核酸酶

转座在生物体基因重塑过程中具有关键性的作用。IS200/IS605 和 IS607 家族的插入序列（insertion sequences, ISs）是最简单的可移动遗传元素之一，仅包含其转座和调节所需的基因。2021年9月9日，张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章（详见BioArt报道：Science | 张锋团队再发文：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）【1】，重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源，发现了3种高度丰富但功能未知的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶：IscB、IsrB和TnpB，并对IscB的蛋白功能进行了详细探究。该研究还发现TnpB可能是CRISPR-Cas9/Cas12核酸酶的祖先，推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。近日，来自立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys团队（CRISPR开创者之一，通过研究CRISPR-Cas9 生化性质，得出了Cas9酶可以定点切割DNA的结论，特别致敬CRISPR幕后的英雄们——最全的一份CRISPR英雄谱）在Nature杂志上在线发表了题为Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease的研究论文。研究人员通过一系列生化实验证实CRISPR-cas核酸酶的祖先TnpB是可重编程的 RNA 引导的功能性核酸酶。TnpB通过reRNA（right element RNA，长非编码RNA，来源于ISDra2转座子中的RE元件）引导去切割靠近TTGAT转座相关模块（Transposon associated motif, TAM）5’端的DNA，并可以切割人类基因组DNA。如图1所示，IS200/IS605家族的Deinococcus radiodurans ISDra2中包含tnpA和tnpB基因，以及位于两侧的LE（Left element）和RE（Right element）。在纯化TnpB的过程中，作者发现有许多RNA也被一同纯化。对TnpB结合的RNA进行small RNA测序（sRNA-seq）分析，发现它们大多是长度约为150nt的长非编码RNA，来源于ISDra2中的RE序列，作者将这些RNA称为reRNAs（right element RNA）。reRNA 3’端的16nt来源于IS200/IS605转座子的侧翼DNA序列，其余序列与TnpB基因的3’端和RE序列匹配，说明TnpB可以与转座子3’端来源的reRNA形成RNP复合物。图1. D. radiodurans ISDra2位点PAM（protospacer adjacent motif）序列是Cas9或Cas12核酸酶启动DNA切割所必须的，那么TnpB发挥作用可能也需要类似的序列。通过PAM鉴定实验【2】，作者观察到在目标基因5’端上游富集了大量的TTGAT序列，并称之为Transposon Associated Motif (TAM)。体外DNA切割实验证实TnpB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。进一步分析发现，将TnpB序列中的RuvC-like活性位点突变后，TnpB失去了切割能力，说明RuvC模块与TnpB的活性相关。研究人员发现实现TnpB的DNA切割功能需要同时满足两个条件：（1）TAM序列；（2）与靶基因匹配的位于reRNA 3’端的序列。随后，作者对切割产物进行了测序分析，结果显示，TnpB采取的是一种交错切割模式，在NTS（non-target strand）的多个位置和 TS (target strand) 的单个位置进行切割，最终产生5’-悬挂端（overhangs）（图2）。图2. TnpB-reRNA复合物切割双链DNA的实验设计及流程最后，作者探究了TnpB在细胞内切割目标dsDNA的能力。首先，在E.coli中进行的质粒干扰实验表明TnpB可以在原核生物体内切割dsDNA。紧接着，作者想知道TnpB是否可以应用于切割人类基因组。将编码TnpB和reRNA的工具质粒转染至HEK293T细胞中，72小时后，提取基因组DNA（gDNA）测序分析目标切割位点中的序列插入和删除（insertions and deletions，indels）情况（图3）。实验结果显示，TnpB在两个测试靶点（AGBL1-2和EMX1-1）中引入突变的频率为10%-20%，这与之前报道过的CRISPR-Cas9和Cas12的效率类似【3-7】。进一步分析发现，切割位点引入的删除突变占主导地位，与Cas12切割谱中观察到的现象类似【5,7】。这些结果说明RNA引导的TnpB核酸酶可以切割真核生物的基因组DNA。图3. 利用TnpB编辑人类基因组综上所述，该研究从ISDra2系统中鉴定了一个新的具有dsDNA切割功能的核酸酶TnpB，其在原核和真核细胞中均能有效切割dsDNA，具有编辑人类基因组的巨大潜力。在进化树上，虽然TnpB与微型 Cas12f核酸酶的关系最为紧密，但作者认为两者之间依旧存在重大区别：（1）TnpB与Cas12f使用的guide RNA不同；（2）TnpB是单体，仅需要一个reRNA；而Cas12f 核酸酶是二聚体，需要结合一个拷贝的crRNA-tracrRNA duplex；（3）TnpB需要TAM序列，Cas12f需要PAM序列，两种序列截然不同。原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1

导语在实验过程中，最心累的莫过于好不容易提取的核酸却降解了。那么核酸为什么会发生降解呢，我们又该如何预防呢？关于核酸降解，你了解多少呢？让我们一起对核酸降解一探究竟吧。 什么是核酸 核酸是一种高分子化合物，核苷酸是构成核酸的基本单位。核酸水解后得到许多核苷酸，核苷酸是组成核酸的基本单位，即组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如果5-碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果5-碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。 核酸降解本质 核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键，或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解，使DNA/RNA链发生断裂。核苷磷酸化酶：能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。核苷水解酶：主要存在于植物和微生物体内，只水解核糖核苷。 核酸降解原因 DNA降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素。一、物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。二、化学因素：PH值，水解反应，氧化反应等。三、生物因素：酶解及微生物侵染等作用。一、物理因素的影响★ 温度：高温条件下，RNA不稳定，易加速磷酸二酯键的水解，使核酸降解；★ 机械剪切力：包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等，均会导致核酸的降解。二、化学因素影响水解★ PH值：氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解；★ 氧化反应：会氧化碱基中的含氨杂环，使其变性，从而改变一级与二级的核酸构象；★ 苯酚在空气中被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA的分离，会使磷酸酯键断裂，造成DNA的降解。三、生物因素影响★ 酶解：核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解。1.核酸酶(磷酸二酯酶)核酸内切酶：在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始，在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase，RNase等。核酸外切酶：核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3' -端或5' -端)开始，逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶等。2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)专一性的磷酸单酯酶：3' -核苷酸酶，5' -核苷酸酶非专一性磷酸单酯酶。★ 微生物侵染：微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。 预防降解的方法 预防RNA降解的方法:★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。★ 获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。★ 在总RNA提取分离的最初阶段，联合使用Rnase的特异抑制剂，尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。★ 避免样品的反复冻融。★ 保证裂解液的质量，裂解液的用量不足，也会导致RNA降解。★ RNA提取后，放入-80℃保存，防止降解。预防DNA降解的方法:★ 简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；★ 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏；★ 防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性；★ 减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等)；★ 避免样品的反复冻融，可将DNA分装保存于缓存液中；★ 所有试剂应用无菌水配制，耗材经高温灭菌；★ 避免DNA的过高温处理等。

