30mm时）Pt≥15nm/min，Pt-Pd≥20nm/min，Au≥35nm/min，Au-Pd≥25nm/min7. 最大样品尺寸：直径≥60mm，高度≥20mm8. 靶材：根据需要，可选配Au，Pt，Au-Pd，Pt-Pd，C 品目1-11 正置荧光显微镜 （FIB光电联用光镜）一、主要技术指标1. 光学系统：无限远校正光学系统，保证光通过目镜到物镜整个光路中的所有棱镜及镜片时的绝对平行；2. 具有明场、相差功能，具有顶部双摄像出口；3. 物镜转换器≥七孔位；4. 放大倍数：50X-1000X；5. 透射光照明：12V100W卤素灯照明器；6. 调焦：带有三档调焦装置；调焦旋钮高度可调节；7. 宽视野三目镜筒：视野≥25mm，分光比例0/100%,50/50%,100/0%（可100%分光给照像部分）；8. 载物台：低位置同轴驱动旋钮的高抗磨损性陶瓷覆盖层载物台；用户可自己将操作杆左右手更换；X-Y移动无暴露齿条；9. 荧光光源：光源寿命≥2000h，红绿蓝三色带滤块；10. 光学部件：10.1万能聚光镜：带有孔径光阑的聚光镜，有效光阑刻度上具有彩色标注且与物镜颜色代码对应；10.2目镜：10X宽视野目镜，视野数为≥22mm；11. 图像捕捉及分析系统；12. 摄录系统；12.1数字式科研级数码、彩色冷CCD；12.2 CCD芯片规格：≥2/3”，≥500万像素；12.3像素大小≥3μm；13. CCD工作温度：低于室温20℃；14. 曝光时间：1msec- 60sec；15. 彩色深度：36位RGB色彩深度。品目1-12 倒置荧光显微镜一、主要技术指标1. 研究级高端倒置显微镜手动版，支持明场、荧光、相差功能。支持多模块扩充功能；2. 主机：2.1手动物镜转换器和手动粗微轴调焦（最小微调刻度单位：≤1μm），行程≥12mm，粗调旋钮扭矩可调，备有上限调节；2.2侧光路出口，视野直径≥19mm；2.3具有控制面板，含光强控制和光强按钮；2.4备有6孔物镜转盘；2.5具有侧接口，可百分百手动分光至相机或目镜。3. 光学系统：无限远校正光学系统，齐焦距离≥45mm。4. LED透射光照明装置：带TTL光闸，寿命≥30000小时。5. 观察镜筒：双目镜筒，观察角度可在30-45度范围内调节。6. 目镜：10×，视场直径为≥24mm。7. 手动载物台，配有样品移动尺、通用型标本托板和各种孔板夹，可匹配多种培养板、皿及玻片。8. 聚光镜：8.1编码型固定式，配备相差环。8.2聚光镜顶透镜：数值孔径≥0.4；工作距离≥40mm。9. 物镜：9.1 4X或5X：平场半复消色差荧光相差物镜，数值孔径≥0.12，工作距离≥14.0mm。9.2 10X：平场半复消色差荧光相差物镜，数值孔径≥0.32，工作距离≥11.13mm。9.3 20X：半复消色差长工作距离荧光相差物镜，数值孔径≥0.55，工作距离≥6.9mm。9.4 40X：半复消色差长工作距离荧光物镜，带矫正环，数值孔径≥0.6，工作距离3.3-1.9 mm。10. 荧光设备：10.1光学载体：保护荧光无杂散光干扰。10.2手动外置荧光轴模块，内含透镜组。10.3荧光滤块转盘：≥6位，可最多安装5个荧光滤块。10.4荧光挡板：荧光使用期间可保护使用人眼睛。10.5荧光激发块 10.5.1 DAPI（蓝色）荧光滤块，激发350/50nm，分光镜400 nm， 发射460/50 nm 带通10.5.2 FITC（绿色）荧光滤块，激发470/40 nm，分光镜510 nm，发射515 nm长通10.5.3 TXR（红色）荧光滤块，激发560/40 nm，分光镜585 nm，发射630/75 nm带通10.6荧光光源：长寿命荧光光源，质保寿命≥3000小时，随开随关，不影响使用寿命，≥5档光强调节。11. 彩色制冷相机：≥500万真实像素，拍摄时分辨率可调，支持彩色、黑白模式，致冷温度-20℃，曝光时间4微秒-200秒，全像素模式下≥40帧/秒。品目1-13液氮罐一、技术参数1. 250L 22psi低压液氮罐 6个2. 165L 22psi低压液氮罐 1个3. 200L 350psi高压液氮罐 1个4. 35L样品存储罐 4个 5. 4L样品转移罐 8个6. 样品运输盒 8个6.1 旋转透明盖，底座内螺纹，四孔各有编号6.2 常温TEM载网和冷冻载网通用第2包 品目2-1高通量数字玻片成像系统一、工作条件1、环境温度：20°C-30°C；2、环境湿度：≤85%（25℃）；二、技术要求1、扫描系统主机：1.1、全自动数字玻片扫描系统具有明场扫描、荧光扫描等多种成像功能，不同成像方式电动切换；1.2、单次样品装载量≥90张，可以持续添加玻片；1.3、系统具有显微成像光路，明场科勒照明；1.4、可通过软件编辑控制流程；1.5、多相机配置。预览相机快速识别拍摄样品及标签，明场扫描通过彩色相机成像；荧光扫描通过黑白相机成像；1.6、聚光镜：电动聚光镜1个，兼容强度传输方程（TIE）成像模式；1.7、像素分辨率：20x物镜下，≤0.50μm/pixel；40x物镜下，≤0.50μm/pixel；60x以上物镜下，≤0.30μm/pixel；1.8、电动扫描载物台，行程≥300×100mm；1.9、Z轴对焦范围≥3mm；1.10、可识别条形码，二维码，OCR码；2、物镜：2.1、≥20×物镜：平场复消色差物镜，数值孔径≥0.75，W.D.工作距离≥0.6mm2.2、≥40×物镜：平场复消色差物镜，数值孔径≥0.95，W.D.工作距离≥0.2mm▲2.3、≥60×物镜：平场复消色差物镜，数值孔径≥1.4，W.D.工作距离≥0.1mm▲2.4、配自动加油器，配合60X以上油镜使用，实现全自动扫描；3、样品舱室及兼容玻片：3.1、单次装载数量≥90片（玻片尺寸≥25mmx75mm），可以持续添加玻片；3.2、每张玻片相互隔离，待机和扫描时始终保持水平状态；3.3、配备样品上样器，用于快速装载玻片；3.4、兼容多种规格的玻片。4、扫描速度：4.1、明场扫描：使用20×/0.75物镜、扫描分辨率≤0.50μm /pixel、扫描面积15mm×15mm时，所用时间≤75s；4.2、荧光扫描：使用20×/0.75物镜，≥6个荧光通道成像，扫描分辨率≤0.50μm/pixel、扫描面积15mm×15mm时，所用时间≤500s。5、明场扫描：5.1、光源：LED光源，波长范围：400-700nm；▲5.2、具有自动Z轴扫描成像及景深扩展功能；5.3、明场扫描配置彩色相机，物理像素≥2400(H)×2000(V)。6、荧光扫描： 6.1、光源：配备LED光源或长寿命金属卤化物光源，激发波长范围400-700nm； ▲6.2、电动荧光转盘孔位≥6位，通道之间切换时间≤50ms；6.3、具有强度传输方程（TIE）照明模式，并能为一个单独通道成像，可与荧光图像叠加；6.4、荧光滤色片：可实现多色荧光标记的样品成像；6.5、荧光扫描单色相机：物理像素≥2000(H)×2000 (V)。7、扫描工作站：7.1、硬件7.1.1、CPU：≥6核，主频≥3GHz7.1.2、内存≥128G；固态硬盘≥4TB7.1.3、独立显卡，显存≥8GB7.1.4、彩色液晶显示器≥32英寸7.1.5、操作系统：Windows系统 7.1.6、打印机：彩色激光打印机7.2、扫描及图像处理软件：7.2.1、控制所有电动硬件、识别处理信息、图像可视化；7.2.2、自动程序化图像采集：个性化设定图像采集程序，自动完成≥150张样品扫描；7.2.3、具有预扫描和导航功能；7.2.4、多维图像采集：多通道成像、Z-Stacks成像、拼图及多点成像等；7.2.5、多种聚焦策略可选，满足不同类型样品的大视野拼图；7.2.6、自动对焦：可设定相应的聚焦地形图，自定义编辑样本聚焦点位置；7.2.7、具备图像压缩模式，可设定图像压缩比率7.2.8、图像格式：JPG、TIFF、BMP等；7.2.9、可进行同屏比较；7.2.10、测量参数包含长度、面积和角度等7.3 图像分析软件7.3.1 全景图像数据分析软件，具有免疫组化/免疫荧光切片中细胞核、细胞质、细胞膜染色的识别、阴性/阳性细胞计数、 染色强度分析、细胞阳性比率统计。7.3.2可进行明场图像免疫组化组织及细胞定量分析，自动化进行单个视野或者整张玻片阳性及阴性组织的精确识别，阳性及细胞的细胞核，细胞浆，细胞膜等区域的精确识别，并导出各类分析结果数据；7.3.3免疫荧光组织及细胞定量分析，自动化进行单个视野或者整张玻片多通道荧光图像的阳性及阴性组织的精确识别，量化细胞核、细胞膜、细胞浆中免疫荧光标记物表达，并导出各类分析结果数据。7.3.4 可自定义输出分析数据，包括：组织面积，阳性及阴性区域面积数据及阳性区域百分比等数据；阳性及阴性细胞数量、细胞长度、面积、周长、交界长度、H-Score评分等数据；光谱特征、真实染色空间、滤镜和（前后关联）特征。8、数字玻片成像系统的全部软硬件均为同一厂家提供，产品软硬件售后支持和维修也由同一厂家负责。三、主要配置：1、高通量玻片成像主机：1台2、图像扫描工作站：1台3、图像扫描软件：1套4、图像分析计算机：1套5、图像分析软件：1套6、校正用明场校正玻片、荧光校正玻片各1个四、售后服务1、质保期：安装完毕后24个月或发货之日起30个月免费质保,以先到为准。2、安装调试及应用培训：由专业人员负责安装、调试；安装过程中负责介绍仪器操作、日常保养注意事项；提供现场操作培训及操作手册。3、培训：仪器到位之后，由工程师完成培训，帮助用户掌握仪器的基本操作。4、出现问题在报修后24小时内相应，3个工作日内相关人员到达机器所在地点启动后续维护维修工作。

