甘露醇

40多年来，对不稳定样品采用冻干剂型一直是制药界的共识。然而，这带来了一些挑战，得到完美且坚固的冻干饼外观就是其中之一——这决定了样品是否可以承受冷冻干燥后的运输和保存等过程。目前主要对冻干蛋糕进行定性分析以确定蛋糕外观是否稳定，但这样的分析得到的结果比较主观，无法提供进一步分析所需要的数据。 图1：定性分析结果合格的冻干饼（左为甘露醇，右为葡聚糖）如图1所示，葡聚糖和甘露醇这两种截然不同的赋形剂可用作冻干制剂中的填充剂或热稳定剂。冷冻干燥后，葡聚糖和甘露醇都会产生白色的饼状物，并且看起来结构相似，很可能在生产后通过质量控制的目视检查。然而，含有这些赋形剂的冻干蛋糕可能具有非常不同的物理特性，这可能会影响蛋糕在运输后的外观，以及它们的复原速度。因此需要一小批来提供关于冷冻干燥产品在运输过程中保持稳定的概率的定量数据。1、MicroPressMicroPress提供关键数据 图2：MicroPress冻干饼强度定量分析仪MicroPress是一种可以原位定量测定冻干饼强度和物理特性的仪器。通过设置参数和分析方法，MicroPress将能够分析您的冻干饼结构。这允许对您的产品进行快速有效的批量筛选，节省大量时间和人员成本。使用MicroPress可以在不到一分钟的时间内完成冻干饼的定量分析。MicroPress能够提供关键数据，说明所生产的产品是否能够在从制造现场到临床现场甚至到当地药房的潜在破坏性过程中幸存下来。虽然 MicroPress 分析会在冻干饼表面留下一个小凹痕，但仍可用于其他类型的分析如Karl-Fischer和DSC，以提供更多信息。2、如何使用MicroPress分析冻干饼？如表1所示，根据浓度对样品溶液进行区分，并稀释到100ml水中。容器为6ml玻璃小瓶，每个小瓶填充2ml：样品浓度配方编号甘露醇10mg/ml120mg/ml230mg/ml3葡聚糖10mg/ml420mg/ml530mg/ml6 表1：配方详情列表这些小瓶采用如表2中所示的方法进行冷冻干燥。所有样品均使用相同的一组参数进行分析，使所有样品充分预冻并尽可能增大结晶的尺寸，然后再进行初级干燥步骤。在初级干燥阶段，降低压力以促进冰的升华，从而更快地干燥产品。所有样品都放在冻干机的同一托盘上，以控制干燥过程中出现的变量。预冻程序StepTemp(℃)Time(min)Vacuum(mTorr)Ramp/Hold1205OffH2-40120OffR3-40120OffH干燥程序StepTemp(℃)Time(min)Vacuum(mTorr)Ramp/Hold1-4600100H20801006302700100H4204050R52072050H 表2：冻干程序详情列表所有样品均使用MicroPress上的相同参数设置进行分析（见表3）。MicroPress采用人性化的软件设计，参数设置简单，随时可根据需要进行更改。阶段速度（mm/s）压头延伸10定位0.1*次挤压0.05第二次挤压4停止- 表3：MicroPress运行程序延伸阶段以10mm/s的速度将压头移动到预估冻干饼高度的5mm以内；定位阶段找到蛋糕的顶部；一旦检测到顶部，就会开始挤压冻干饼，然后记录施加在冻干饼上的力。从图3（左）可以看出，3%葡聚糖显示出弹性特性，这个特性由减压阶段从40%应变返回到18%应变的曲线得到证明。图3（右）描绘了3%甘露醇冻干饼的*结果，它显示了与3%葡聚糖非常不同的图表。右图显示了一个易碎的饼体，它无法承受太大的压力。 图3：3%葡聚糖（左）与3%甘露醇（右）在MicroPress中的分析图像甘露醇的浓度从1%增加到2%的过程中，杨氏模量（Youngs Modulus）从最弱到最强增加了近10倍（图4左）。