仪器信息网讯 2015年6月17日，&ldquo 第四届中国食品与农产品质量安全检测技术国际论坛暨展览会&rdquo 在北京国家会议中心开幕。此次会议特别设置了&ldquo 食品与农产品中重金属元素和其他有害物质检测&rdquo 、&ldquo 食品与农产品安全微生物检测&rdquo 、&ldquo 饮用水安全检测&rdquo 等九个专题。大会第二天，来自中国科学院广州生物医药与健康研究院曾令文研究员在&ldquo 食品与农产品中重金属元素和其他有害物质检测&rdquo 专题中做了题为&ldquo 核酸生物传感器在重金属离子检测中的应用&rdquo 的报告。专题现场中国科学院广州生物医药与健康研究院 曾令文研究员　　在报告中，曾令文首先介绍了重金属污染的危害、污染源和污染特点。他说，随着工农业生产的迅速发展，食品污染问题越来越严重，重金属是最主要的污染物质之一，会通过食物链的富集最终残留在人体内，对人体的组织器官构成了严重威胁。重金属污染源主要有工业污染、农业污染、生活污染和环境事故污染等。具有不可逆转性、生物积累性、难以降解、生物催化以后毒性会转变等特点。　　同时曾令文提到，与其他国家相比，我国重金属污染相对比较严重。大气、土壤、水体都存在重金属污染的现象，污染一旦产生，面积会不断扩大。　　其次，曾令文在报告中详细介绍了目前重金属的检测方法。据他介绍，传统重金属检测方法主要有光谱法、电化学法和基于显色螯合剂的方法等。光谱法主要包括原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子荧光光谱法和分光光度法等方法。光谱法和电化学法需要借助相关的仪器进行检测，具有灵敏度高、特异性好等优点。但是样品处理繁琐、检测成本和技术要求较高，不利于基层单位使用。而基于显色螯合剂的方法具有简便快速、成本低等优点，但是灵敏度不足、其他离子会干扰检测的特异性。　　为了解决传统方法在检测重金属污染中面临的问题，在曾令文的带领下，课题组研制了两种新型生物传感器，基于核酸酶(DNAzyme)的传感器和基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器，并进行了大量实验验证方法的可行性和灵敏度。据他介绍，两种方法具有以下优点：简单、快速、检测成本较低 降低对仪器的依赖，肉眼即可观察结果 适合在基层实验室或野外使用等。　　在介绍基于核酸酶(DNAzyme)的传感器在重金属检测中的应用时，曾令文说，该方法在检测重金属离子时主要有两种方法，试纸条法和荧光法。　　试纸条法中主要制备了Pb2+和Cu2+特异性的DNAzyme检测试纸条，并进行相关实验进行检验。对于Pb2+来说，该方法检测限可以达到10pM，线性范围为10pM-100nM，特异性非常好，不受其他离子干扰，用湖水做回收率分析实验，结果可达88%-106%。对于Cu2+来说，该方法检测限可以达到10nM，特异性分析实验中，铜离子为0.3&mu M，其他离子为3&mu M。　　荧光法中，主要制备了铜离子检测的荧光传感器和基于比色法检测铜离子的传感器，铜离子检测的荧光传感器的灵敏度可达12.8pM，线性范围是20pM-1&mu M，特异性分析实验中，铜离子为1&mu M，其他离子为10&mu M。基于比色法检测铜离子的传感器，灵敏度可达240nM，线性范围是0.4&mu M-100&mu M，特异性分析实验中，铜离子为10&mu M，其他离子为100&mu M。　　在介绍基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器在重金属检测中的应用时，曾令文谈道，用该方法检测铅离子，灵敏度为5nM，线性范围为5-100nM，选择性分析实验中，铅离子为0.3&mu M，其他各离子为3&mu M。　　最后，曾令文总结了基于核酸酶(DNAzyme)的传感器和基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器在进行重金属检测中的优点，并展望了两种方法在未来重金属检测中的应用前景。　　编辑：张葳

研究背景Nature：清北团队合作发现CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生长进化模型CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高。现有的方法存在着种种局限性，例如优化序列可能破坏结构、改变表达方式可能导致副作用、使用辅助蛋白会增加复杂性等。因此，开发新的方法来增强Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系统研究中的一个重要课题。2024年5月29日，来自清华大学和北京大学的研究团队在Nature上合作发表了题为：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究论文研究团队通过生物信息学分析、结构生长轨迹分析、生化实验、冷冻电镜解析和大肠杆菌抗噬菌体实验等手段，发现了一类新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以显著增强Cas9核酸酶的活性。研究团队还建立了Cas9核酸酶生长进化模型，揭示了Cas9蛋白结构和功能的演变规律，并阐明了PcrIIC1增强Cas9活性的分子机制。这项研究为我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，以及开发基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具奠定了基础。研究思路通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程。图1. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。图2. 冷冻电镜分析CbCas9和PcrIIC1结合的三个阶段蛋白质与核酸的分子互作实验表明，与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。研究利用溶液中标记的分子互作方式获得亲和力，得出与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合（图3a）进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。图3. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和错配容忍 (e) 能力最后，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。图4. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性FIDA如何更好复现Nature蛋白与核酸互作发文思路流体动力分散技术（FIDA）通过第一性物理原理直接获取分子的绝对流体动力学半径（Rh），通过追踪分子微妙的变化来表征生物分子的行为、特征以及功能。Fida Neo分子互作仪涵盖亲和力表征、亲和动力学表征、分子质量表征三大功能，一次实验即可获得互作与分子质控的数据，让互作的数据有“法”可依。FIDA技术无需固定、无需加热，甚至无需标记，可兼容所有缓冲液，是对现有分子互作技术是一次不一样的升级。FIDA技术可用于CbCas9-PcrIIC1复合物冷冻电镜前样品质控，CbCas9-PcrIC1复合物与DNA的亲和力实验以及动力学实验，以及CRISPR- cas以及核酸复合物的大小和定量表征等方面，具体如下:FIDA多维蛋白复合体表征，快速无稀释优化冷冻电镜样品，丰富您的蛋白质表征数据。FIDA所获得的Rh为绝对的粒径大小，可以直接与后期的电镜数据做比较。此外FIDA内置的 PDB 关联程序，可以将实际获得的 Rh 与数据库中的结构信息进行比较，有助于结构的精细解析。FIDA技术单次运行只需要40 nL 蛋白质在 4 分钟内获得的完整蛋白质 QC 图，包括冷冻电镜样品QC的关键参数表征，例如多分散性指数（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（Rh）等指标，FIDA是一种非常有效的支持所有生物物理学和结构生物学的基本工具。图5. FIDA单次测试的得到8个蛋白表征数据冷冻电镜应用：FIDA：4分钟给您无稀释的冷冻电镜样品优化解决方案FIDA和本篇研究中应用的分子互作技术都是一种在溶液状态下通过荧光分子标记表征分子互作的技术。对于蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现蛋白与蛋白或蛋白与核酸互作的真实情况。FIDA 可以使用含盐和洗涤剂的缓冲液条件，具有不同环境中（类体内环境）进行测试的灵活性。这使得研究者能够分析不受缓冲液成分限制的核苷酸，以确保其数据的准确性和可靠性。FIDA 这种在溶液内检测分子互作技术，是理想的结合能力检测，因为它不依赖于潜在的阻碍性表面固定，不受结合域空间方向影响的表征。图6. FIDA实验原理示意图FIDA不仅可以表征互作亲和力，也同时无标记检测CRISPR核酸酶与gDNA相互作用的热力学、亲和力、和结合动力学，全面表征蛋白与核酸互作。FIDA不仅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合亲和力，还可在无标记下表征蛋白与核酸的热力学参数与结合动力学，甚至表征结合时蛋白构象变化与获得有关基因编辑过程的分子细节的定量表征。FIDA技术可以处理带负电荷分析物和带正电荷配体，使利用FIDA能够深入了解CRISPR- cas组分之间的结合相互作用，并以更高的准确性和效率表征和优化CRISPR系统。FIDA是一种序列无关的技术-不需要事先了解序列。FIDA的序列独立性质可对未知或未表征的基因组区域进行研究，同时简化工作流程。图7.(A) FIDA实验示意图。ReporterRNA用于识别RNP的大小和饱和点(上)，用其报告RNP结构作为竞争分析的起点(下) (B)正向结合(上)和反向滴定(下)期间获得的原始FIDA数据 本研究在分子层面直观的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。FIDA对于蛋白质复合体的多维表征和对蛋白与核酸互作亲和力与动力学的的检测，不依赖于分子量变化，样本用量少（仅需40nL），是一种在溶液状态下且不受缓冲液成分影响的多维表征技术。对于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现互作的真实情况。