电镜不仅可以揭示新冠病毒形态、扩增过程及传播途径，同时，使用冷冻电镜解析病毒的刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S蛋白）结构是助力疫苗与抗病毒药物研发的关键所在。2月15日，美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan教授团队和美国国立卫生研究院NIH联合在预印版网站bioRxiv上发表了首篇使用冷冻电镜解析新冠病毒S蛋白的研究文章。Jason Mclellan团队通过冷冻电镜Cryo-EM技术，解析了新冠病毒S蛋白三聚体的3.5埃的近原子分辨率结构，从生物物理及结构生物学的角度加深了我们对新冠病毒的认知。01为何2019-nCoV的传染性如此之强？作者使用了来自赛默飞旗下品牌Thermo Scientific的Titan Krios冷冻电镜，解析了新冠病毒刺突糖蛋白（简称S蛋白）三聚体预融合构象的近原子分辨率结构，其分辨率达3.5埃（10-10 m）。该研究中发现新冠病毒S蛋白三聚体的在多数时候其三个受体结合域(Receptor-binding domains，RBDs)中的一个发生了旋转，使得其更容易与细胞表面的受体相互作用。作者还借助于其他生物物理和负染电镜（Thermo Scientific Talos TEM）技术，发现 2019-nCoV S结合细胞表面受体血管紧缩素转化酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）的亲和力高于SARS-CoV的 S蛋白。这两方面的数据说明了为何2019-nCoV的传染性较其他冠状病毒传染性更强。*新冠病毒S蛋白三聚体预融合构象的近原子分辨率结构作者进一步通过动力学实验检测确认新冠病毒、SARS病毒与宿主细胞受体ACE2亲和力的差异。令人震惊的是，2019-nCoV结合ACE2的亲和力是SARS病毒结合受体亲和力的10-20倍。该研究成果进一步阐释了新冠病毒能够迅速在人际间传播的原因。*新型冠状病毒相对SARS病毒对ACE2具有高亲和性02为何SARS-CoV的抗体对2019-nCoV无效？由于新型冠状病毒与SARS-CoV病毒之间的结构同源性，通过比较，研究者发现了2019-nCoV S蛋白与SARS-CoV S蛋白的结构差异。此外，他们还测试了三种研发用于结合SARS-CoV S蛋白的单克隆抗体，研究发现这些抗体并不能与2019-nCoV S蛋白RBD产生交叉反应，这说明SARS-CoV的抗体并不能用于2019-nCoV, 针对2019-nCoV必须重新设计抗体和疫苗。*2019-nCoV S与SARS-CoV S的结构对比总而言之，此文章利用冷冻电镜技术对新型冠状病毒的S蛋白进行了近原子分辨率的解析，为进一步精确地疫苗设计以及抗病毒药物的研发提供了重要的结构生物学基础，为发展新型冠状病毒的医疗对策提供了技术支持。后续如有相关疫苗或抗病毒药物的研究进展，冷晓镜会持续跟进报道。冷晓镜小课堂Q刺突糖蛋白（简称S蛋白）为何这么重要？冠状病毒的刺突糖蛋白（Spike glycoprotein, S glycoprotein）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是病毒最大的结构蛋白，其包含了病毒的主要抗原决定簇，能够刺激机体产生中和抗体和介导免疫反应，通常包括由球状的受体结合亚基S1和棒状的融合亚基S2两部分。同时，S蛋白的S1亚基决定了受体细胞的表面受体的特异性，而S2亚基又决定了病毒进入细胞的融合过程的特性，可以说S蛋白的结构对于设计疫苗来产生抗体或者设计药物阻断病毒吸附与侵染具有重要作用。*美国疾病控制中心 (CDC) 创建的新冠病毒立体模型“ 作为冷冻电镜（cryo-EM）技术的开拓者，赛默飞世尔科技一直致力于该技术的研发和普及，在不断推出新产品的同时，还专门与客户合作开发了冷冻电镜免费在线学习工具https://em-learning.com，希望为广大生命科学工作者及相关行业提供更完备更易用的解决方案。目前，赛默飞世尔科技冷冻电镜产品家族包括旗舰级300 kV产品Krios G4，最新推出的200 kV产品Glacios，用于冷冻样品制备的Vitrobot和用于样品筛查的入门级产品Talos L120C G2，以及用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）细胞样品减薄的冷冻聚焦离子束Aquilos 2等。”

真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法 真空冷冻干燥机广泛用于医学、制药、生物研究、化工和食品等领域。经冷冻干燥处理的物品易于长期保存，加水后能恢复到冻干前状态并保持原有生化特性。LGJ-18N系列立式冷冻干燥机，适用于实验室使用或少量生产，可满足大多数实验室常规冻干的要求。 　　真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法： 　　1)高压报警。出现高压报警的主要原因有: 　　①冷却水水温过高或冷却水量不足。 　　②冷凝器内部结垢，导致换热效率降低。 　　③压缩机工作时，低压管道发生泄漏，从而导致外界空气进入制冷系统。 　　④制冷管道存在未开足阀门或因管道被堵而造成排气不畅的情况。 　　解决办法: 　　①降低冷却水温度或增加水流量。 　　②清洗冷凝器的冷却水管路。 　　③对制冷管道进行检漏，如果在工作中无法实现该项操作，可将水冷凝器上方的截止阀打开，使存在于冷凝器中的空气排放出一部分。 　　④将压缩机管道.上的阀门开启到最大。 　　2)水压报警。水压报警的主要原因有: 　　①冷却水供水压力不足或供水泵不运转。 　　②水压力控制器故障。 　　解决办法: 　　①增大外部供水压力或检修供水泵。 　　②检查压力控制器的触头是否能正常工作或检查在其线路.上是否存在其他问题。 　　3)压缩机吸气温度异常。吸气温度异常的主要原因是膨胀阀调节不当，开启度过小或过大，导致回气量过小或过大。其解决办法是对膨阀进行调节，如回气量过大，应关小开启度，如回气量过小，应开大开启度，调节过程中以微调为主，多观察压缩机的回霜情况。 　　4)膨胀阀堵塞。堵塞分泌物物堵塞(脏堵)和冰堵塞两种。 　　①杂物堵塞。在堵塞不严重时，可用扳手轻轻敲打阀体，经振动使阀体疏通。若不奏效或膨胀阀很快又重新堵塞，则说明堵塞严重，应拆卸膨胀阀，对膨胀阀滤网进行清洗，清洗完后重新装上即可。 　　②冰堵。出现冰堵，应更换冷凝器出液端过滤器。 　　5)载冷剂泄漏 　　可用肉眼观察，查找板层，软管上的泄漏点。若发现可疑漏点，应放空板层或软管内的载冷剂，对泄漏点进行充压确认，确认后放气补好泄漏点，重新加入载冷剂并排出板层和软管内气体。

（1）生物制品的冷冻真空干燥我们做过生物制品冷冻真空干燥的品种有皮肤、角膜、海参、螺旋藻等；从文献中看到其他人做过的冻干产品有心瓣膜、活菌、活毒、骨骼、各种疫苗、血液制品等。生物制品的冻干要求保持产品的活性，活菌、活毒等微生物真空干燥后的存活率要求80%以上，以便于应用。因此，对冻干机工艺要求严格，预冻温度、速度、时间的控制很不容易，保护剂配方、剂量、加入时间和加入方法非常关键，不同的人可能采用不同的配方，达到的效果可能相同。一般各种保护剂的配方都是互相保密的。（2）药材和药品的冷冻真空干燥我们做过的品种有人参、山药、纳豆激酶、北冬虫夏草、林硅油、鹿茸等；从文献中看到其他人做过的品种有各种粉针制剂、中草药制剂、抗生素、布洛芬、脂质体和其他纳米颗粒等。药材和药品需要长期保存，真机需要速溶，放置氧化，避免污染杂菌，保持药效的长久稳定。这些要求都需要通过冷冻真空干燥技术来实现。药材和药品的冷冻真空干燥工艺要求也很严格，寻找合适的冻干保护剂、添加剂、赋形剂都很困难，生化干燥阶段的温度控制、加热速率控制都很关键，严格防止塌陷。（3）食品的冷冻真空干燥我们做的食品有菠菜、苹果、香蕉、库尔勒香梨等；从文献上查到其他人做过的品种有咖啡、茶叶、大蒜、鱼肉、调料等。食品种类繁多，形状、性质相差较大，冻干工艺需要在实验中确定。冻干食品时间较长、耗能较多、价格较高，应该合理选择冻干参数，优化冻干过程，降低冻干昂成本，根据市场需要，选择性价比较高的食品做冷冻真空干燥。（4）冷冻真空干燥在其它领域的应用冷冻真空干燥除了在生物制品、药品、食品和纳米材料制备方面的应用之外，还可以干燥超市的木质文物、古画等，冻干发出来的这些产品能恢复物品的原样；还可以干燥动植物标本，使标本长期保存，栩栩如生；医疗事业做实验用的、具有毒害物质的动物尸体采用冻干干燥法的处理，可以实现环保等。

p　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。/pp style="text-align: center "img alt="" src="http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style="width: 600px height: 350px "//pp　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)Fsub420/sub-还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。/pp　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。/pp　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。/pp　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。/pp　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。/pp　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。/pp　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。/pp　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。/pp　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟）/pp 原文检索：a href="http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short"http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short/a/p