但从3%甘露醇的强度并不比2%高 ,相反3%甘露醇冻干饼的平均杨氏模量降低了，但相比2%浓度的标准偏差有所增加，样本之间的差异变得更大。图4右显示提升葡聚糖浓度的结果是得到了比甘露醇强得多的冻干饼，且葡聚糖的浓度从1%到3%，冻干饼的杨氏模量增加了107%，发生变形所需的力倍增。由于蛋糕的整体强度超过了MicroPress 的测量范围，无法确定其能承受的*应力。然而，这可以通过更小直径的压头来解决，以确保能达到被测量冻干样品的*应力。 图4：不同浓度的甘露醇（左）和葡聚糖（右）得到的平均杨氏模量结果从以上结果可以看出，MicroPress能够确定蛋糕的杨氏模量和冻干饼在结构破坏前所能承受的*应力。上述的结果表面，对于塑造更好的冻干饼外观，甘露醇的性能不及葡聚糖。杨氏模量和*应力也与冻干配方中赋形剂的浓度相关——浓度越高，冻干饼越结实。甘露醇相对缺乏稳定性和强度可能与许多因素有关，比如冻干饼的孔径和多态性。 图5. 由MicroPress记录并分析的各个样品的强度数据结论MicroPress清楚地定量分析了冻干样品的强度和物理特性。它的分析过程可以得到更精确的冻干饼强度数据，因此更确定冻干样品在整个运输和处理过程中保持外观和性能稳定。这些结果证实甘露醇使用甘露醇作为赋形剂来增加蛋糕强度可能并不是一个理想的选项。

随着生物制药的迅猛发展，冻干已经成为一种有效的技术来解决制药过程中存在的化学，物理，生物的不稳定性问题。结合冻干本身的技术特点，冻干产品开发的*目的是要保证产品质量的同时利用最短的生产时间来节约成本。产品的质量包括安全，高效，稳定，较短的复水时间，优雅的蛋糕外观等。众所周知，冻干是一个复杂的传热传质的过程，如果处理不当，在冷冻以及干燥过程中，样品中的活性成分以及赋形剂会发生一些物理或化学变化，从而破坏了各自原有的功能特性，因此需要进行采取合理的方法来加以解决，从而达到冻干制剂开发的*目的。 预冻阶段 样品溶液随着温度的降低，含有的水先冻结成冰晶析出，剩余的溶液的浓度越来越大，形成*浓缩冻结液，溶质和溶剂分离，在这个阶段，水分的结晶会导致蛋白浓度增加，赋形剂浓度增加，离子强度增加，粘度增加，赋形剂结晶或相分离，pH改变等，这些可能会影响到蛋白的稳定性。 干燥 结晶的冰通过升华去除，未结晶的冰通过解吸附去除，样品中的水分含量是一个动态变化的过程，样品会面临水分去除产生的应力，即干燥应力，导致配方中成分发生一定的变化。 储存 较低的水分含量，温度的偏差，赋形剂的相分离。常用赋形剂的功能性及物理状态赋形剂期望的物理状态常用成分保护剂/稳定剂无定形蔗糖，海藻糖填充剂晶体甘露醇缓冲液无定形磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，柠檬酸盐缓冲液等表1：常用赋形剂的功能性及期望的物理状态然而在冻干过程中，活性成分以及赋形剂之间具有复杂的相互影响，不同的浓度，不同的比例，不同的种类等都会引起一些结构状态的变化，从而导致其原本的功能丧失，比如：若海藻糖结晶会导致保护功能的丧失；若甘露醇变为无定形结构，会降低产品的关键温度，并且无定形态具有较差的稳定性，丧失了其作为填充剂的功能；若缓冲液成分结晶，会导致pH值的变化，缓冲功能丧失，蛋白稳定性受到影响。因此研究各个配方组分之间的相互影响作用对确保*产品的质量具有较大的作用。 01.