当前，COVID-19 在世界范围内大流行，已造成超过两亿人次的感染和四百多万人次的累计死亡，基于 qRT-PCR(定量逆转录酶-聚合酶链反应)的检测是当前诊断 COVID-19 的金标准。尽管说这种方法具有很高的敏感性，但其操作仍然过于复杂，检测时间长达数小时，无法实现快速的即时检测。因此，开发比 qRT-PCR 更快速、更容易实施的诊断检测策略显得尤为重要。　　CRISPR/Cas 系统是用于基因编辑的分子生物学工具，有准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编辑技术。随后，多项 CRISPR-Cas9 基因编辑临床实验开启并获得突破性结果，并已成功应用于人类疾病的治疗。　　与 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特异靶向 RNA 序列，能够在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表现出不加区别的切割活性。这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个独特的优势，例如通过切割降解已标记的核酸来产生荧光信号，具有被应用于核酸检测的潜力。　　2021 年 8 月 5 日，加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna(2020 年的诺贝尔化学奖得主之一)、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科学家领导的研究团队在 Nature Chemical Biology 杂志上在线发表了题为 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。　　研究人员结合了两种不同的 CRISPR 酶，创造了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的方法，这种被称之为快速串联集成核酸酶检测(Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT)的无扩增技术，可以为许多传染病及当前流行的 COVID-19 提供快速且廉价的诊断策略。　　主要研究内容　　LbuCas13a 结合嗜热栖热菌 Csm6(TtCsm6)可用于快速 RNA 检测　　Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 内切酶，可被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子，基于其信号放大的内源性功能，有可能提高 RNA 检测的敏感性。　　通过筛选，研究人员发现寡核苷酸 A4-U6 可结合并刺激 TtCsm6 对报告蛋白的切割，并释放出荧光分子。此外，不同浓度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分钟内出现荧光增长，随后达到一个平台值，最终荧光水平与 Csm6 激活剂的数量成正比。　　在荧光已经趋于平稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反应中加入 A4-U6 激活剂可以迅速增加 TtCsm6 对靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响。这些数据表明 Csm6 的 A4P 配体会随着时间的推移而耗尽，从而使其 RNA 切割活性失活，而这种失活则限制了其产生荧光信号的数量。　　Csm6 激活剂的化学修饰　　为了解决 Csm6 激活剂失活的难题，他们想到了位点选择性化学修饰的方法，实验结果发现，这种策略不仅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同时还能保持 Csm6 的高水平激活状态，使其可以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。灵敏度比未修饰的 A4-U6 激活剂提高了 100 倍。　　RNA 检测的可编程性　　为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂能够用于提高 RNA 检测的灵敏度和检测速度，必须保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程特性。　　为此，他们将 TtCsm6 及其激活剂添加到一个 LbuCas13a 蛋白中，该蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列进行检测，发现其具有相似的灵敏度和动力学，这表明，这种「一步法」可以对不同的 crRNA 序列进行编程，因此可能适用于几乎任何 RNA 序列的检测。　　为了确定添加 TtCsm6 是否能加快检测时间，他们在反应 20 分钟后比较了这两种检测策略的结果，发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可完成对每微升 31 个拷贝的样品检测。　　综上这些结果表明，通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂，串联 CRISPR 核酸酶检测能够实现对传染性病原体 RNA 序列的无扩增检测，在加速检测病原体的同时兼具高灵敏度，他们称这种策略为快速串联集成核酸酶检测(Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT)。　　集合检测器实现 FIND-IT 即时检测病毒 RNA　　最后，为了证明将上述 FIND-IT 纳入即时测试流程的可行性，他们开发了一种便捷检测器，该检测器由一个带有反应室的微流控芯片、一个将反应维持在 37℃ 的加热模块和一个荧光成像系统组成。　　将含有靶标 RNA(SARS-CoV-2 RNA)或水(无靶标 RNA)的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反应室内，1 小时后发现，当 SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷贝时，反应信号呈非线性增加，1 h 内增加约 4.7 倍 而不含靶 RNA 的阴性对照则出现约 1.7 倍的变化。　　此外，与背景对照相比，每微升反应 400 拷贝的荧光量增加了 270%，而两个阴性对照的荧光量则同时增加了 3%。鉴于阳性和阴性样品之间荧光信号的巨大差异，这表明 LbuCas13a-TtCsm6 反应可在一个紧凑的检测器中实现，并可以用于即时诊断检测。　　结语　　综上所述，在这项研究中，该团队证明了 LbuCas13a 与 TtCsm6 联合可用于快速 RNA 检测，对其激活剂进行化学修饰后可使其敏感性提高约 100 倍。同时，将 TtCsm6 与含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效应体相结合，也可使提取的病毒 RNA 检测低至每微升 31 个拷贝，60 分钟检测准确率更是达到 100%。最后，他们还将这种分析策略应用于集成检测设备，保证了其便捷性。　　因此，这种「一键式」检测策略具有高灵敏性和快速的反应能力，未来可广泛应用于检测 SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或细胞 RNA 序列或环境样本中的植物、真菌或微生物 RNA。　　不过，使用 FIND-IT 实现完整的即时检测还需要进一步开发合适的样本收集和处理程序，以及强大的数据分析流程，将来仍需要进行更多人类样本的测试，以验证其在临床样本检测中的稳定性和准确性。　　本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「这种串联核酸酶方法——Cas13 联合 Csm6，在 37℃ 的单一温度下发生反应，并不需要其他诊断技术所需的高温加热，这为更快更简便的测试提供了可能，同时这些测试的灵敏度当前已经可以达到与其他检测技术相当的水平，并且可能在未来做到更加灵敏。」　　研究团队在接受采访时说到：「虽然我们确实是为了 COVID-19 而启动了这个项目，但我们认为这种特殊的技术不仅仅适用于此次疫情，因为 CRISPR 是可编程的，因此可以将针对流感病毒、HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，该系统均可用相同的方式工作。这一研究证明了这种生物化学方法是一种更简单的检测 RNA 的方法，并且快速敏感，这可能被应用于未来的即时诊断中。」

又到周五啦！四小名助如约而至，给大家带来色谱耗材相关的实用技术小贴士。内容涉及色谱柱及前处理产品选择、使用、维护保养等内容。实用干货，不容错过！FAST mRNA快速核酸药物表征核酸药物不但将药物治疗拓展到了蛋白质之前的基因层面，mRNA 疫苗体液免疫与T 细胞免疫的双重免疫机制，提高了免疫活性。同时放大制备更容易。这些优势使得核酸药物成为继小分子药物，蛋白药物，抗体药物后的新一代创新药物。2018 年后Patisiran 药物的递送技术解决了小核酸药物面临的给药效果差，脱靶造成副作用的难题，更是迎来了核酸药物研发的新高潮。新guan疫情中核酸疫苗的成功更是拓宽了核酸药物的应用潜力。新赛道上如何快速表征核酸药物，话不多说，直接上干货。选对耗材是关键核苷/寡核苷酸分析和制备色谱柱的选择（点击查看大图）核酸分析色谱柱的选择（点击查看大图）滑动查看更多寡核酸药物分析全助攻寡核苷酸药物中，根据作用机理可以分为反义核苷酸，小干扰RNA,微小RNA,小激活RNA,信使RNA,适配体等，这些药物由于容易被核酸酶降解，延长半衰期的考虑，会做一些修饰，如硫代PEG修饰等等。在固相合成过程中也会有些杂质需要监控，针对这些需求，相应的方法开发和方案展示如下：01DNAPac RP分析寡核苷酸药物关键杂质滑动查看更多（点击查看大图）02DNAPac PA系列阴离子交换柱分析寡核苷酸药物关键杂质滑动查看更多（点击查看大图）核酸药物分析全助攻核酸药物特别是mRNA在新guan疫情大流行期间，同样发挥了巨大的作用，在核酸成产过程中，质粒纯度测定， mRNA序列测定，mRNA帽子结构确定，mRNA的PolyA测定，mRNA的降解产物的研究等等这些需求，对于分析技术提出了更高要求，专用DNAPac系列反相色谱柱和离子交换色谱柱可以满足这些检测需求。01mRNA原液检测攻略滑动查看更多（点击查看大图）核酸药物载体的表征核酸药物的成功，离不开药物递送技术的突破，不同基质，不同官能团的色谱柱在纳米脂质体组成的测定，腺相关病毒组成以及聚乙酰亚胺残留的检测中各显神通，点击下面详图获得。01纳米脂质体的表征滑动查看更多（点击查看大图）02腺相关病毒载体的表征滑动查看更多（点击查看大图）工艺监控在寡核苷酸和核酸生产工艺中，会用到一些有机溶剂等其他原料，这些原料如何检测，点击下图查看：滑动查看更多（点击查看大图）一键获得★ 这么多应用是不是有些眼花缭乱了呢，贴心的核酸项目分析选择手卡，扫描以下二维码，即可一键获得如需合作转载本文，请文末留言。这样的应用图书馆不来了解一下？点击进入小程序完成注册即刻抽取盲盒好礼