细胞里面的生命活动井然有序，每一个部分都有其特定的结构，承担不同的功能。生物大分子则是一切生命活动的最终执行者，它们主要是核酸和蛋白。核酸携带了生命体的遗传信息，而蛋白是生命活动的主要执行者。自现代分子生物学诞生以来的半个世纪里，解析和分析生物大分子的结构、进而阐释其功能机制一直都是现代生命科学的核心问题之一。　　事实上，一切自然科学都涉及物质结构及结构间的相互作用为核心的研究方向，天文学研究宇宙、星体等的结构及其相互作用，粒子物理研究物质世界的基本粒子的结构和相互作用，甚至包括应用性很强的材料科学都是以研究新型材料的结构和性质等为核心。结构生物学研究的直接目的是弄清楚生命大分子结构，从而更好地理解生命，理解这个自然界中“逆热力学第二定律”而诞生的奇迹 最终目标是公众通常关心的实用价值。　　像数学物理公式不会直接造出飞机、导弹、计算机一样，蛋白质结构这样的基础研究不会直接转化为人们生产生活的必须物品。比较具体的应用，如药物设计、疫苗开发、医疗诊断和蛋白质分子性能改造(如科学实验或工业生产中酶活性稳定性优化)等是蛋白质结构研究比较容易被大众所理解的一个方向，但却只是其研究价值的一个侧面而已。　　蛋白质结构如同生命科学里的数学公式和物理定律，甚至在以后会充当生命科学里面的“化学元素周期表”，除了帮助发现或设计新药等，它更重要的价值是作为最基础最上游的研究之一，通过影响一切与其密切相关的下游科学和技术，从而改变我们的世界。　　结构生物学最早诞生于上个世纪中叶，它是一门通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学科，在其发展史上有两个里程碑式的事件，一个是 DNA双螺旋结构的发现，另一个肌红蛋白(Myglobin)晶体结构的解析，这两个事件都是上个世纪最重要的革命性科学进展，均在剑桥MRC分子生物学实验室完成，并且都于1962年获得了诺贝尔奖(一个生理学或医学奖，一个化学奖)。同时它们都是最早使用X射线的方法来解析生物大分子结构，而这个方法在过去半个世纪里，一直占据结构生物学的统治地位。　　在当今结构生物学研究中普遍使用的冷冻电镜，是上个世纪七八十年代开始出现、近两年飞速发展的革命性技术，它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构(主要是蛋白质和核酸)，在很大程度上取代并且大大超越了传统的X射线晶体学方法。　　革命性的冷冻电镜技术　　冷冻电镜并不是这两年才建立的。在蛋白质X射线晶体学诞生大约10多年以后的1968年， 作为里程碑式的电镜三维重构方法，同样在剑桥MRC 分子生物学实验室诞生，Aron Klug教授因此获得了1982年的诺贝尔化学奖。另一些突破性的技术在上世纪70年代和80年代中叶诞生，主要是冷冻成像和蛋白快速冷冻技术。这里面的代表科学家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。　　快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态，玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态，如果以缓慢温和的方式冷冻，这个过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息，确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。与此同时Joachim Frank等则在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。由此冷冻电镜的雏形基本建立，总的思路为：　　1)样品冷冻(保持蛋白溶液态结构) 　　2)冷冻成像(获取二维投影图像) 　　3)三维重构(从二维图像通过计算得到三维密度图)。　　该方法为生物大分子结构研究提供了一个和X射线晶体学完全不一样的、全新的思路。但是由于技术方法的瓶颈，在此后30多年的时间里只能做一些相对低分辨率的结构解析工作，在分辨率上一直不能和X射线晶体学比较，甚至一度被嘲笑为”blob-ology“(英文讽刺语，“一坨轮廓的技术”)。冷冻电镜三维重构得到的电子云密度图和原子模型(局部)。张凯供图　　但对于冷冻电镜来说，技术难点远非单纯冷冻。冷冻成像和图像处理算法一直都是瓶颈。从冷冻电镜技术诞生以来的近30年时间里，其一直都有进展，只是相对比较缓慢。　　最重要的革命性事件大约发生在两三年前：一个是直接电子探测器的发明，另一个是高分辨率图像处理算法的改进。MRC分子生物学实验室的两位科学家Richard Henderson和Sjors Scheres在这次革命中起了关键作用(作者注：现代科技革命往往是诸多研究机构若干团队共同参与，此处仅列举关键代表，并且仅从技术角度讨论，不涉及生物学应用)。　　Richard Henderson是探测器方面的先驱，而Sjors Scheres则因他设计的Relion程序而名声大噪，他们由此当选为《自然》杂志2014年“十大科学进展年度人物”。两位科学家一个从硬件，一个从软件将冷冻电镜技术推向了巅峰，将冷冻电镜技术的分辨率推向了新高度。(作者注: Henderson教授的贡献远非探测器一个方面，包括冷冻电镜理论基础、算法、软件，重要生物大分子应用，如曾首次解析视紫红质跨膜螺旋等等方面 早在20多年前，他就通过一系列理论分析，预言了冷冻电镜研究的尺度、分辨率极限、技术瓶颈等等，并且断言：冷冻电镜将超越其它一切技术方法，成为蛋白质结构研究的主导工具，如今这些预言全部应验。)　　和此前使用的CCD相比，新发展的直接电子探测器不仅在电镜图形质量上有了质的飞跃，同时在速度上大幅提高，还可以以电影的形式快速记录电镜图像。这些特性同时也伴随着电镜图像处理方面的重大变革，电镜技术此前在分辨率上的一个主要瓶颈是电子束击打生物样品造成的图像漂移和辐射损伤。有了快速电影记录，我们就可以追踪图像漂移轨迹而对图像做运动矫正和辐射损伤矫正，大大提高数据质量。　　尽管如此，电镜图像处理一直都是一项极具挑战性的任务，主要的问题是冷冻电镜的图像噪音极高、信号极低，而我们的目标是从中提取近原子分辨率的结构信息，这就像在一个机器轰鸣的工厂里监测一只蚂蚁爬行的声音。冷冻电镜科学家就是要完成这项艰巨的任务，并且真的做到了。有了硬件和软件方面的双重提高，冷冻电镜的分辨率目前已得到了极大的提高，可以和晶体学相媲美 并且在其它方面已经大大超越了晶体学。　　主要体现在下面几个方面：　　第一，不需要结晶，研究对象范围大大扩展，研究速度大大提高。对于小分子，比方说无机盐矿物质等自发就能长出晶体，小而且稳定的蛋白质目前来说结晶并不困难，但是这类意义重大的蛋白几乎都已经解析完了，在科学上没有任何重大意义 当今时代，小蛋白已经完全不能满足科学家们强烈的探索欲望，结构生物学研究的对象越来越大，体系越来越复杂，结晶几乎成为不可能的事情，即使能结晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子分辨率结构。　　很多年前，许多蛋白质晶体科学家为了完成一项艰巨的任务，一个课题少则5到10年，多则20年，核糖体从上世纪80年代初首次长出晶体到 2000年左右最终拿到原子分辨率结构整整经历了20年 线粒体呼吸链复合物I从上世纪90年代初研究，第一次报道完整晶体结构大约是20年以后。　　而冷冻电镜方法跳过超大分子复合物结晶难的这层技术屏障，以直接解析复合物的溶液状态的结构为目标。　　现在利用这项技术，在MRC-LMB一周时间就可以解析一个新的核糖体结构 英国皇家学会主席、MRC-LMB结构中心主任 Venki Ramakrishnan 教授，因为核糖体的晶体结构研究而获得2009年诺贝尔化学奖。他的实验室在2014年发表了最后一篇晶体结构文章，此后的文章全部以冷冻电镜为主。哥伦比亚大学有一个非常执着的博士后，研究兰尼碱受体(Ryanodine Receptor)晶体结构长达十年之久，最后放弃了晶体，转向了冷冻电镜技术，同时与清华大学教授颜宁和LMB的Scheres研究组合作，几个月就解决了这个难题，并且达到近原子分辨率。　　第二，样品需求量小，样品制备快，可重复性高。重要生物样品都是非常珍贵的，总体来说是以微克或者最多以毫克来计量，即使得到这点样品，也要花费生物学家几周、几个月甚至更长的时间(大多数时候都需要摸索各种条件使样品处于相对稳定的状态，以便做进一步结构研究)。　　蛋白质晶体一般要求高浓度大体积，没有量变就没有质变。而同样量的蛋白可以稀释以后制备若干冷冻电镜样品，每个样品有成百上千的区域，每个区域有几百个小孔，每一个小孔甚至可以收集多张照片。解析一般蛋白的原子结构需要几万个颗粒，而对于高对称性的样品几千个颗粒就足够。　　第三，可以研究天然的、动态的结构。X射线晶体学研究生物大分子结构的一个主要弱点是无法拿到天然的动态的结构，这是因为研究人员无论如何也无法绕开结晶这个过程。冷冻电镜就是要做这件事情：直接解析天然的、溶液态的、动态的(dynamic)，甚至原位(in situ)的结构，从而理解生命分子如何在空间和时间两个尺度上以活的动态的方式发挥功能。　　晶体学只能尝试不同的条件获得生物大分子某个或者某些固定的状态，而且容易出现晶体堆积引起的不真实相互作用方式。形象地说，冷冻电镜可以制作完整的高清电影，晶体学只能从电影里截屏。　　第四，技术革命还将开启巨大的潜在医疗价值。冷冻电镜技术方法在时间和精度方面的大幅度提高有时会导致不可预测的重大科学和应用价值。比如，活体病毒结构分析如果可以在分钟级别完成，这将有可能转化为潜在的医疗检测手段：从病人体内抽取血样或感染组织细胞，几分钟以后，非常清晰明了地展现病人在细胞内部结构层面的异常状况，甚至给出局部的原子结构图，从而给出精准的治疗方案。这个想法现在可能听起来有点像笑话，或许再过若干年人们就不这样认为了。　　当然冷冻电镜的革命性不仅仅体现在上述四方面，在此就不一一列举。有关冷冻电镜更加详细的介绍，可参见笔者等2010年的中文综述(《生物物理学报》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559)。文章中对未来几年的发展趋势所做的展望，如直接电子探测器的普及、非对称性蛋白复合物近原子分辨率结构解析、冷冻电镜相关计算性能的大规模提升等等，目前绝大多数都在过去的两三年内得以实现并飞速发展。　　华人学者在冷冻电镜领域的贡献　　在冷冻电镜的这场技术革命中，华人科学家功不可没，在某些方面甚至独领风骚，做出了诸多重大成果。　　加州大学旧金山分校(UCSF)的华人科学家程亦凡教授在2013年底，首次利用冷冻电镜技术解析近原子分辨率膜蛋白结构，这项成果在业界引起了巨大轰动。原因在于当所有电镜结构生物学家还在讨论膜蛋白到底能不能利用冷冻电镜技术看到二级结构，也是通常我们认为的中等分辨率水平的时候，程亦凡教授研究组直接解析了TRPV1 这个膜蛋白3.3埃近原子分辨率的结构(Nature，504：107–112)。　　笔者曾在该文章发表的半年前在一次国际会议上和冷冻电镜领域顶级学者深入讨论过如何获得清晰的膜蛋白α -螺旋结构，对方给出了悲观的结论：“恐怕不太可能，至少最近两年不可能”。　　事实上，此前蛋白质晶体学家已经有所耳闻“冷冻电镜可能在未来几年会超越并且取代晶体学”，但是谁也没想到会是以这样快速和震撼的方式登场，这在某种程度上引发了不少蛋白质晶体学家的“职业恐慌感”。这项成果的两个共同第一作者廖茂福、曹尔虎也都是非常杰出的青年华人科学家。　　加州大学洛杉矶分校的周正洪教授早在2008年到2010年左右，在这场电镜技术革命来临之前，在各项技术条件尚未成熟的情况下解析了一系列近原子分辨率病毒结构。当时采用的是传统胶片来成像，任务非常艰巨，连他还在上学的儿子也都帮忙一起洗胶片。张兴博士在这一系列稍早的重要成果中充当了先锋。早在2008年，第一个近原子分辨率的冷冻结构，也即3.8埃轮状病毒就是张兴博士作为第一作者完成的(PNAS, 105(6): 1867-1872)。