糖类和填充剂功能性之间的相互影响 双糖是最常用的冻干保护剂，如蔗糖，海藻糖，双糖与蛋白的最小质量比通常为3:1到5:1，但是糖类通常会降低样品的玻璃态转化温度，使得冻干通常会花费较长的时间，因此会将糖类跟具有较高共晶融化温度的填充剂结合使用，如甘露醇，甘氨酸，这样可以让样品在较高的温度下进行干燥，形成良好的外观结构，节约干燥时间(Tang and Pikal, Pharm Res. 2004 Johnson, Kirchhoff and Gaud, J Pharm Sci. 2001)。市面上有一些药品就是以这种方式开发的，如阿必鲁泰（Tanzeum），是一种融合蛋白，糖尿病患者用药，配方中含海藻糖以及甘露醇成分；沙格司亭冻干粉注射剂（Leukine）是一种源于酵母的重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），能够刺激各种免疫细胞的生长和活化，已用于白血病患者降低感染风险，配方中含蔗糖和甘露醇成分；鲁磨西替（Lumoxiti）是一种单抗抗癌制剂，配方中含蔗糖和甘氨酸成分。 图1：阿必鲁泰（Tanzeum）这种结合的有效性取决于：在冻干和储存过程中两种赋形剂的物理形态；正确的比例以及冻干条件。理想状态下，整个过程中糖类应当处于无定形状态，起到稳定剂的作用；填充剂在干燥之前应当充分结晶，使得样品具有良好的结构强度，提高关键产品温度，缩短冻干时间。 Part.1 蔗糖对甘氨酸填充剂结晶的抑制影响实验通过将蔗糖和甘氨酸以不同比例（从1:9到9:1）溶解于水中，分别在15℃退火1h 和不进行退火，冻干后样品通过近红外光谱测定甘氨酸的结晶度。观察到当蔗糖：甘氨酸＞4时，甘氨酸失去了其填充剂的功能（Bai et al., J Pharm. Sci. 2004）。 图2：蔗糖对甘氨酸填充剂功能的影响Figure plotted from data given in Bai et al., J PHarm. Sci. 2004 Part.2 海藻糖+甘露醇功能性的相互影响不同比例的海藻糖+甘露醇溶液进行冻干，二者的比例决定了各自的物理形态以及其发挥的功能性（Jena, Suryanarayanan and Aksan, Pharm Res. 2016）。海藻糖：甘露醇甘露醇的物理形态海藻糖物理形态3:1无定形无定形2:1晶体晶体1:1晶体晶体1:3晶体无定形表2：海藻糖和甘露醇比例对其物理形态及功能性影响海藻糖在酸性条件下不会水解，具有较高的玻璃态转变温度，但是具有结晶倾向性。当冻干的条件利于海藻糖无定形形态存在时，会抑制甘露醇的结晶，相反，当冻干的条件利于甘露醇结晶形态存在时，会促进海藻糖二水合物的产生，失去其无定形结构，二者相互抑制，因此需要确定*的一个比例条件，确保各自能发挥本身应起的作用。从实验结果来看，当海藻糖和甘露醇比例为1:3时，甘露醇保持其原有的晶体形态，海藻糖保持其原有的无定形态，在配方中分别起填充剂和稳定剂的功能（Sundaramurthi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Letters 2010 Sundaramurthiet. al., Pharm. Res. 2010 Sundaramurthi and Suryanarayanan, Pharm. Res. 2010 ）。 Part.3 海藻糖、API（BSA）和甘露醇的相互影响海藻糖—BSA---甘露醇冻干混合液，海藻糖和BSA的不同比例对海藻糖物理形态的影响，甘露醇浓度固定在10%W/W，总的固形物含量22%W/W（Jena et al., Int J. Pharm.2019）。