近日，有消息传出，上海首个核酸产业园将于7月中旬在上海杭州湾经济技术开发区正式开工，产业园占地3平方公里，先期将打造720亩核酸产业首发地、先行区。核酸产业园是否指的是“新冠病毒检测”，是否与近期疫情有关？对于部分网友的疑惑，“上海奉贤”公众号7月11日发文称“这是生物医药产业一一‘生命信使产业' ，主要是基于RNA开发各种疫苗及药物，这是未来生物医药产业发展方向，跟疫情毫无关联。”“核酸药物创新技术的应用远不止于新冠病毒检测。”一位沪上医药行业人士对e公司记者表示，疫情以来，mRNA疫苗被大众广泛关注，这也激发了药企对核酸药物的研发热情，同时，核酸药物也逐渐成为生物医药投资的重点领域。核酸产业园7月中旬开工为延长“保质期”，获取“通行证”，如今，新冠病毒核酸检测是市民最熟悉的生活场景之一。“核酸”一词也从市民比较陌生的生物医药领域走进茶余饭后。事实上，核酸药物创新技术的应用远不止在新冠病毒检测。7月9日，据“上海奉贤”公众号文章，聚焦以核酸药物为代表的第三次生物医药产业革命，上海杭州湾经济技术开发区全力打造“东方美谷生命信使”核酸产业生态圈，全市首个核酸产业园将于本月中旬在开发区正式开工。据悉，核酸产业特色园区占地3平方公里，先期将打造720亩核酸产业首发地、先行区。这篇文章还提到，在布局核酸产业园之前，开发区早已在核酸领域下好了“先手棋”。2019年6月，兆维生物43亩寡核苷酸及修饰体、核酸酶研发生产基地在开发区开工建设，并于2021年6月投产，目前占全球核酸原料70%的市场份额，年产值15亿元。开发区大力支持兆维生物向下游产业链延伸发展，组建专班全力协调危险品配建库房设计审批等事项。今年7月，兆维生物投资25亿元的小核酸药物研发生产基地也将开工奠基。在核酸药物方面，除了兆维生物，开发区还集聚了国内核酸检测试剂“芯片”的主力供应商，也是国内核酸引物企业百力格生物。此外，上药集团将利用其在开发区的中西三维基地打造核酸药物技术平台 在蛋白药物领域，美资企业昂博生物的多肽产品、保护氨基酸产品销量全球前十；在CDMO领域，博腾制药在收购开发区凯惠药业后，将打造生物药化合物研发基地，并通过扩建二期，建设核酸蛋白药物生产基地。在核酸技术发展方面，开发区投资18亿元，在产业园的基础上，建设120亩核酸产业技术中心，建设11栋合计11万平米研发孵化楼宇，并提供5万平米地下空间，为核酸生物医药研发企业提供充裕的发展空间。系生物医药产业布局新动作消息发出后，“上海首个核酸产业园开工”的相关词条也登上热搜。7月11日，“上海奉贤”发布澄清说明，表示产业园的建设与疫情无关。“生物医药产业是上海战略性新兴产业的重要支柱，也是上海三大先导产业之一。”上海奉贤方面表示，核酸产业园的开工是生物医药产业一一‘生命信使产业' ，主要是基于RNA开发各种疫苗及药物，这是未来生物医药产业发展方向，跟疫情毫无关联。事实上，上海奉贤方面也早在文章中进行了一番科普：核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。新冠病毒核酸检测就是检测采样拭子中是否含有病毒的核酸，从而确定是否感染新冠病毒。在生物医药领域，信使RNA（mRNA）是一项颠覆性的药物创新技术，将突破肿瘤、传染病等治疗方案局限。另外，核酸类药物又称核苷酸类药物，主要在基因水平上发挥作用。一般认为，核酸药物包括Aptamer、抗基因(Antigene)、核酶(Ribozyme)、反义核酸(Antisencenucleic acid)、RNA干扰剂。由于其具有特异性针对致病基因，也就是说具有特定的靶点和作用机制，因此核酸药物具有广泛的应用前景。上海还有这些特色产业园除了核酸产业园还，上海今年还公布了一批特色产业园的建设情况。今年4月的上海全球投资促进大会上，发布了14个特色产业园区，对上海40个特色产业园区进行了整体推介。此次发布的第二批14个特色产业园区，总规划面积近50平方公里，规划产业用地超过30平方公里，近期可供产业用地超14平方公里，可供物业近1200万方。比如，先导产业中集成电路领域有2个园区，新型显示产业园聚焦以新型显示为主的新一代信息技术领域，围绕龙头企业集聚上游面板材料制造及设备制造企业、下游面板应用企业、产业研究院和产业基金，打造自主创新技术主导的新型显示协同产业链。浦江创芯之城着力建设集成电路研发与总部基地，依托头部企业集聚效应，打造集成电路设计、装备、封测等领域的头部企业集聚基地。生物医药领域2个和人工智能领域1个，分别是G60生物医药产业基地，青浦生命科学园，临港新片区信息飞鱼。重点领域补链强链的5个特色产业园区，包括电子化学品专区，张江机器人谷，临港松江科技城，长兴海洋装备产业园，临港新片区海洋创新园。

美国加州大学欧文分校（UCI）研究人员开发出一种DNA酶，可区分一个细胞内的两条RNA链，并切割与疾病相关的链，同时保持健康链的完整性。这项突破性的“基因沉默”技术可能会彻底改变用于治疗癌症、传染病和神经疾病的DNA酶的发展。相关研究论文刊登于最新一期《自然通讯》杂志。一个信使核糖核酸（mRNA）的发夹环，绿色为核碱基，蓝色为磷酸核糖骨架。（图片来源：物理学家组织网）DNA酶是切割其他分子的核酸酶。利用酶让“基因沉默”技术已经存在20多年，美国食品药品监督管理局批准了一些药物，但没有一种药物能够区分RNA链中的单点突变，而UCI团队研制出的Dz 46酶可识别和切割特定的基因突变。Dz 46酶外表看起来像希腊字母Ω，通过加速化学反应起到催化剂的作用，其左右两侧的“臂”与RNA的靶区结合，组成的环与镁结合，并在一个非常特定的位置折叠和切割RNA，但其发挥作用非常依赖镁。为此，研究团队使用化学方法重新设计了这种DNA酶，降低了其对镁的依赖性。得到的Dz 46酶专门靶向KRAS基因内的等位基因特异性RNA突变，KRAS基因是细胞生长和分裂的主要调节因子，出现于25%的人类癌症中。研究人员表示，他们的研究结果表明，化学进化可以为开发多种疾病的新疗法铺平道路。他们计划进一步调整Dz 46酶，然后开展临床前试验。