从1968年Aaron Klug创立电镜三维重构理论，到2008年人们首次看到通过冷冻电镜获得近原子分辨率结构，整整用了40年。　　在国内，清华大学的隋森芳院士是我国冷冻电镜领域的先驱，不仅德高望重，还培养了一大批优秀的青年科学家，包括清华大学的王宏伟教授以及 MRC-LMB的白晓晨和畅磊福博士等等。王宏伟早年在隋老师实验室做研究生的时候，在我国研究设备和条件全面落后于国外的情况下依旧做出了许多非常出色的工作。　　MRC-LMB的多位青年华人研究人员对冷冻电镜发展都做出了重要贡献。白晓晨博士在MRC-LMB首次使用直接电子探测设备Falcon I 和Sjors Scheres博士的新程序Relion，获得了第一个不对称样品核糖体的近原子分辨率冷冻电镜结构，打响了冷冻电镜革命的第一枪，随后解析了一系列核糖体和蛋白复合物结构。畅磊福博士在LMB首次获得非核糖体不对称蛋白样品APC复合物的近原子分辨率结构，阐明了蛋白质泛素化的重要机理。笔者主要在LMB的Andrew Carter博士实验室从事动力蛋白结构和功能研究，并成功解析动力蛋白激活因子Dynactin结构，提出了目前为止动力蛋白最详尽可靠的运动和激活机制(Science, 347(6229):1441-1446. 封面文章)，同时独立发展冷冻电镜技术方法。　　1953年4月25日，MRC沃森和克里克在《自然》杂志发表DNA双螺旋结构，61年后的同一天，我国科学家、中科院生物物理研究所的朱平和李国红研究员在《科学》杂志以长文形式发表了30nm染色质冷冻电镜结构(DNA双螺旋之双螺旋)(Science , 344(6182): 376-380)。这项工作是冷冻电镜在核心生命科学问题中的成功应用，冷冻电镜部分的工作主要是笔者在生物物理所的同学宋峰博士完成的。　　生物物理所的程凌鹏博士(当前单位为清华大学)获得国内本土第一个原子分辨率的冷冻电镜结构，构建了蚕多角体病毒(CPV)的完整三维原子模型(PNAS，108(4)：1373-1378)。笔者也参与了部分工作, 被其高质量、干净的电子密度图震撼。近期程凌鹏与刘红荣博士合作，在国际上首次发表了CPV完整基因组和RNA聚合酶“原位三维结构” (Science, 2015, 349(6254):1347-50), 引起了很大轰动，这项成果是我国本土冷冻电镜技术和生物学应用的双重突破，被多名同行科学家称赞为”里程牌式发现“。　　我国著名科学家施一公最近发表了一系列重大蛋白复合物的冷冻电镜结构，包括γ -secretase、spliceosome等，被誉为过去几十年我国科学家对基础生物学领域的最大贡献。　　另外，在欧美和中国本土还有一大批华人学者在冷冻电镜或密切相关领域(cryoET等)做出诸多突破性成果，例如匹兹堡大学的张佩君教授(艾滋病毒结构研究)，德克萨斯大学的刘俊教授(细菌运动，噬菌体结构等研究)等，由于时间和篇幅问题，无法一一介绍。　　冷冻电镜的未来展望　　冷冻电镜技术目前仍然在快速发展中，未来冷冻电镜能做什么取决于这项技术能发展到什么程度。现代科学技术革命的一个最大特点是发展速度极其迅速，谁也不知道明天会发生什么，当然也不能十分准确的预知一个领域的发展方向。即便如此，笔者还是对这个领域有一些预测或期待(仅技术角度，不涉及具体生物学研究)。　　1)超大规模、超快速度数据采集和处理。和晶体学相比，冷冻电镜的效率在某些方面已经异常惊人。比如笔者近期与牛津大学王祥喜博士合作，在几个小时以内就可以拿到完整甲肝病毒原子结构，而此前王祥喜博士花费近一年时间结晶才最终拿到原子结构。但是科学技术发展是永无止境的̷̷　　但目前来说，结构生物学的巨大转型必须建立在速度和效率的双重前提下。这需要硬件、软件以及其它交叉学科等多方面的共同发展。　　除了生物学研究应用，笔者一直致力于冷冻电镜技术的发展，最近在提高电镜数据处理结果可靠性和分辨率前提下，上千倍地提高了其中几个环节，过去几百到上千CPU小时的事情，现在几分钟到几十分钟就完成了。但是这只是部分环节，在其它方面依旧非常耗时，整个技术的各个环节如何全面高效高速地完成还需要更多的优秀人才参与。对硬件的发展方面笔者并不是很熟悉，预计在未来会出现超高速度的电子显微镜，大幅度提高电镜原始数据的数量和质量。　　2)大尺度、高分辨率、高动态的生物大分子结构解析。理论上，冷冻电镜可像高清数码摄像机拍电影一样对生物大分子成像和重现其动态结构，研究深层机理。就目前而言，这一方面在技术上远未成熟。大尺度、高分辨率、高动态这几点拆解开来，每一个都不算太难，但是同时满足这几项需求几乎成为不可能的事情。但是这是未来结构生物学的方向，我们不仅仅要看简单的几张静态照片，我们还想看高清电影。　　关于这一点，笔者需要强调一下结构生物学和动力学模拟的区别。结构生物学的动态结构目的是以实验手段完整复原自然状态的动态结构，理解其中机理，是从实验数据出发“重现大自然原貌”的过程，是完完全全可靠的实验结果。而动力学模拟是从已有的理论或经验性的物理学规律出发预测一个生物大分子的动态特性，存在巨大的不确定性，其结果可靠性较差。期待在未来的某个时刻，两者会像上个世纪的理论物理和实验物理一样完美地结合，相互促进。　　大尺度复杂生物系统的高分辨率、动态机理研究涉及诸多学科，不是冷冻电镜一项技术就可以完成的，需要多学科科学家共同参与完成。　　3)高分辨单分子及原位结构研究。目前的结构生物学，无论晶体学、冷冻电镜还是核磁共振主要还是在研究“群体”结构。冷冻电镜相对晶体学在这一方面已经有了大幅度提高，可以通过分类的方法研究群体结构中的每一类结构。但实际上每个分子在时间和空间上除了共性，也必然有特性，如果一种方法强大到可以测得单个分子的高分辨率结构，这必然导致巨大革命，使得人们发现许许多多在群体结构研究层次上无法发现也无法理解的大量规律。　　注意这里强调的是单分子“高分辨率”结构，而不仅仅是单分子结构。单分子结构我们目前可以使用比如冷冻断层成像(cryoET)的手段获得，但是分辨率非常低，在如此低分辨率情况下，别说个体差异，很多群体结构差异都值得严重质疑。或许冷冻电镜技术若干年以后会实现这个目标，或许永远都不可能，或许这个目标被另外一个全新的技术彻底取代，冷冻电镜从此退出历史舞台。　　冷冻电镜：一个高度交叉的学科　　冷冻电镜领域一直是多学科高度交叉和相互促进才诞生的一个奇迹。数学、物理、化学、材料、计算机、软件、机械及自动化、精密仪器仪表等等缺一不可，当然最终的核心是生命科学(作者注：此处仅从结构生物学角度分析，并非泛指一般意义上生命科学是一切学科的核心)。生命科学提出问题，其它所有学科相互结合产生更好的解决方案。通过这些解决方案，发现更多神秘的生命现象，从而提出新的问题，诞生新的技术。　　举个例子，冷冻电镜图像信噪比极低，没有科学家的雄心勃勃，没有大批信号分析、图像处理甚至数学家的参与是不可能完成这样艰巨的任务。同时冷冻电镜领域的一些发现或需求，也为其它领域的科学家提供灵感来源和新的研究思路。MRC-LMB作为现代分子生物学的发源地和近两年来飞速发展的冷冻电镜技术核心研究机构，其一大特点就是多学科“零距离交叉”。从半个世纪前的DNA双螺旋模型、肌红蛋白晶体结构等到近两年冷冻电镜技术革命，一直将这一理念体现得淋漓尽致。技术的发展和重大科学问题的解决几乎都是同时进行的，当然科学问题或应用价值始终是核心和最终驱动力，脱离科学和应用需求的技术发展是没有意义的。　　另外一个比较具体的例子是笔者此前思考过的一个问题。在电镜领域出现直接电子探测设备之后，MRC-LMB的两台高端电镜，每天产生5到10T 的数据量，近期正在调试第三台，也许不久的将来，超大数据、超快速度电镜就会投入生产，这些将会导致全世界各个研究机构普遍出现一个严重的技术问题，就是如何高效、无损、快速地进行数据压缩存储和数据处理，当然这里的无损是相对特定生物样品和特定目标分辨率而言。这或许会引起一些信号处理和图像压缩方面的研究人员的兴趣。　　随着冷冻电镜对生物大分子复合物高分辨率结构研究趋于成熟，更加复杂的动态机理研究是必然趋势，这是冷冻电镜技术发展的一个潜在可能性。但是复杂生物体系的深入研究需要解决一系列数学理论、物理、计算难题，有的可能甚至超出了这些学科目前的研究范畴。近些年比较现实可行的是通过冷冻电镜手段，对特定蛋白复合物非随机情况下的高分辨连续动态构象进行分析。笔者认为，专业数学家的参与会大大加速冷冻电镜技术在这些方面的发展。　　生命体高度复杂，充满很多未知的和未被阐述清楚的规律，这里面有成千上万的生物大分子复合物，每一个复合物又与其它若干分子或复合物相互作用、相互影响，深入再深入地理解生命本质一直都会是冷冻电镜的重要方向。冷冻电镜是强大的基础研究手段，它通过解析高度复杂的生物大分子结构，帮助人们更好地理解生命规律，从而影响生命科学相关的一切下游学科和技术，当然也包括更好的发现和设计药物、医疗诊断等具体应用。我们期待在不久的将来，冷冻电镜技术会对科学研究和社会发展等方方面面都产生巨大影响。

高速冷冻离心机使用注意事项1.未经过培训和考核者不能使用离心机。2.使用离心机应选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。3.选择合适的温度，通常4℃，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转头。4.离心机转头使用前必须用擦孔棒将管孔擦净，并仔细检查有无裂痕和孔底白斑。若有，转头报废。5.离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装2／3，塑料管可装至肩部。管盖必须盖严绝不允许漏液。空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。6.离心管必须成对放置，必须严格平衡，偏差＜0.1g。7.不允许无转头空转，放取转头必须用手柄，以防转头滑落。转头要轻放、卡稳，旋下手柄时要用手扶住手柄只转转头。转头盖要盖严，无盖不准离心。8.离心时不准打开机盖，不准扒扶在离心机上，如有异常声音和振动时立即停机。9.转头使用后必须及时由转头室中取出、擦干，用擦孔棒将管孔仔细擦净。如有溶液溢出必须清洗干净，擦净转头室内凝水，开门凉干转头室。 高速冷冻离心机操作注意事项1.台式高速冷冻离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭，离心结束后取出转头要倒置于实验台上，擦干腔内余水，离心机盖处于打开状态。2.超速离心时，液体一定要加满离心管，应超离时需抽真空，只有加满才能避免离心管变形。如离心管盖子密封性差液体就不能加满，以防外溢，影响感应器正常工作。3.转头在预冷时转头盖可摆放在离心机的平台上，或摆放在实验台上，千万不可不拧紧浮放在转头上，因为一旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！4.转头盖在拧紧后一定要用手指触摸转头与转盖之间有无缝隙，如有缝隙要拧开重新拧紧，直至确认无缝隙方可启动离心机。5.使用时一定要接地线。离心管内所加的物质应相对平衡，如引起两边不平衡，会对离心机成很大的损伤，至少将缩短离心机的使用寿命。6.在离心过程中，操作人员不得离开离心机室，一旦发生异常情况操作人员不能关电源（POWER），要按STOP。在预冷前要填写好离心机使用记录。