BSA：海藻糖甘露醇物理形态海藻糖物理形态 _ _冻结过程中干燥产品中10:1δ-甘露醇无定形无定形2:1MHH, δ-& β-mannitol海藻糖二水合物部分结晶1:1海藻糖二水合物部分结晶1:2海藻糖二水合物无定形表3：BSA和海藻糖比例对海藻糖物理形态影响实验结果表明当BSA与海藻糖比例为10:1时，海藻糖能起到良好的稳定剂作用。 Part.4 蔗糖和甘露醇的相互影响除了抑制作用外，糖可能会改变甘露醇的存在形式，甘露醇有几种形态存在，无水甘露醇（α-，β-，δ-）和半水合物-MHH。研究发现当蔗糖：甘露醇为1:4时，蔗糖会保留无定形态，甘露醇为结晶态（部分以MHH形式存在），MHH甘露醇在*的干燥产品中是不希望存在的，在储存的过程中，MHH会脱水，释放水分，水分可能会跟产品中的其他组分进行反应，无定形状态的蔗糖吸收水分后会发生结晶，从而失去了对活性成分的保护功能（Thakral, Sonjeand Suryanarayanan, Int J. Pharm. 2020）。因此，综上所述，开发稳定的冻干产品配方，并达到期望的产品质量属性，需要正确地选择赋形剂的浓度，包括糖与填充剂的比例，蛋白与糖的比例，并且需要对冻干条件进行优化。 02.API/赋形剂对缓冲液功能性的影响 缓冲液需要加入到溶液中进行pH的控制。常见的缓冲液包括磷酸钠缓冲液，磷酸钾缓冲液，组氨酸缓冲液，tris 缓冲液，柠檬酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液等。冻干产品缓冲液的选择需要考虑蛋白的pKa以及缓冲液组分的结晶倾向，如磷酸钠缓冲液中，酸性的磷酸二氢一钠是无定形态；碱性的磷酸氢二钠在冻结过程中会结晶成Na₂ HPO₄ 12H₂ O，导致冻结浓缩液的pH降低，失去了缓冲液的功能，因此缓冲液成分的结晶往往是不期望的。 Part.1 缓冲液，蛋白，糖之间的相互影响有实验研究了10mM 磷酸钠缓冲液，100mM 磷酸钠缓冲液，含5% w/w的纤维二糖，纤维二糖，在低pH下不会水解，不会结晶（通过在冻结过程中测定其pH值以及使用原位X射线衍射仪对结晶组分进行鉴定）以及100mM 磷酸钾缓冲液三种缓冲液与纤维二糖，蛋白之间的相互影响，如下表所示（Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel.2020）——缓冲液糖蛋白pH变化Na₂ HPO₄ 12H₂ O结晶100mM磷酸钠--- _4.1YES5%W/W纤维二糖 _1.1NO---10mg/ml BSA3.1YES5%W/W纤维二糖10mg/ml BSA1.0NO10mM磷酸钠 _ _2.8YES _10mg/ml BSA0.6NO100mM磷酸钾 _ _-0.2--- _10mg/ml BSA-0.2---表4：缓冲液、糖及蛋白成分对pH变化的影响样品中活性成分蛋白、糖与缓冲液之间具有协同作用，蛋白可以抑制缓冲液结晶，使其保持无定形状态，缓冲液反过来可以维持特定的pH值，增加蛋白的稳定性；一定浓度的糖可以抑制缓冲液的结晶，保持其无定形态，从而维持特定的pH值，提高蛋白稳定性。 Part.2 甘氨酸对磷酸钠缓冲液结晶以及pH变化的影响磷酸钠缓冲液浓度甘氨酸浓度（%W/V）pH改变10mM无定形~1.50.4~0.50.8~2.5＞0.8~2.7100mM--~3.20.4~2.70.8~2.4＞0.8~2.8表5：甘氨酸对磷酸钠缓冲液结晶以及pH变化的影响在10 mM缓冲液中，甘氨酸浓度越高，pH值变化越明显，另外通过用同步X射线衍射法监测溶质结晶程度，磷酸盐缓冲液对甘氨酸结晶具有浓度依赖性抑制作用，20%W/V甘氨酸和50-200mM缓冲液，缓冲液浓度越高，抑制作用越强，并且在-20℃进行退火处理，能够增强甘氨酸的结晶度。