近日，上海交通大学王鹏飞教授和团队，设计一种无需预扩增的新型 DNAzyme 传感器，并将其并命名为 SPOT。图 | 王鹏飞（来源：王鹏飞）对于以 miRNA 和病毒 RNA 为代表的多种临床意义核酸标记物，本次传感器均具备检测能力，并能实现快速、便捷的临床分子诊断应用。通过针对血清 miRNA 进行敏感和特异的检测，进而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多种癌症的分子诊断。此外，SPOT 能从临床拭子中灵敏准确地检测 SARS-CoV-2 RNA。同时，SPOT 可以与侧流层析技术联合，实现对于核酸靶标的即时（POCT，point-of-care testing）检测。（来源：Angewandte Chemie International Edition）鉴于 SPOT 完全由合成 DNA 分子构建，避免了对于昂贵蛋白质酶的需求，具备较好的成本优势。实验显示，一次 SPOT 测定的材料成本，大约低至 0.02 美元，明显低于已有的检测体系。与现有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶标测定相比，这种灵敏且特异的分析性能、一步法的操作方案、低成本的优势、以及和 POCT 能力的结合，让 SPOT 能够成为一种更好的测定方法。未来在检验医学领域，该团队希望利用 SPOT 体系针对循环体内核酸进行检测，实现多类型疾病的灵敏特异分子诊断，从而为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的可能。进一步地，他们也希望基于核酸适体的结合，能够进行小分子与蛋白的检测，扩展 SPOT 系统在多方面的临床诊断应用。此前，在体内递送治疗方面，传统的 DNAzyme 不具备可编程的靶向性。而该团队设计的新型 DNAzyme 体系可以快速设计和实现可编程的靶向目标链，并通过切割来达到治疗目标。总的来说，这一创新有望为疾病治疗提供更精准、更有效的手段，为基因治疗和精准医学的发展带来重要推动。（来源：Angewandte Chemie International Edition）那么，本次成果的研发必要性是什么？它弥补了已有测量工具的哪些不足？据介绍，生物体液（血液、尿液、汗液等）中存在的核酸分子，是对包括癌症和病毒感染等重大疾病进行分子诊断的一类关键生物标志物。然而，核酸标志物存在低丰度、高度动态、高异质性、背景干扰大等特点，其临床检测面临着测不出、测不准、测不全、测不了、测不起等挑战。因此，迫切需要开发超灵敏、高特异、通量高、便捷经济的核酸生物标志物检测分析方法。DNAzymes 是一类体外筛选的合成 DNA 分子，具有类似酶的催化活性，例如裂解核酸磷酸二酯键。典型的裂解核酸 DNAzyme，由具有催化能力的催化核心、以及用于通过序列互补性识别底物的两条臂组成。因此，当前许多 DNAzyme 已经广泛用于体外和体内的金属离子检测，因为它们的催化活性高度依赖于金属离子。然而，具有小分子、蛋白质或核酸检测能力的 DNAzyme 鲜有报道，导致这些目标很难被检测到。受自然酶和核酸酶的启发，通过实施异构模块（如 aptamer、toehold）来设计异构的 DNAzyme 生物传感器，可以通过小分子、蛋白质、核酸或细菌等，调节因子介导其催化活性。传统的异构 DNAzyme 生物传感器通常被设计成多组分分子复合体，通过具有 toehold 的抑制链，来抑制并释放 DNAzyme。以及通过在靶结合后分裂并恢复催化核心，或通过靶诱导的 DNAzyme-底物-靶标复合物的稳定，来实现对于核酸靶的直接检测。然而，这些生物传感系统对于定向核酸的直接检测，通常表现出皮摩尔至纳摩尔的敏感性，因此无法探测临床样本中的 miRNA 或病毒 RNA 标志物。而许多 miRNA 被视为是多种癌症的潜在生物标志物，然而由于缺乏癌症诊断的敏感性和特异性，很少有 miRNA 被证明在临床上有用。王鹏飞认为，这种多组分设计可能会对其检测能力产生负面影响。由于一些原因比如化学计量的不完善、动力学分子陷阱、催化活性受损、以及信号泄漏的风险增加，会导致低丰度目标更加难以被测量。而该课题组的主要研究兴趣是：开发简单、快捷、灵敏的新型疾病分子诊断方法。通过调研，该团队发现体液中的循环核酸已经成为多种疾病的重要液体活检生物标志物。由于这些核酸生物标志物在生物标本中的高度动态、异质性和低丰度，导致其临床检测面临着巨大挑战。传统的聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）技术需要严格的样品处理、昂贵仪器和专业操作。而新型等温扩增方法，比如重组酶聚合酶扩增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）、环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated isothermal amplification）等则能简化操作过程。而尽管 CRISPR 结合等温扩增技术，能够显示出较高的灵敏度和便捷性，但是存在非特异性扩增、连续操作步骤和对昂贵易损酶的需求等缺陷，限制了临床上的应用。通过对以上这些因素的思考、并结合课题组自身优势，他们定下了本次课题。（来源：Angewandte Chemie International Edition）通过理论模拟与设计，他们设计出了这种新型 DNAzyme 传感器 SPOT。为了明确 SPOT 的机制并优化实验参数，课题组研究了具体的激活方式、以及可应用的核酸靶标长度。由于 DNAzyme 传感器的自身特性，最初他们设计的 DNAzyme 传感器信号泄漏非常严重，无论如何优化实验条件，都无法达到稳定、高灵敏的检测目的。通过大量的文献调研，以及学习和理解此前 DNAzyme 传感器的设计原理，再结合组内讨论他们认为：自封锁核酸链的设计，或许可以解决信号泄漏的问题。后来，通过一系列的实验，信号泄漏问题已经被解决。但是，DNA 酶传感器却无法被激活。于是，他们进一步优化参数，通过缩短结合臂的长度，最后成功构建了 DNAzyme 传感器。通过此，他们构造了一个单链、自锁定的单分子系统，并将这种传感系统命名为 SPOT（用于核酸检测的灵敏的环启动 DNAzyme 生物传感器）。同时，他们进一步将 SPOT 与试纸条结合，为 SPOT 实现 POCT 检测奠定了基础。经过全面优化和 SPOT 检测，在单管、一步、无预扩增和等温检测的前提下，实现了对 miR-21 的 15fM、对病毒 RNA 的 1.9aM 的强大检测灵敏度，以及对于核酸靶标的检测特异性（区分变异体）。最终，相关论文以《一种用于核酸敏感检测的可编程 DNAzyme》（A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids）为题发在 Angewandte Chemie International Edition[1]。史辰致是第一作者，王鹏飞担任通讯作者。图 | 相关论文（来源：Angewandte Chemie International Edition）不过，目前只有少量临床样本在 SPOT 上进行测试。未来，课题组将对更多患者进行临床研究，以便全面评估 SPOT 测定的可靠性。同时，由于本次研究采用了无前置放大器的方案，因此 SPOT 还不够灵敏，无法在肉眼可见的测试条上，产生明显可区分的读数。因此，该团队打算进一步提高 SPOT 的灵敏度，或与基于等离子体/荧光的便携式可视化设备结合，以便让 SPOT 的 POCT 能力能被用于实际应用。未来，在临床应用层面，他们希望能够建立多中心、大规模临床队列，对 SPOT 体系的疾病诊断效能进行更大范围的论证。在技术改进层面，该团队计划拓展 SPOT 的应用范围。除了核酸检测外，他们也希望通过引入核酸适体，来实现对于小分子和蛋白标志物的检测。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。整个PCR反应过程中有几种不可或缺的物质，酶就是其中一种。不同的酶有不同的试验特性，根据其特性又可以应用在不同的场景中。如何选择试验中最适合的酶是我们在试验之初值得思考的问题，下面小编就带大家一起了解一下PCR实验中几种常见的酶。Taq DNA聚合酶PCR试验之初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，但由于每一个循环都需要补充新的酶，其操作步骤稍显复杂。1988年科学家们从水生栖热菌中分离得到了Taq DNA聚合酶，从此DNA的自动扩增变成现实。也是由于这个酶的发现使PCR成为了一项便利、实用、普遍的技术。Taq DNA聚合酶也成为了DNA试剂盒中最为常见的一种聚合酶。野生的Taq DNA聚合酶虽然已经具备良好的功能性以及广泛的应用范围，但由于分子诊断技术要求的精确性及各项要求越来越高，因此对其扩增能力、保真性、耐热性等方面进行优化。从而提高Taq DNA酶在分子诊断中的稳定性、灵敏度以及特异性。改造后的Taq DNA酶具有以下优势：1 良好的耐热性，最适催化浓度为75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。2 有5’-3’聚合活性，这一特性使Taq DNA酶对温度有较高的敏感性。3 有5’-3’外切酶活性，Taq DNA酶也是少数具有这一特性的DNA聚合酶之一。4 可以在PCR产物3’末端添加无模板核苷酸，这一特性可以使Taq DNA酶的PCR产物直接用于TA克隆。但它没有3’-5’的校正活性，可能在PCR反应中引起错配，这一缺点使其在PCR扩增中的忠实性大幅度降低。PfuDNA聚合酶为了避免因错配而出现的非特异性扩增，造成试验结果不准确，科学家们对Taq DNA聚合酶进行了修饰。而PfuDNA聚合酶正是利用了酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。它可以很好地弥补Taq DNA聚合酶的劣势，有效提高目标基因的扩增成功率，因此应用范围较广。目前市面上常用的PfuDNA聚合酶修饰方法主要有化学修饰法、配体修饰法和抗原抗体结合法，修饰原理不同其优劣势各有不同。1 化学修饰法利用化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活，当温度为95℃的时候酶活性释放。优点：酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比高。缺点：酶激活的时间较长，可能会影响酶的活性，导致PCR产物的产量降低。2 配体修饰法核酸适配体（一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，DNA或者RNA）通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活。当温度高于60℃酶活性释放。优点：不需要激活步骤，稳定性高，减少了样本降解的可能性。缺点：由于核酸适配体是一种可逆抑制剂，较化学修饰法来说稳定性较低，特异性不够强。3 抗原抗体结合法是当前最常用的一种方法，利用DNA聚合酶抗体与聚合酶进行结合封闭酶活性，当温度到达变性温度时（95℃）开始释放酶活性，可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，从而保证低丰度基因的有效检出，大大提升反应灵敏度和扩增效率。优点：酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。缺点：抗体生产成本高，试剂配比优化时间长。逆转录酶1970 年Temin发现了逆转录酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链。逆转录酶具有依赖于DNA或RNA模板的DNA聚合酶活性，因此没有3’-5’外切酶活性。但其具有RNase H活性，在一定程度上限制了逆转录酶的合成长度。由于野生逆转录酶的保真性和热稳定性较低，因此科学家们对其进行了改造。常见的逆转录酶主要有HINV1 RT、AMV RT、M-MLV RT，但由于前两种酶的应用范围较窄，因此研究者们主要针对最后一种逆转录酶不断进行升级改造。升级后的第三代逆转录酶整体性能有了明显的提升，表现在有更高的cDNA产量、更广的温度范围以及可以适用于复杂结构RNA模板，提升了cDNA的合成长度。虽然第四代的性能更好，但由于其价格过高，实际应用并不广泛。第三代逆转酶主要有以下优势：1 卓越的延伸能力2 灵敏的检测范围3 优良的耐热特性4 高效的扩增性能5 超高的合成速度Bst链置换DNA聚合酶1972年Stenesh和Roe首次从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离了Bst链置换DNA聚合酶，与Taq DNA聚合酶有相似的结构域。经基因工程改造去除了DNA聚合酶Ⅰ的 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。Bst链置换DNA聚合酶作为等温扩增的核心酶，其优势十分明显：1 微量、高产扩增2 高灵敏度、特异性RT-LAMP扩增3 快速反应，可以在一个小时的时间内完成整个试验其缺点为不具有5′→3′外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。不同的酶由于优劣势各有不同因此其常见的应用场景也各有侧重。Taq DNA聚合酶的应用范围十分的广泛，可应用于常规PCR扩增、易错PCR扩增、位点特异性PCR、RT-PCR、qRT-PCR，同时也是探针法qPCR技术的指定聚合酶；使用热启动Taq酶是提升PCR特异性的常用方法，因此热启动Taq酶常用于qPCR反应中，除此之外，由于其较高的特异性和高灵敏度，也经常被用于构建DNA文库、DNA测序、突变体的分析构建、基因分离、遗传病诊断、法医鉴定等；逆转录酶可以为qPCR合成第一链cDNA，有构建cDNA文库、DNA测序、末端标记DNA等作用；Bst链置换DNA聚合酶适用于较低温度下（68℃）的DNA测序、防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