真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于化学分离和纯化技术应用的实验室设备；该技术可通过将化学物质置于离心管中，利用离心力可将混合物中的各种化学物质分离开来，提高纯度。冷冻型的设备则是利用低温环境和真空状态可使化学物质在离心管中迅速冷冻、快速蒸发，从而提高实验的操作应用效率。本篇文章将深入探讨这款低温冷冻型离心浓缩设备的原理应用。　　　　　　冷冻真空离心浓缩仪利用离心和真空技术可将化学混合物中的化合物迅速分离，从而达到对样品的纯化和浓缩目的；该设备被广泛应用于分析化学、医药、生物学等行业领域。冷冻型的实验设备相比较于其他款，它是利用低温环境和真空状态分离化学物质，并将它们冷冻起来以提高实验效率。　　在使用冷冻真空浓缩设备时，需要先将样品置于离心管中，塞进盖子中央的叶轮上，接着运转机器，对离心管内的化合物进行旋转，在加入真空度后，通过减压和外部加热的方式来提高该系统内的温度以及气体流通性；随后可将化合物冷冻蒸发出来，达到样品的浓缩效果。　　　　真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于制备RNA和DNA等高浓度浓缩样品的实验设备，该设备使用温度较低功率较少的真空泵和离心机器，可有效提高了实验对样品的纯度和浓缩效率；实验设备基于不同的原理应用，旨在提高化学物质的纯度；而冷冻型真空离心浓缩仪则比其他设备的应用更为高效。

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冷冻电子显微学近年来在电子显微镜的硬件设备及结构解析的软件算法等方面取得了多个重要的技术突破, 正在成为结构生物学研究的重要技术手段, 为越来越多的生物学研究者所重视. 冷冻电子显微学的技术特点决定了它所具备的一些独特优势和发展方向, 同时作为一个正在迅速发展的科学技术领域, 需要多学科的交叉促进. 　　近期来自清华大学生科院的王宏伟发文介绍了冷冻电子显微学的研究现状及面临的技术挑战, 并提出未来可能实现结构生物学与细胞生物学不同尺度的研究在冷冻电子显微学技术上融合的新方法.　　结构生物学是 20 世纪后半叶, 尤其是在 80~90年代蓬勃发展起来的重要学科. 通过对生物大分子(蛋白质、核酸及其复合体)的三维空间结构的测定, 结构生物学可以在微观尺度上精确地描述复杂生物大分子的形状, 原子与分子组合方式, 及其表面带电、亲疏水等物理性质, 从而为生物大分子发挥生物学功能的机理提供关键的解释. 进入 21 世纪以来, 结构生物学研究的技术手段日益成熟, 在现代生物学研究的各个分支领域中均发挥着重要的作用. 至今为止, 国际蛋白质结构数据库中的结构数据已经超过 100000, 其中绝大部分结构由 X 射线晶体学及核磁共振波谱学解析而来. 　　近年来, 技术的进步使得结构生物学新的研究手段取得了长足的进展. 2013 年 12 月份发表在Nature 上的利用冷冻电子显微学解析获得 TRPV1 原子分辨率结构的两篇文章, 在结构生物学领域造成了巨大的反响. 美国加州大学旧金山分校的程亦凡研究组与 Julius 研究组合作, 利用冷冻电子显微学技术首次获得了 300 kD膜蛋白 TRPV1的 3.4 Å 分辨率的三维结构, 并建立了该分子的原子模型.　　其实在过去的几年间, 已经有若干工作报道了利用冷冻电子显微学解析病毒、蛋白酶体复合物、核糖体等近原子分辨率模型. 这些工作的里程碑式意义在于: 高分辨率结构解析过程不需要生长三维晶体, 样品用量非常少, 而且可以在短时间内同时获得多个复合体状态的三维结构. 短短一年里, 冷冻电子显微学技术作为直接解析生物大分子原子分辨率结构的技术手段受到人们的广泛关注.　　事实上, 电子显微学是结构生物学研究中的老兵. 该技术自从 20 世纪 50~60 年代以来, 一直在研究细胞、 亚细胞及生物大分子结构的研究中扮演着独特的角色, 揭示了很多重要的细胞内精细结构. 在研究生物大分子的结构方面， 该技术采取与 X 射线晶体学及核磁共振波谱学迥然不同的原理, 在过去的几十年里逐渐建立了成熟的图像处理及分析算法, 成为结构研究的一种独特技术手段. 近 10 年来, 该领域的日臻成熟以及科研团队的扩大更快地催生了冷冻电子显微学成像技术与结构解析技术的革命性突破. 自从 2008 年以来, 冷冻电子显微学已经连续获得多种生物大分子复合体的原子分辨率结构, 而且高分辨率结构的解析速度正在呈现迅速上涨的趋势。　　冷冻电子显微学从 20 世纪中叶开始, 经历了 80年代到 90 年代的技术方法建立时期, 21 世纪初的技术成熟期, 在过去的两年里发生了革命性的技术进步, 进入了快速发展期. 结构生物学和细胞生物学研究者如何抓住这个契机, 如何尽快适应新的局面, 掌握新的技术, 充分发挥该技术的优势从而更加更深入地研究生命现象, 将是未来几年里的一个主题. 数学、物理学、计算机科学、材料科学、化学等众多领域的研究者们必将在未来冷冻电子显微学的新技术新方法的开发中发挥重要的作用, 成为该技术的进一步完善与成熟的重要力量.　　冷冻电子显微学领域研究者们则需要以主动开放的态度吸引其他领域研究者的合作, 并积极迎接来自更多领域研究者的挑战, 保持并发展自己的技术特长, 站在技术发展的制高点上选准研究方向, 始终在冷冻电子显微学的技术前沿上开疆拓土.　　原文检索：　　王宏伟. 冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 1020&ndash 1028　　Wang H W. Current status and future perspective of cryo-electron microscopy in structural biology. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 1020&ndash 1028 doi: 0.1360/052014-140

p style="text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/a30b56e7-51e3-4fed-aa1a-7c72bf69ff0e.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg" style="text-align: center max-width: 100% max-height: 100% "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) "英国剑桥分子生物学实验室的冷冻电子显微镜图片/spanspan style="color: rgb(127, 127, 127) "来源：剑桥MRC分子生物学实验室/span/pp　　一项革命性的蛋白质三维形状测定技术正在蓬勃发展。上周，一个收集由冷冻电子显微镜（cryo-EM）测定的蛋白质和其他分子结构的数据库，获得了第10000个数据条目。/pp　　据《自然》报道，近年来，各实验室向电子显微镜数据库（EMDB，由欧洲生物信息研究所建立，旨在满足学术界对于冷冻电镜数据的需求）提交的数据呈指数级增长，这主要因为全世界实验室cryo-EM数量的爆发式增长。尽管数据库也接收其他电子显微镜结构分析的数据，但其中绝大部分数据来自cryo-EM。/pp　　cryo-EM通过将蛋白质或其他生物分子急速冷冻，并用电子对其轰击，从而生成单个分子的显微图像。它们被用来重建分子的三维形状或结构。这有助于揭示蛋白质如何工作、它们在疾病中如何发挥作用，以及如何用药物靶向它们。/pp　　此前几十年，X射线晶体衍射一直是备受结构生物学家青睐的研究方法，该方法首先使蛋白质结晶，然后用X射线对其连续打击，并根据衍射光的信号模式重建它们的形状。/pp　　X射线晶体衍射法虽然能够生成高质量的分子结构，但并不是所有蛋白质都可轻易使用，因为有些蛋白质可能需要数月或数年才能结晶，而有些甚至根本无法结晶。/pp　　这便体现出cryo-EM的优越性，该方法无需蛋白质结晶，但这项技术也存在局限，比如它经常生成低分辨率结构。/pp　　2012到2013年，由于在硬件和软件方面的突破，催生了更灵敏的电子显微镜和可将拍摄到的图像转换成分辨率更高的分子结构的复杂软件。/pp　　该项技术专家、英国剑桥MRC分子生物学实验室（LMB）结构生物学家Sjors Scheres说，这为cryo-EM的迅猛发展铺平了道路。/pp　　LMB结构生物学家Richard Henderson因对cryo-EM技术发展的贡献获得了2017年诺贝尔化学奖。他说，即使在这项技术取得进步后，最初的增长也很缓慢，因为只有少数实验室配置了该设备。但当他们开始使用冷冻技术绘制分子的详细结构图像时，比如被称作蛋白质制造机器的核糖体，这项技术很快就引起了其他科学家及其所在机构和资助者的注意。/pp　　Henderson说：“所有投资于其他研究和做出错误决定的人，花了一年的时间才赶上来。”/pp　　他预计，到2024年，利用冷冻电镜技术测定蛋白质结构的数量将超过X射线晶体衍射法。cryo-EM已经取代了X射线晶体衍射，成为科学家特别感兴趣的研究嵌入细胞膜的蛋白质的工具。许多膜蛋白与疾病有关，可为药物提供靶点。/pp　　此外，Henderson还认为cryo-EM的发展将在某个时期开始放缓。他说，影响其快速增长的一个因素是成本高，一台如此强大的显微镜其成本可能超过500万英镑（700万美元）。而它们每天的运行成本也高达数千英镑，并且需要专门的实验室来安置，以降低震动。/pp　　Henderson正在努力说服相关公司开发性能好且价格更便宜的cryo-EM，以进一步推广这项技术。（徐锐）/ppbr//p