pH的改变能够引起蛋白凝聚，可以通过降低缓冲液浓度，使用不结晶的缓冲液，通过蛋白，糖来抑制缓冲液结晶，并且某些蛋白本身就具有pH缓冲的功能（Pikal-Cleland et al., J. Pharm. Sci. 2002；Varshney et al., Pharm. Res. 2007；Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel. 2020 Sundarmurathi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. B. 2011 Gokarnet al., J. Pharm. Sci. 2008）。 03.总结 冻干配方成分之间具有复杂的相互作用，某些组分可以通过改变其他组分的相行为来影响其功能性，必须正确选择配方中赋形剂的浓度，使得每种成分能够维持其*的物理形态，发挥应有的功能性。评论抽免费礼品活动时间：12月1日-12月31日本轮活动奖品：兔年定制日历/挂历（奖品见下图）活动参与方式：1. 在德祥Tegent公众号12月中，发布的任意一篇文章后评论，评论越精彩，中奖几率越大；2. 我们将会在每篇文章后评论的粉丝中抽取一名幸运粉丝，送出奖品；3. 中奖名单将会在下一期推文公布！记得要关注德祥不要错过哦！4. 中奖的粉丝请将收件信息发送到德祥Tegent公众号后台，包含：姓名、联系方式、收件地址；5. 12月1日-12月31日内，每周每篇的推文文后进行评论，都有机会获得不同的奖品。 *图片来源于网络，旨在分享，如有侵权请联系删除

之前我们在《干货分享 | 冻干样品配方的关键温度的测量》中，就已经聊到过关键温度对于冻干工艺的重要性。在冷冻干燥过程中，产品应保持在其关键温度以下，如玻璃化转变温度(Tg’），共晶点(Teu)和塌陷温度(Tc)，以确保一个安全和稳健的循环，并减少产品冷冻干燥后出现的有害缺陷的风险。缺陷可能包括但不限于产品内的物理塌陷或微塌陷、活性丧失和高水分含量。微塌陷程度是最具挑战性的量化缺陷之一，许多配方由于药物活性丧失而在*个周期失效。一、如何量化微塌陷程度？MicroPress 微压力冻干饼分析仪 MicroPress 微压力冻干饼分析仪是一款由Biopharma公司完全开发的创新仪器，用于量化低密度材料中的原位微观缺陷，特别是在所有冻干产品中。例如，甘露醇经常用于配方中，它具有较高的关键温度，可以掩盖具有明显较低关键温度的产品的塌陷。葡萄糖的关键温度在-41℃左右，当与甘露醇结合时，如果干燥超过关键温度，就会塌陷。然而，由于甘露醇的膨胀性，该混合物尽管可能存在结构缺陷，但一旦冷冻干燥，就具有良好的外观。在保持甘露醇浓度不变的同时，可以通过改变葡萄糖的浓度来确定微塌陷的程度和饼状结构的影响。通常， 由于高温，用来冷冻干燥这种溶液的循环不会使葡萄糖足够冷冻干燥，因此可能会发生塌陷。相反，甘露醇会干燥足够的量来保持蛋糕的结构。然而， 由此产生的，看似不明显的微观的塌陷，会影响复水性，以及药物本身的稳定性和活性。以下是结合使用了MicroPress 微压力冻干饼分析仪的具体实验方法。二、具体实验方法1、配方溶液制备样品溶液的制备方法见表1。所有化学品均来自Sigma Aldrich。使用6ml西林瓶灌装2ml。表1：起始溶液的浓度2、样品冷冻干燥这些小瓶用表2所示的方法冷冻干燥。预冻让所有的样品被冷冻，使晶体尺寸增加，样品进入下一个阶段干燥。在干燥阶段，压力降低，使冰升华，干燥产品。所有样品都放置在冻干机的同一个托盘上，以控制干燥过程中的可见变量。 