上海科技大学季泉江教授团队在Cell Reports发表了题为 “Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease”的研究论文。该论文报道了Syntrophomonas palmitatica Cas12f1（SpaCas12f1）的生化特征及DNA切割机制，证明CRISPR-SpaCas12f1系统能在细菌中实现多种编辑目的，且通过工程化向导RNA使该系统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。CRISPR-Cas系统是目前常用的基因编辑工具，但是由于传统的Cas核酸酶分子量普遍太大，使其在在体基因治疗的应用中受限。近年来，为了解决这一难题，小的Cas核酸酶逐渐被发现和探究。其中，Cas12f 核酸酶是目前紧凑的 CRISPR 效应核酸酶，比传统Cas9和Cas12a核酸酶小一半以上，在临床治疗应用中具有巨大潜力，然而高效的Cas12f基因编辑系统仍旧较少。图1.CRISPR-SpaCas12f1的表征与改造来自Syntrophomonas palmitatica的紧凑型SpaCas12f1只有497个氨基酸，该研究首先系统地表征了SpaCas12f1的生化特性及对DNA识别与切割的模式，证明了SpaCas12f1是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，可在tracrRNA和crRNA的帮助下有效切割含有5' -NTTY (Y代表C或T)PAM的双链DNA。此外，SpaCas12f1拥有与AsCas12f1相似的切割模式，即在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口（图1）。由于SpaCas12f1在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性，为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具，研究人员通过引入SpaCas12f1和Lambda Red重组酶系统及单链修复模板，实现了CRISPR-SpaCas12f1在大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多种精准的基因组编辑。同时，研究人员发现SpaCas12f1的tracrRNA具有独特的head-to-toe的发夹结构，这是限制SpaCas12f1在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对RNA二级结构预测及小RNA测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导RNA，成功地获得了高效的引导RNA，gRNA_MS13，从而实现CRISPR-SpaCas12f1高效哺乳动物细胞编辑。这项研究扩展了微型CRISPR核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型CRISPR系统提供了新的思路。

在国家自然科学基金项目（批准号：22277078、22077083、22207074）资助下，上海科技大学季泉江教授与西湖大学申怀宗教授团队合作在微型基因编辑器的开发与机制研究方面取得新进展，相关成果以“氧化硫酸杆菌微型Cas12f1核酸酶的分子结构与工程进化（Structure and engineering of miniature Acidibacillussulfuroxidans Cas12f1）”为题，于2023年7月31日在《自然催化》（Nature Catalysis）杂志上发表。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41929-023-00995-4。 该研究通过冷冻电镜技术解析了微型基因编辑系统CRISPR-AsCas12f1的三元复合体的结构，揭示了其精细结构特征与工作机制，并基于结构引导的蛋白质理性设计，系统性提升了它在哺乳动物细胞中的基因编辑活性。CRISPR-Cas基因编辑技术因其简便性和高效性，被广泛应用于生物医药、农业育种、合成生物学等领域。然而，常用的Cas9与Cas12a核酸酶具有较大的分子尺寸（1,000个氨基酸），限制了其在基因治疗等方面的应用。2021年，季泉江团队证明了微型基因编辑器-AsCas12f1（含422个氨基酸，分子尺寸为Cas9的1/3）的编辑活性。本研究中，季泉江与申怀宗团队利用冷冻电镜技术解析了AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体的精细分子结构，阐明了AsCas12f1可以形成不对称同源二聚体结构，进一步结合一分子sgRNA（小向导RNA），从而靶向结合于靶DNA序列上。AsCas12f1独特的分子结构决定了它能够以更小的分子尺寸，发挥与大型核酸酶相似的基因编辑功能，其sgRNA中存在的多茎环同轴RNA螺旋结构，为理解Cas核酸酶演化进程中的“蛋白替代RNA”假说提供了新证据。此外，团队还揭示了AsCas12f1自发形成同源二聚体的分子机制、识别原间隔序列临近基序的关键氨基酸残基位点、以及同源二聚体中各个单体核酸酶分子对sgRNA结合、底物识别与切割的具体功能。基于上述结构生物学信息，团队通过sgRNA截短与核酸酶氨基酸残基替换，得到工程改造后的AsCas12f1-v5.1，其在哺乳动物细胞中的基因编辑活性提升了1.5~13.5倍，同时基因脱靶编辑效率显著低于Cas9和Cas12a。该研究开发的小尺寸基因编辑器AsCas12f1-v5.1可满足病毒递送系统对分子尺寸的严苛要求。上海科技大学季泉江课题组助理研究员吴兆韡博士、博士研究生潘登和西湖大学生命学院刘栋梁博士为共同第一作者。上海科技大学季泉江教授和西湖大学申怀宗教授为共同通讯作者。上海科技大学为第一完成单位。