冷冻干燥是一种相对温和的干燥过程，但是相比于一般药品，诊断试剂盒的冻干涉及到一些敏感的生物大分子，因而存在一定的风险。基于ELISA和PCR方法的疾病诊断试剂盒中使用的试剂往往包含不稳定的成分，例如需要使用冷链运输的酶和抗体，因此，诊断试剂盒的稳定商用一直是个具有挑战性的问题。生物分子诊断试剂的冻干不同的分子对加工和储存条件表现出不同的敏感性，对生物大分子而言，不仅需要保证分子在冷冻干燥后的化学完整性，而且还必须保持其三维结构，来尽可能大的程度地减少由于聚集和变性等因素导致的活性下降。小剂量诊断试剂诊断试剂盒通常使用少量可以快速汽化的溶剂。尽管八连管中的几微升的蒸发量较少，但仍可以通过平板或微流体通道来加速蒸发。考虑到新冠疫情的紧迫性，检测试剂盒的产量和生产速度至关重要，因此许多新冠诊断试剂盒都采用96孔板，芯片或微流体芯片来进行生产。冻干机可以在很大程度上缓解这一困境。生物分子的稳定性尽管大多数生物分子（例如抗体和酶）对冷冻干燥的条件不敏感，但仍有些特例存在。对低温敏感的蛋白质可能会在冻干过程中发生聚集或沉淀，但是这种情况可以通过缓慢降温或添加表面活性剂来缓解。冻结浓缩效应可能会破坏某些成分，这一效应会随着pH值一同变化。磷酸盐缓冲液可能是造成这一效应的主要原因，更换pH缓冲液或快速冷却通常可以解决此问题。蛋白质也容易受到界面效应的影响，这一效应与冰晶表面积成比例。通常可以通过缓慢冷却或使用控制成核技术来增加晶体的尺寸并减小表面积来抵消这一效应的影响。脱水应力会影响蛋白质的稳定性。在某些情况下，需要结合水才可以保持蛋白质的结构。加入冷冻保护剂或冻干保护剂可以减轻这种情况，并通过固定蛋白质和/或模仿结构水的作用来避免脱水应力。甘油效应PCR试剂中甘油的存在（如图1）会造成严重的后果，因为它在常规的冷冻过程中不会凝固。如果溶液储备充足的情况下，可以通过加入溶液稀释甘油或添加赋形剂的方法来解决。但是，干饼（dried cake）中仍可能存在甘油，这会极大的影响稳定性和结构。新冠诊断试剂盒对于保质期的要求可能不如其他诊断试剂盒高，只需要几个月的保质期即可，因此也可以使用低温保存。这样的话，甘油的存在对活性成分的稳定性影响较小。 图1. PCR试剂中甘油的存在容器和封装冻干容器（例如小瓶、试管、孔板、芯片等）和封装的方式对热传递和热稳定性具有重大的影响。除了密封过程中实现完全无水的挑战之外，有些孔板对水的渗透性甚至大于封口（如图2）。Ward博士在Webinar中提到，在低氧气和低湿度条件下采用受控环境，并使用柔性隔离器可以降低产品中的水分含量。对于新冠检测而言，初始性能和快速生产可能比长期稳定性更重要，因此某些密封措施可能不是必要的。 图2 封盖相关过程图示 冷冻干燥设备由于大多数相关企业都在提高新冠检测试剂盒的产量，而非其长期稳定性。因此中试型冻干机即可满足新冠检测试剂盒的生产需求。一个典型的代表，SP Scientific生产的中试冻干机Ultra，可以一批冻干多达5,000个2 mL的西林瓶。对于大多数检测试剂的生产而言，这样的产量足以满足需求。其他更大型的专为制药行业设计的生产型冻干机，还具有诊断试剂生产所需的其他功能，例如蒸汽灭菌等。 SP Scientific Ultra 中试和小批量冷冻干燥机SP Ultra中试型冻干机具有较大的产品搁板面积和容积率，可以轻松处理每批次多达5,000个2mL西林瓶或144个96孔板。 SP Scientific Benchmark生产型冻干机SP Benchmark生产型冻干机专为更大批量的诊断试剂产品的生产而设计。其拥有一个典型的圆形产品室和内部的冷凝器设计，可改善低塌陷温度的诊断试剂产品在极低的层板温度下干燥时蒸气输送。层板面积从2㎡到20㎡不等。关于LyoStarLyoStar 全自动冻干工艺开发与优化，具备全套完善的PAT工具，加快从配方开发到产品上市的速度。 LyoStar-SMART™ 冻干工艺智能优化-Controlyo瞬时成核结晶技术-LyoFluxTDLAS水蒸气质量流实时监测-TEMPRIS无线温度测量-基于QbD理论的全自动冻干工艺开发与优化-缩短工艺时间，提高产品质量，加速产品上市 总结以上所讨论的问题中，最重要的是需要根据所讨论分子的敏感性的不同，采用合适的冻干策略。同时还要考虑到其他对于诊断试剂的冻干要求。在进行新冠检测试剂的冻干中，试剂的体积通常较小，但批次数量较大，并且优先重点是产量而不是长期稳定性。因此，在设计专门用于新冠检测试剂盒的冻干方案时需要考虑这一点。

冷冻干燥（也称为冻干）行业对生产力和盈利能力的需求正在增加。这种增加促使业内从业者考虑冷冻干燥与喷雾干燥相比的优势。因此，在本文中，我们在考虑两者的优势，以帮助您选择最适合您的项目和产品的干燥技术。冷冻干 燥or喷雾干燥如何抉择？ 干燥在生物制药行业被广泛认为是保存各种药物制剂和生物制品的首选方法。当液态稳定性不足、储存要求过于严格或需要固体形式的产品以延长保质期或实现不同气候和环境之间的运输时，就需要使用合适的干燥技术。 冷冻干燥无疑是各种材料和应用中公认的“首选”干燥工艺。然而，由于成本、API的可用性以及有时加工和生产量，对替代方法进行评估以确保使用最适合产品和/或项目的干燥方法。 *的冷冻干燥替代方法是喷雾干燥。喷雾干燥具有多种优势。尽管与冷冻干燥相比，它是行业中的新手，但它展示了在可扩展级别（连续而不是逐批处理）处理更高吞吐量的能力。因此，喷雾干燥也可被视为产品干燥的可行选择，具体取决于相关加工要求和产品应用。两者的干燥过程冷冻干燥冷冻干燥的原理涉及以受控方式对产品进行初始冷冻，以控制冰晶结构。 然后将其置于真空中，在真空中进行升华（或初步干燥）以去除未结合的水。接下来是二次干燥以升华结合水，将材料降至用户定义的残留水分水平。此阶段的目标是结合水而不是未结合/游离水，因此需要更多的能量来通过将搁板温度提高到+20°C或更高来驱动该过程。当加上低气压时，它会导致冰直接变成水蒸气（通过液相），这个过程叫做升华。 根据在给定冻干周期中干燥的样品的性质，温度和真空之间的微妙平衡对于确保在干燥后生产成功的批次而不影响产品功效和活力至关重要。为实现这一点，不同类型的产品及其体积可能需要根据其固有的样品特性进行12小时到5天的冷冻干燥。喷雾干燥喷雾干燥通常被认为是一个更简单（和更快）的过程，涉及在一个步骤中将液体制剂转化为干粉。溶液被雾化成细小的液滴，然后在一个大室中使用热气体快速干燥。然后用旋风分离器收集所得干燥颗粒。尽管根据经验，喷雾干燥比冷冻干燥更快且更便宜，但其中一个显着缺点是它需要高加工温度和剪切力。当然，在受到严格控制的制药和生物技术行业中，这些是许多客户力图避免的，在这些行业中，有效性的可行性和工艺参数与敏感的 API 和配方相关；因此，喷雾干燥更适合用于相当耐寒的产品。冷冻干燥中的产品温度在初级干燥中通常低于0°C，在二级干燥中通常为20-30°C，而喷雾干燥中的产品温度通常高于 80°C。在这些较高 (80°C) 温度下工作的直接影响可能是干燥后样品质量在固有产品特性方面的整体损失，例如：1.功效/生存力；2.味道/气味/颜色；3.一致性；4.营养价值，即食品相关产品中的营养素；5.生物产量—更高水平的细胞（即细菌）对数减少；6.蛋白质降解。 行业中的应用这两种工艺都可用于广泛的应用。例如，冷冻干燥通常用于保存不同类型的细胞、精细化学品、实验室试剂和注射疫苗，以及食品工业和乳制品。因为它通常是用直接装在小瓶或其他容器中的产品进行的，所以这种加工方法最适合干燥后不需要进一步加工的配方；此外，小瓶可以在冷冻干燥机的原位密封，从而避免循环完成时的潜在污染。另一方面，喷雾干燥更常与批量加工相关，而不是基于小瓶的加工。 然而，一个普遍的误解是喷雾干燥仅适用于食品和稳定的原料药，而当代研究表明它可能是用于某些复杂产品（例如微囊化细菌和纳米颗粒）的有效方法。 效率、质量与成本人们普遍认为与喷雾干燥相关的成本低于冷冻干燥的成本，这使得该技术成为某些市场感兴趣的技术之一。与冷冻干燥相关的分批形式不同，喷雾干燥对更大的吞吐量潜力更开放，可以被视为“连续过程”。此外，冷冻干燥的优势在于产品的稳健质量。 精确控制低加工温度可*限度地降低产品固有特性的任何风险，例如塌陷、共晶熔化或超过玻璃化转变温度，从而使冻干产品加工成最高质量。生物制药在喷雾干燥过程中可能会受到剪切应力，再加上所需的高加工温度会使蛋白质等化合物不稳定并损害产品性能，*降低产品功效。总结总之，两种产品干燥工艺方法在正确使用且适用于合适的产品时都是有效的。为了在包括干燥阶段的产品加工中获得*结果，*决定哪种方法最适合项目或持续加工需求的因素将是*产品的质量及其如何到达*用户 。

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)是设计和优化创新药的必要方法。本篇综述将深入探讨冷冻电镜(cryo-EM)在SBDD领域中的快速崛起及它的主要作用，以及阐释它如何为高价值药理学靶点提供丰富的全新结构信息。冷冻电镜技术相比X射线晶体学的主要优势在于，它可以跳过繁琐的结晶步骤，从而直接对玻璃化的生物大分子进行成像；冷冻电镜也可以提供更多维度的信息，包括异质性和动态性。此外，本综述还将讨论冷冻电镜近期和未来的发展，并探讨该技术将在SBDD的管线中产生何种广泛的影响。冷冻电镜时代的SBDDSBDD是一种基于靶点的原子级结构基础信息，针对该靶点进行理性药物设计的研发方法。20世纪80年代，随着Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向药物获批上市，SBDD方法初露锋芒。这一批由FDA批准的药物结合了晶体结构模型与计算机辅助分子建模这两大新兴技术，并成功解决了传统湿实验室的高通量筛选方法(HTS)所面临的昂贵、耗时及低回报率等问题。此后，随着计算技术的不断革新，大量药物靶点的晶体结构得以解析，SBDD方法进入了飞速发展阶段。从1999年到2013年，在113个获批的first-in-class药物中，有78个是基于SBDD方法发现的。尽管SBDD的发展足够迅速，但学界及制药行业内对它的期望显然更高。SBDD方法往往能另辟蹊径，对过往认为不可成药的靶点进行验证，并进一步开发新药。如K-Ras(G12C)靶点，它利用晶体学结构确定了一个以前未知的结合口袋，以避免与皮摩尔亲和力的GDP/GTP竞争。由于靶点验证是发现和开发工作中的主要难题之一，first-in-class药物分子可以为靶点的有效性和疾病应用提供新的见解，例如bromodomain溴结构域抑制剂(+)-JQ-1和I-BET762，这些化合物被成功用于表征和验证溴结构域在各种疾病中的重要性，并催生了大量的临床候选药物。即使是FDA批准的已知药物靶点，临床上也常常需要进一步的SBDD，比如有些药物需要进行更好的选择性的优化设计。厄菲替尼(erdafitinib)在经过针对性的设计改造后，表现出了相对于原先药物对成纤维生长因子受体更高的选择。此外，有一些药物可能需要优化效力或疗效，或提供特定受体亚型的选择性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制剂西波尼莫德(siponimod)对S1P1而非对S1P3的选择性，是提高其在疗效和安全性上优于非选择性S1P抑制剂的关键。该药物靶向S1P1，而非S1P3，此外，许多抗病毒、抗菌和抗癌药物正面临着抗药性问题，SBDD方法能够基于产生耐药性的靶点结构，对药物进行持续改进。