表2：在SP Scientific冷冻干燥机上使用的冻干工艺3、MicroPress测量与分析所有的样品都在MicroPress上使用相同的一组参数进行分析 ，通过用户友好的软件设计，参数很容易设置，并可以更改以适应任何要求。参数设置情况见表3。表3：MicroPress测试阶段及相应的速度Extend阶段的速度为10mm/s，与估计的蛋糕高度的距离在5mm以内。Seek阶段找到蛋糕的顶部，一旦感觉到力，Compress阶段开始，然后记录施加在蛋糕上的力。4、结果分析下表4显示了从配方分析获得的结果。配方1具有最高的杨氏模量，因此是最强的蛋糕。表4：获得的3种配方的强度结果● 配方1的平均杨氏模量为0.969 kPa，配方1中最强的值为图1中的橙色。该蛋糕的杨氏模量为1.246 kPa，*应力为17.600 kPa；● 图1中的另外两条曲线分别表示配方2 (灰色) 和配方3 (蓝色) 。配方2的杨氏模量为0.473 kPa，*应力为7 kPa；● 配方3（蓝色）看似比配方2（灰色）有一个更高的*应力，实际上真正的*应力在应变51%左右，杨氏模量为0.017 kPa，*应力为2.660 kPa，是所有被分析的蛋糕中最弱的。 图1：使用MicroPress分析的三种配方图（配方1-橙色，配方2-灰色，配方3-蓝色）三、关于实验的讨论表4中为本次实验中获得的数据。甘露醇/葡萄糖样品溶液中的葡萄糖浓度越高，蛋糕的强度就越弱。传统的甘露醇被用作赋形剂，已知它对许多配方的关键温度有积极 的影响。然而，这可能掩盖了一个配方可能具有的一些关键温度。葡萄糖的塌陷温度为-41.0℃，当甘露醇冻干时，塌陷在甘露醇支架上。这种蛋糕看起来很结实， 眼见的外观良好，但当用扫描电镜或类似的技术分析时 ，晶格看起来更“湿润”，孔隙更宽。当用MicroPress分析时，增加葡萄糖浓度对材料强度的影响是非常明显的。蛋糕内的葡萄糖越多，物质强度就会减弱。当使用冷冻干燥显微镜(FDM)或差示扫描量热法(DSC)进行分析时，发现样品往往只显示甘露醇的结晶和熔化，而甘露醇有着强大的外部结构，掩盖了葡萄糖的玻璃化转变。关键温度分析只揭示了甘露醇的熔化，因此当产品冻干保持样品在-10℃以下，葡萄糖在主体材料中塌陷。因此， 由于葡萄糖的关键温度较低，甘露醇通常能够在标准的初级干燥条件下很好地干燥，而葡萄糖则不能。此外，当配方中的葡萄糖浓度增加时，蛋糕内的微塌陷程度增加，从而产生较弱的蛋糕。在储存或运输过程中，有微塌陷的材料更容易损坏或减少活性成分。四、*结论传统上，冻干样品的质量是由一些定性技术来确定的，包括；视觉评估，复水时间，与参考文献相比的外在强度，水分含量。然而，这是一种主观的分析，数据的质量可能取决于操作者的经验。Biopharma公司开发了这种压痕技术 ，并将其应用于冻干蛋糕，以减少主观性，并提供冻干产品的定性数据，以确定样品中是否存在产品缺陷。 配方中每个成分的关键温度与配方的整体关键温度同样重要，冻干产品在一个看似安全的温度会导致弱蛋糕由于冻干期间结构减弱和微塌陷影响蛋糕的强度。一旦材料被冻干，MicroPress可以用来测试得到的蛋糕的物理特性，以及它们是否在整体强度的所需参数范围内。在MicroPress上分析的蛋糕还可以使用卡尔-费休法测试水分含量， 如果需要玻璃化转变温度或熔点温度也可以使用mDSC进行测试。一旦确定了冻干样品的初始曲线，可以改变配方，增加其它辅料，这可能会影响冻干蛋糕强度。如表4所示，增加材料的浓度并不一定会增加蛋糕的强度。因此，如果在运输过程中发现蛋糕破裂或破碎的问题，则应进行轻微的改变，或包含或排除一种或多种辅料可能是有益的。