全球新冠疫情肆虐之际，也让很多人了解到了核酸检测，目前它已经成为新型冠状病毒检测的“金指标”，早在5月11日，武汉市提出对全市1000万左右的市民进行全面检测，其具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。也在这场疫情战中起到了关键性的作用。Avantor作为全球高质量的实验室产品供应商，为科学事业提供优质的实验产品和解决方案，助力病毒检测 ，与世界科学实验者一起抗击病毒。那么病毒检测包括核酸检测的过程是什么样的呢？本期小编将带大家了解检测的过程。病毒采样：提取病人唾液鼻咽拭子，并保存于病毒采样管核酸提取：裂解细胞，提取样本中的遗传物质，并且防止遗传物质降解通常核酸裂解液的主要成分是异硫氰酸胍，能迅速破碎病毒使核蛋白与核酸迅速分离，同时抑制释放出的核酸酶活性，保证核酸一级结构的完整性，提高核酸提取效率。EDTA作为螯合剂，能防止Mg，Ca等金属离子激活核酸酶，同时，盐酸胍能抑制核酸酶，DTT能防止延缓酶的失活。扩增：由于原始样本中的核酸含量非常低，所以需要通过扩增将核酸浓度扩大，使其能够被后续检测方法检测到。检测：根据检测结果判断样本是否含有病毒。了解VWR Life Science（原Amresco）在病毒检测过程中的相关产品。点击产品名称，查看更多信息。产品列表品名货号异硫氰酸胍0380EDTA0322EDTA二钠盐 0105Tris0497Tris盐酸盐0234盐酸胍E424

12月份出版的《自然—方法学》刊登了一篇文章，描述了一种高通量RNA结构测定方法——“片段化测序”法(Fragmentation sequencing ，FragSeq)。相关研究由美国加州大学圣克鲁兹分校霍华德休斯医学研究院教授索菲萨拉马(Sofie Salama)所领导的课题组完成。　　RNA对基因表达和基因组稳定性的调控作用成为近来研究的热点，而弄清RNA二级结构是理解RNA功能的第一个必要步骤。测定非编码RNA结构的经典方法是化学法和酶法，但是它们一次只能测定一个RNA分子，这种方法不仅费力而且对技术要求高。FragSeq法却可以在整个转录组水平同时对大量RNA进行结构测定。　　该研究利用核酸酶P1将小鼠RNA进行片段化，得到20–100-nt 大小片段 之后在片段的5"-PO4和3"-OH端分别加上接头，通过逆转录和PCR扩增之后，构建FragSeq文库并对其进行深测序。为了保证文库片段均是由核酸酶P1剪切产生，萨拉马等设置了两个对照组：一组RNA不使用核酸酶P1处理来估算由内源降解产生5"-PO4基团的片段数，另一组则多加了T4连接酶处理RNA，以此来计算不产生5"-PO4基团的片段数。通过凝胶电泳分离出目标片段。最后萨拉马等利用一种软件，可以将大量测序结果格式化，使其能够被一种RNA预测软件读取，进而预测出RNA二级结构。

前言人类基因组中仅有1%是负责蛋白质编码的基因，其中疾病相关的蛋白大约有 3000个，只有不到700种被目前获批的药物作为靶点，绝大多数疾病相关的蛋白被认为是不可靶向的。针对疾病相关的非编码RNA以及不可成药的蛋白靶点，使用小分子靶向RNA的结构是治疗相关疾病的一种策略。但是小分子的结合并不一定能产生生物活性，有些小分子可能结合在RNA的非功能位点，或者小分子的结合强度不足以影响RNA的生物功能。高分文献解读2023年5月24日，Scripps研究所的Matthew D. Disney教授及其合作者在Nature杂志发表了题为“Programming inactive RNA-binding small molecules into bioactive degraders”的研究论文，利用核糖核酸酶靶向嵌合体技术将非活性小分子重编程为靶向RNA降解剂，成功降解miR-155和癌症靶标MYC、JUN的RNA。https://doi.org/10.1038/s41586-023-06091-8IF: 69.504 Q1研究人员基于二维组合筛选进行RNA和小分子高通量分子间相互作用检测，发现了一些可以与pre-miRNA-155结合的小分子。接下来使用Monolith分子互作仪完成了大量RNA小分子结合表征。研究人员验证了C1仅结合于5′GAU/3′C_A motif，其他RNA凸起或者点突变RNA在相同检测浓度范围内看不到明显的结合信号。在使用Monolith检测时无需固定RNA，仅需带有CY5标记即可直接在溶液中精确表征Kd，检测一对样品仅需10min。图1：pre-miR-155-binder C1结合曲线构建靶向嵌合体小分子结合于pre-miRNA-155的非活性位点，并不会对细胞内的miRNA-155表达水平产生影响。接下来研究人员构建了双功能小分子核糖核酸酶靶向嵌合体，一端与目标RNA结合，另一端招募并激活RNA酶，从而靶向降解目标RNA。改造后的嵌合体成功在细胞内降低miRNA-155的表达水平，并且在细胞和小鼠模型中抑制了三阴乳腺癌。图2：将结合pre-miR-155的惰性结合物转化为活性RIBOTAC降解剂为了测试该方法的适用性，研究人员又构建了靶向MYC和JUN的核糖核酸酶靶向嵌合体。这两种蛋白都是重要的癌症靶点，但都是无序蛋白，被认为是不可成药的。改造后的核糖核酸酶靶向嵌合体获得了生物活性并在细胞内精准地靶向降解各自的靶向RNA，使这些癌蛋白驱动的转录和蛋白组学进程失效。这项研究表明对于由这些常见但具有挑战性的致癌基因驱动的癌症，重编程非活性小分子为靶向RNA降解剂可能会带来新的变革。图3. JUN-RIBOTAC选择性降解JUN mRNA抑制胰腺肿瘤细胞的增殖和迁移Monolith系列分子互作检测仪在此项研究中，NanoTemper的Monolith分子互作检测仪在RNA小分子结合表征的检测中提供了可靠的实验数据。RNA分子量小，体外容易降解，而Monolith系列分子互作仪对分子量无限制，同时10分钟的快速检测可以最大程度避免RNA的降解。Monolith系列分子互作仪覆盖几乎任何分子类型、缓冲液成分或亲和力强弱的检测项目，并且检测不依赖于分子量，能够轻松应对不同类型的分子间相互作用检测难题，助力靶向RNA降解剂研究。NanoTemper微量热泳动分子互作检测仪Monolith-实用应用手册_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)