SBDD工作的瓶颈在于获取高分辨率的生物靶点结构信息。虽然一些小而有序的生物分子满足X射线晶体学的研究范畴，但大部分已知靶点中的蛋白质，例如跨膜受体或动态复合物，都难以结晶，导致这些靶点蛋白无法利用晶体手段进行高分辨率结构解析。此外，X射线晶体学往往会对靶点蛋白进行改造，如进行截短体设计、引入热稳定性突变或插入一段外源的结构域，从而影响后续的SBDD结构信息分析。还需要考虑的一个关键因素是，大量的靶点蛋白性质上达不到结晶的条件要求。不过，上述的这些难点正被冷冻电镜技术逐一攻克。冷冻电镜技术的分辨率已足够高，其产生的大量数据也可用于计算辅助药物设计(CADD)方法，这也是本综述的核心议题。与X射线晶体学不同的是，冷冻电镜无需对目标靶点进行结晶：纯化过的靶点生物大分子会被瞬间冻结在一层薄薄的非结晶玻璃体冰中，再经由透射电镜成像以记录下几十万到几百万个冷冻电镜颗粒数据，用于重构三维静电势图并对大分子进行精确建模。因此，这种技术很适合于蛋白质复合物、热稳定性较低和动态运动较高的蛋白质以及脂质胶束中的跨膜蛋白质的结构测定。随着分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为药物设计的强大工具。冷冻电镜与药物发现在2014年之前，冷冻电镜几乎无法解析出优于4.0Å分辨率的结构，这直接导致它无法对SBDD工作提供有效的数据支持。然而，在过去的几年里，冷冻电镜方法的爆炸性突破产出了大量高分辨率的结构数据，这在以前是无法实现的。这一质的飞跃要归功于许多技术革新，如用于记录图像的直接电子探测器、改进的计算方法和处理大型数据集的硬件集群，这些技术的飞跃在其他文献内有详细回顾。此外，作为一种直接可视化的技术，冷冻电镜能够快速判断样品的聚集性和稳定性等问题，从而通过遗传和生物化学手段，用互作因子稳定蛋白、或通过优化去垢剂从细胞膜环境中提取膜蛋白等方法来快速改善样品质量。综合以上，在PDB中的分辨率为4.0Å或更高的冷冻电镜结构的数量已经从2014年之前的合计16个增长到仅2020年一年提交1753个新结构的规模(图1, A)。在新上传的结构中，分辨率高于4.0和3.5 Å的比例分别从2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奋人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0Å和2.5Å的冷冻电镜结构比例，分别达到了18%和3%，实现了冷冻电镜结构解析前所未来的突破(图1, B)。为了系统评估冷冻电镜对SBDD领域的影响，我们(作者)调查了2018年美国200种最常用处方药的靶点相关结构数据。72%的靶点在PDB数据库中含有结构信息。细分而言，这些结构信息是通过X射线晶体学技术(42%)、冷冻电镜技术(15%)或两者结合(15%)而确定的(图1, C)。通过冷冻电镜技术解析的靶点涵盖了许多跨膜蛋白，如离子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活态的G蛋白偶联受体(GPCRs)和转运体蛋白(5-羟色胺转运体、NaCl转运体)。图1.冷冻电镜分辨率的提高及其对蛋白质药物结构表征的贡献。(A) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的绝对数量；(B) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的百分比的。(C)2018年200个热门处方药的靶点图，按靶点的结构特征分类；(D)44个热门GPCRs处方药的靶点图，按结构特征分类；(E)2018年200个销量最高的药物的靶点图(作为新药的代表)，按靶点的结构特征分类。2020年的数据是由Njardarson实验室公示的2018年200种最受欢迎的处方药和200种销量最高的药物的蛋白质靶点(如果适用)，然后在PDB中确定相关结构，进行人工筛选。在200多种最常见的处方药中，GPCRs占据了44种，这些药物包括靶向GPCRs的激动剂、拮抗剂和反向激动剂(图1, D；注意，拮抗剂和反激动剂在药理学上不同，但在这里我们(作者)把它们统一归为拮抗剂)。这些GPCRs中的32个(73%)已经进行了某种形式的结构解析，包括与拮抗剂(44%)或激动剂(7%)结合的晶体结构，与激动剂(9%)结合的冷冻电镜结构，或由X射线晶体学和冷冻电镜手段共同进行的结构解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度动态结构使其难以获得高质量的晶体，因此大多数的GPCR晶体结构都是与拮抗剂结合后才得以进行结构解析的。综上所述，冷冻电镜技术在针对市场上已经存在多年的处方药中中具有深刻影响。为了更加深入了解冷冻电镜技术在未来药物发现中的作用，我们(作者)还调查了2018年取得最高利润的200种药物，以代表那些市面上新进发现的药物(图1, E)，我们简称新药。这批新药和之前提到的那些最常用的药物之间存在明显的差异。相当一部分新药已经用晶体学进行了表征，反映了结构数据在当今药物研发工作中的重要性：即便不是由结构驱动的，也很少有不追求结构的情况，因为结构信息可以为先导化合物的优化和进一步发现提供关键数据。此外，考虑到漫长的药物开发时间，冷冻电镜这一最近几年才崛起的新技术在这份名单中的占比虽小，但贡献仍相当可观。这些药物和靶点包括生物制药、离子通道和GPCRs，以及其他不适合结晶的高活性大分子。冷冻电镜对SBDD的贡献解析新型结构虽然有许多FDA批准的药物靶点结构可被X射线晶体学解析，冷冻电镜正在为越来越多的难结晶、甚至不可结晶的靶点打开大门，如分子量更大、更动态的蛋白质和蛋白质复合物。冷冻电镜也显著降低了对细胞内复合体的研究难度，如病原体的核糖体、染色质修饰复合体和转录机器。例如冷冻电镜技术近期解析了一种与线粒体体RNA聚合酶复合体相关的first-in-class 抑制剂的结构。值得注意的是，在膜蛋白领域，冷冻电镜的贡献无可比拟。不管是传统的药物，还是新型处方药，很多药物靶向针对GPCRs、离子通道和转运体蛋白。然而，利用X射线晶体学手段来解析膜蛋白的结构非常困难。尽管脂质立方结晶在GPCR领域取得了一些进展，但在结晶过程中，GPCR蛋白通常需要进行热稳定突变，或融合其他蛋白进行改造，以促进晶体的形成。并且，为了获取某种改造后的稳定的构象，还需要对克隆构建、实验方法及条件进行大量繁琐复杂的筛选。相比之下，冷冻电镜结构可以直接用来解析经过去污剂或纳米盘处理后的在生化上性质稳定的膜蛋白，并获得处于或者接近生理状态的蛋白的结构。冷冻电镜的在解析庞杂的膜蛋白的结构中能力势不可挡，并且已有大量的高分辨率结构被成功解析。长久以来膜蛋白一直都是获批药物的热门靶点，它们的结构也只是近期才被冷冻电镜揭示(图2)。图2. G蛋白偶联受体、转运体(上排)和离子通道(下排)，每个受体有相应的FDA批准的配体分子(蓝框)。利用冷冻电镜解析膜蛋白结构的突出进展，部分原因受益于新试剂的设计和使用。这些试剂可以在体外纯化过程中维持跨膜蛋白的结构，在冷冻制样过程中保护蛋白，并为高分辨率的结构解析提供均质样品。去垢剂如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地从细胞膜上溶解跨膜蛋白，并维持蛋白质的生理状态构象。去垢剂的使用也会产生一些问题，如去垢剂形成的空胶束和与包裹蛋白质的去垢剂同时存在存在会引起样品的不均一，对后期的数据处理处理产生影响；也可能会导致冷冻样品制备时的气液界面收到破坏，产生一些不好的结果。脂质纳米盘是去垢剂的一种替代品，原则上可以为结构和生物物理研究提供接近胜利状态的脂质双分子层。脂质纳米盘在膜蛋白药物靶点上的应用已经非常关键和广泛。举例而言，将纳米盘与冷冻电镜技术相结合，成功阐明了TRPV1和TRPV5离子通道(在TRPV1的情况下，脂质对抑制剂的结合至关重要)、GABAA配体门控离子通道、人类P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin复合物的高分辨率结构和机制。关于纳米盘的进一步介绍可查阅。冷冻电镜还可以用来解析嵌入脂质体中的蛋白质的结构，允许在更接近生理状态的的电化学梯度中对离子通道以及孔蛋白进行可视化研究。在过去的几年中，冷冻电镜也在生物制药领域产生了巨大影响。在较新的药物中，生物制药的占比正越来越高。如果仅将目光聚焦于药物靶点识别这一领域，生物制药的结晶技术确实称得上有所改善。然而，冷冻电镜已经为一些关键的生药物研发提供了基于全长蛋白的结构信细节息胰岛素受体一种二聚化的酪氨酸激酶受体蛋白，在调节人体的葡萄糖平衡方面起着关键作用。胰岛素受体信号通路的失调会引起一些疾病，如II型糖尿病，全球约有9.3%(4.63亿人)受到影响两个独立的研究小组利用冷冻电镜在胰岛素受体结构解析方面取得了突破进展；第一个小组以4.3Å和7.2Å的分辨率分别解析了与一个或两个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构，第二个小组以3.1Å的分辨率获得了与四个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构(图3, A)。这些结构解释了胰岛素受体结合胰岛素的不同结合位点，以及激活这一关键药物靶点所进行的构象变化。类似的例子比比皆是：从HER2-trastuzamab-pertuzumab复合物到SARS-CoV-2和中和抗体的结构解析，冷冻电镜为生物治疗的新老靶点提供了新的视点，为进一步发现和开发仿制药和first-in-class药物铺平了道路。另一个值得注意的例子是B淋巴细胞抗原CD20，它是治疗白血病和自身免疫性疾病的一个重要的治疗靶点，尽管其功能作用仍不清楚。尽管CD20的分子量较小，只要35kDa左右，但分别与单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法图单抗(ofatumumab)和奥比努单抗(obinutuzumab)的Fab结合形成复合物后，都解析获得分辨率较高的CD20复合物结构(图3, B)。负染结果显示，利妥昔单抗与CD20结合后，可诱导形成高度有序的高级结构，这一发现对激活先天免疫的补体系统提供了全新见解。由于复合物中的高度动态和跨膜结构域的存在，利用结晶手段结构解析几乎不可能实现，冷冻电镜技术的应用实现了这一可能。图3.冷冻电镜(cryo-EM)在小分子和生物制药发现方面的效用。(A)与胰岛素结合的胰岛素受体(PDB ID 6PXV)和(B)CD20与利妥昔单抗复合物(PDB ID 6VJA)冷冻电镜密度图。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)将小分子PETG精确地建模到β-半乳糖苷酶的冷冻电镜图像中。(D)基于片段的PKM2的发现，冷冻电镜密度允许正确识别和放置发现片段(PDB ID：6TTF)尽管冷冻电镜在膜蛋白结构测定领域已经迈出了一大步，但短板仍然存在。其中一个短板是解析小于50-70kDa的没有明显的胞内或胞外结构域的单体膜蛋白，由于几乎没有胞外结构域特征，因此难以对去垢剂胶束或脂质纳米盘进行降噪处理，以这种方式收集到的数据难以产出高分辨率结构，比如解析没有上下游偶联蛋白的处于非活性状态的的GPCR结构。然而，大量的蛋白质属于这一类型，解析这一类型的的膜蛋白因此也成为了一个重要的研究领域。目前，有一些解决方案正处于研究阶段，且已经取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。随着利用增加融合蛋白、抗体片段、纳米抗体、纳米抗体衍生物或其他支架蛋白以增加靶点蛋白的分子量等方法的应用，预计冷冻电镜在膜蛋白结构测定方面会有更多进展。计算赋能冷冻电镜冷冻电镜单颗粒技术利用数百万个颗粒的可视化投影来重建静电势图，这通常涉及数十万亿字节的原始数据。因此，该方法从计算方法的快速发展中获益匪浅，这些计算方法同时满足了对更高的分辨率的需求并加深了对粒子动力学的理解。然而，与X射线晶体学相比，冷冻电镜在获取配体-靶点复合物的高可信度模型时仍然面临着一些难题。其中一个难题是冷冻电镜难以解析得到高于2.5Å的蛋白结构，而这通常是建模人员能够精确放置配体并解析出结合位点处水分子的最低分辨率。此外，冷冻电镜的结构建模流程与晶体学完全不同：在晶体学中，模型和密度图之间有一套严格而完善的统计测量方法，该方法能够提供和模型精度相关的关键信息。而在冷冻电镜方法中，基于密度图的建模是一个完全独立的过程，仅适用收集的电镜投影来进行密度图重构，然后基于密度图进行结构建模和实空间下的微调。该过程的独立性使得模型的精度被降低了。这一问题在最近已得到改善。此外，两种方法之间还存在一些物理上的差异，如晶体学依赖电子密度图，而冷冻电镜依赖静电势图。这些差异加在一起，使得晶体学的模型验证工具无法应用于冷冻电镜模型。因此，我们可能需要为精确性开发一些新的指标。一种解决方案是使用强大的计算技术和精确的分子力场对大分子及其配体在冷冻电镜结构中的相互作用进行模拟。比如PHENIX软件包结合实空间和傅里叶空间微调和OPLS3e力场的分子动力学模型，从而生成生物分子和小分子的几何统计精修模型。OPLS3e微调工具已经被整合进到我们(作者)的自研软件GemSpot，它将各种计算方法整合为一个工作流程，从而提高冷冻电镜密度图中配体位置的准确性(图3C)。新的计算工具也推动冷冻电镜在基于片段的药物发现(Fragment-based drug discovery)中发挥作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多个不同结构的化合物组成的生物分子靶点中。解析复合体的结构可以解释配体与结合口袋之间关键位点的相互作用，然后可以将其组合成一个先导化合物。然而，这种方法要求配体密度质量高、分辨率高，才能正确区分配体的姿态和原子类型，目前对于冷冻电镜来说还是一个难题。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和颇具治疗意义和挑战性的激酶PKM2的场景中成功地将冷冻电镜用于FBDD。尽管他们为了将配体置放于密度图中，而不得不将干法和湿法实验结合，但他们成功地建立了一个与β-半乳糖苷酶结合的大约150kDa的精准片段模型。更令人印象深刻的是，他们能够从四种化合物的鸡尾酒中确定哪些片段与PKM2结合(图3, D)。因此，不断发展的计算方法为冷冻电镜密度图的构建提供了一个强大的平台，可以在高分辨率下对大分子复合物进行建模。冷冻电镜的快速发展可及性与通量的提升冷冻电镜是极为精密且昂贵的仪器，需要大量的费用和人力成本来搭建、维护与操作。这一特性在很大程度上限制了冷冻电镜的发展，并将冷冻电镜的机时资源集中在了那些受政府资金扶持的大型机构上。因此，在科研界中，冷冻电镜资源的获取门槛极高。然而，这一门槛正在被逐渐降低：许多国家级设施都启动了冷冻电镜人才培养计划，以降低冷冻电镜运维的人力成本。一些大型制药公司也开始进行内部投资，设立最先进的冷冻电镜设施。此外，冷冻电镜设施的可复制性远超晶体学极其昂贵的同步加速器和线性加速器，使得该技术更有发展前景。随着100kV电子束技术的发展，未来可能会出现性价比极高的冷冻电镜，增加其在药物发现领域中的应用场景。鉴于2018年FDA批准的药物中有49%来源于中小型公司，降低冷冻电镜的成本将使冷冻电镜技术得到更广泛的应用。最近对SARS-CoV-2相关蛋白的结构表征证明了冷冻电镜的无限潜力。在病毒爆发后的几个月内，科学家们利用冷冻电镜，以极快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的几种构象，以及它与人源血管紧张素转换酶或许多中和人源抗体片段的复合物的结构。最近获得FDA批准的用于治疗COVID-19的再利用药物瑞德西韦(Remdesivir)与SARS-CoV-2 RNA聚合酶结合的结构也已被冷冻电镜解析。鉴于X射线晶体学一直是病毒RNA聚合酶结构测定的传统方法，对新冠病毒的冷冻电镜结构解析是一个颠覆性的创新，凸显了冷冻电镜的高时效性特点在快速反应研究中的应用。此外，冷冻电镜的分辨率仍在大幅提高，最近的一份报告指出，作为冷冻电镜的代表性复合物结构，去铁蛋白apoferritin的分辨率达到了1.25Å，该分辨率足以对单个原子进行精准定位，在某些情况下甚至可以解析氢原子和质子化态。毋庸置疑，在样品制备良好的情况下，冷冻电镜的不断改进将持续打破结构解析的分辨率记录。冷冻电镜在药物发现和开发方面的应用将进一步受益于该技术的全面自动化。在载网准备方面，一些自动化工具正在出现，以解决不可重复性和样品浪费的难题。这些技术的改进不仅会提高自动化的程度和可及性，还可能解决冷冻电镜载网制备中的其他难题，如减少颗粒在空气及水中的暴露程度。此外，机器学习方法和深度神经网络也是提高颗粒筛选速度和准确性的关键。这些自动化方法甚至有望在未来成为冷冻电镜的核心技术，从而推动冷冻电镜在药物发现领域的发展。主流硬件和软件的改进也有望提高冷冻电镜在SBDD领域的可及性。例如，更高效的检测设备能显著提高冷冻电镜的产能。在一个标准的数据收集过程中，老式的检测器相机可以每次收集1个影像，每小时产生50个影像，而较新的检测器可以每次收集9-16个影像，每小时可以产生超过200个影像，进而转化为每24小时收集的数百万颗粒投影数据。此外，虽然今天许多最高分辨率的结构是用300kV冷冻电镜获得的，但这些机器非常庞大，且前期和维护成本昂贵。在许多情况下，对于单颗粒分析中使用的薄样品，200kV的显微镜可能就足够了，甚至100kV的显微镜也可以用来获得分辨率高达3.4 Å的结构。分子动力学的新窗口结合硬件和数据处理方面的改进，冷冻电镜的潜力将进一步被释放。当X射线晶体学受限于结晶条件而无法解析时，冷冻电镜的低样品需求大幅降低了数据收集的门槛，使我们得以看到样品的构象连续体或一系列不同的能量最低状态，为大分子动力学提供了新的窗口。图4.单一的冷冻电镜数据集，投影的三维分类显示了两种不同的构象，代表了两种不同的G蛋白偶联受体-G蛋白相互作用的状态，代表了两种热力学上可比较的构象。在典型状态下(左边，PDB ID 6OS9)，受体以典型的方式与G蛋白结合，其中核苷酸结合口袋为GTP结合做准备。在非经典状态下(右图，PDB ID 6OSA)，G蛋白异源三聚体与经典状态相比旋转了45°，代表了沿G蛋白偶联途径的中间配体结合受体状态。缩写：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷冻电镜；TM=跨膜螺旋。一些计算工具，例如二维和三维分类以及子区域的重点细化，能够利用数据集内颗粒的异质性来模拟大分子活性成分的运动。在我们(作者)小组最近的一个例子中，对神经紧张素1受体的冷冻电镜单颗粒分析结果揭示了先前识别的G蛋白、激动剂结合状态和G蛋白偶联通路上的一个新的中间状态(图4)。最近，我们(作者)还将AI深度学习网络应用于冷冻电镜数据集，揭示了26S蛋白酶体的构象动态，使解析出的结构细节达到了前所未有的原子级水平。随着分辨率和分类工具的不断改进，我们将获得更精细的构象变化。有了以上这些技术，再加上分子动力学模拟和机器学习方法等计算技术，我们将得以对配体结合的复杂过程进行更精确的建模，从而揭示全新的、可成药的中间状态。结语尽管冷冻电镜已经在SBDD领域取得了飞跃性的进展，但它的潜力远不止于此。在三维分析重构及深度学习算法等领域，若能将计算工具与更大、更高质量的数据集结合并进行训练，我们将能够描述蛋白质甚至其配体的更小幅度、更高分辨率的动态运动。我们还期望冷冻电镜在时间维度上的结构解析方法将使人们对大分子复合物的结合和解离过程有更深了解，为靶向药物的研发提供更多思路和机会。目前晶体学和大多数冷冻电镜结构所提供的只是能量最小值的瞬间结构，但对于开发新的药物作用模式而言，对机制和中间状态的理解至关重要，所以我们若能获取构象的动态信息，则对理性药物设计具有突破性意义。在综合了冷冻电镜的软硬件及方法的快速发展之后，我们可以得出结论：冷冻电镜有望为药物发现和人类健康做出巨大贡献。词表：1. 激动剂一种通过增加受体活性以产生生物反应的物质。2. 拮抗剂(也称中性拮抗剂)一种能阻断激动剂或反向激动剂的物质，在不存在激动剂或反向激动剂的情况下便没有活性3. 生物制药在生物活体中制造的药物，可能含有重组蛋白、糖类、基因疗法或核酸。4. 电子密度图电子密度与晶体中每一个晶胞位置的关系图，以二维或三维表示，由解析X射线衍射图案得出。5. 静电势图(即库仑势图)即样品中电荷分布的二维或三维表示。在电子显微镜中，静电势图由电子被与样品相互作用时产生的库仑力散射而产生。6. 基于片段的药物发现FBDD一种药物筛选方法，以评估小分子量的化学片段与期望靶点相结合的能力的方式，确认后续的药物化学实验方向。7. 反向激动剂一种通过减少受体的基础活性以产生生物反应的物质。8. 脂质立方相结晶基于脂立方相的蛋白结晶技术，采用脂立方相模拟生物膜环境，膜蛋白可以在脂质双分子层中相互接触，在合适的条件下形成晶体。9. 脂质纳米盘一个纽扣电池形状的盘状脂质双层，由两个环绕的两亲性螺旋蛋白(膜支架蛋白)稳定并使其可溶于水。10. 冷冻电镜负染一种将重金属盐染色剂嵌入并固定在生物标本上，并在室温下进行电子显微镜成像的技术方法。尽管只能在低分辨率(~2纳米)下观察标本的形状，但这种技术对于简单和快速评估样品质量是很有价值的。11. 时间分辨的冷冻电镜方法在动态构象转变的特定时间间隔内对生物样本进行速冻，并使用冷冻电镜技术进行可视化的方法。