细胞体外培养用水中水的质量要求提起细胞体外培养实验，每个经历过的实验者都会有这样的领悟吧，细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。明明小心翼翼的操作，细胞总会莫名其妙的被污染了！莫名其妙的挂掉啦！到底怎么回事呢？其实造成细胞污染的因素不单单是微生物，培养环境中所掺杂的物质也可能会影响细胞的生长。水是细胞赖以生存的主要环境，营养物质和代谢产物都必须溶解在水中，才能为细胞吸收和排泄。对于体外培养的细胞来说，水是细胞培养液和试剂中简单而重要的组分。所以，细胞培养对水的质量要求较高，培养用水中如果含有一些杂质，即使含量极微，有时也会影响细胞的存活和生长，甚至导致细胞死亡。水中的杂质对水质有不同影响：1.离子——平衡渗透压；一些重金属 (Cadmium)对细胞毒害大，即便剂量很低 ( 0.1 ppb)； 2.微生物——污染，改变微环境如pH，影响增殖，死后释放内毒素等；3.内毒素——改变细胞外形、活化细胞、促进或抑制细胞分裂、影响细胞附着等；4.有机物——影响细胞的生长状态。水质评价常用的指标：1. 电阻率（electrical resistivity）衡量实验室用水导电性能的指标，单位为MΩ• cm，随着水内无机离子的减少电阻数值逐渐变大。2. 异体菌落数（Heterotrophic bacteria count，HBC）衡量实验室用水微生物的指标，单位为cfu/mL。3. 有机物（Total Organic Carbon ，TOC）水中碳的浓度，反映水中可氧化的有机化合物的含量，可间接反映出水中细菌和内毒素含量的高低。单位为ug/L或ppb。4. 内毒素（Endotoxin）革兰氏阴性细菌的脂多糖细胞壁碎片，又称之为“热原”，单位EU/mL。参考国际标准化组织的实验室纯水规范ISO3696，美国CLSI和ASTM D1193的试剂纯水规范，我国GBT6682和GBT 30301的试验用水指导，《实验细胞资源的描述标准与管理规范》用水指导，结合多年的实验操作经验，总结出细胞培养用水对水质的要求。细胞培养对水质的要求：1.一定要无菌：HBC 0.01 cfu/mL2.无蛋白及核酸酶和内毒素：无内毒素或无热源0.03EU/mL3.阻碍细胞生长的有机物含量要低：TOC5 ppb4.去除离子含量：电阻率≥18 MΩ• cm(@25℃)细胞体外培养用水中纯水机的配置要求细胞培养过程中，各种培养液和试剂的配制用水均需要经过严格的纯化处理，不含离子和其他的杂质，即使是储存试剂的玻璃器皿，在自来水冲洗过后也应用超纯水漂洗三次以上。目前，市场上供应的纯水装置种类较多，比如自来水进水同时制备二级纯水和超纯水的上海乐枫Genie一体化纯水装置，可以由自来水进水通过预处理柱P Pack、反渗透柱RO Pack及EDI（连续电流电去离子）模块等纯化后达到二级纯水，储存于水箱中以满足日常的清洗应用；水箱中的水再经过U Pack超纯化柱去离子，紫外灯照射杀菌并降低有机物含量，最后经终端滤器RephiBio过滤，以获得无菌、无热源、无核酸酶的超纯水。Genie G 水路图要想达到细胞培养用水的水质要求，纯水机的配置非常关键，带有消毒模块的纯水水箱、终端过滤器、取水水质的实时监测等配置都关系着产水水质是否达标。纯水的储存对保持纯水的质量是至关重要的，由于周围环境和空气中的二氧化碳更容易使水污染改变其pH，所以储存水的容器要尽量密封，避免和外界过多接触，抑制微生物生长。如Genie纯水设备可以提供的纯水水箱带有紫外消毒模块和去除二氧化碳的过滤器，能够尽量的保证水箱内的纯水水质。水箱空气过滤器（含CO2吸附剂）200/350L 水箱空气过滤器主控屏显示水箱水循环状态终端滤器可用于去除纯水中特定类型的污染物，满足不同实验的应用需求。对于细胞体外培养可以选用RephiBio Filter 纯水终端过滤器，安装在乐枫超纯水系统的出水口，可有效去除水中的热原（内毒素）、核酸酶、细菌等杂质，制备符合细胞培养用水要求的超纯水（无热原、无DNase、无RNase、无菌）。对于超纯水而言需要格外注意终端水质的TOC、电阻率、细菌和内毒素的含量，必须做到即取即用，因此取水的远程监控和水质实时监测就显得尤为重要。目前已有厂家可以提供与手柄通过无线连接的实验室纯水机（如上面提到的Genie），将水机和取水手柄分别放在洁净间的内外，通过无线控制取水手柄达到超纯水的取用和实时检测水的电阻率和TOC数值，非常适合无菌环境下的操作，尽量减少污染。无线 自由局域网无线通信技术 各单元摆脱信号线羁绊主机，主控屏，手柄摆放可自由组合 手柄触屏信息? 系统运行状态：待机，泄压，循环，产水? 水箱液位：0%或者L? 纯水（超纯水）水质参数：电阻率、TOC、温度 终 端 水 质 实 时 监 测结合上述用水要求，为大家推荐两款制备超纯水的水机，Genie G一体化纯水仪和Genie PURIST 超纯水仪。 Genie G一体化纯水仪以自来水为进水制备超纯水和 EDI 二级纯水性能指标Genie PURIST 超纯水仪以纯水（EDI 纯水，RO 水或蒸馏水等）为进水，制备实验室超纯水。性能指标【注意事项】1.超纯水应当注意使用时间，应该“即取即用”。防止超纯水吸收外界的杂质导致水质下降。2.在合适的环境使用超纯水。环境中的VOC（挥发性有机物），细菌等都会影响细胞培养。3.培养细胞的容器应当洁净无污染。 4.配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用钙、镁离子含量低的缓冲液，缓冲液用水可以选用装配乐枫低镁型纯化柱的纯水机，避免钙、镁离子促使细胞凝聚作用的产生。不同细胞体外培养用水选择指南细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养的整个流程中实验用水贯穿每一个环节：1.取材：组织的清洗和灌注试剂用水，如PBS缓冲液、Hanks液的配制；2.原代培养：1640、DMEM等培养基用水，明胶等支持物的配制，添加药物、检测试剂的配制；3.传代培养：胰酶等消化液的配制；4.冻存：细胞冻存液DMSO的配制。细胞体外培养的细胞类型一般分为动物细胞培养、植物细胞培养和微生物培养，其中极难的是动物细胞的培养。动物细胞的培养除了需要无菌、温度、气体、渗透压、pH等基本条件，它还需要血清、支持物等特殊物质，其中原代细胞的培养是很难的。植物细胞的培养需要光照和激素，而且培养条件和培养技术比较成熟。微生物培养多为单细胞生物，微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多，蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等培养基即可满足微生物的营养要求，其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，需要维持CO2等非氧惰性气体的浓度。由于细胞的种类和培养条件不同，对培养环境中杂质的含量要求也不同，那么配制培养基或试剂用水的选择大有讲究，不同细胞体外培养用水的指标如下：细胞体外培养用水选择细胞类型纯水等级电阻率(MΩcm)TOC(ppb)微生物(cfu/mL)内毒素(Eu/mL）核酸酶(pg/mL)动物细胞超纯水181010.002?ND植物细胞超纯水181010.002?ND微生物实验室Ⅱ级纯水10501NANA从上表可以看出，动物细胞和植物细胞的培养对去除内毒素和核酸酶的要求很高，用于这两类细胞培养可以选择商品化的细胞培养用水，另外去除纯水中的内毒素和核酸酶可以通过在纯水机的取水口安装终端滤器达到。各种细胞培养用水的比较细胞培养用水制备方法优点缺点商品化细胞培养用水纯水或超纯水进行多效蒸馏制成，严格控制热源、无菌、内毒素、pH、渗透压等指标水质标准程度化高，可保证实验结果的重复性价格昂贵DEPC水DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无RNase、DNAase和proteinase。完全去除核酸酶价格昂贵，未去除内毒素终端滤器过滤超纯水采用0.22μm的过滤膜，可有效去除水中的热原（内毒素）、核酸酶、细菌等杂质。性价比高，供水量大对取水环境要求高乐枫 RephiBio 终端过滤器采用0.22μm带正电荷的双层尼龙66过滤膜，可制备符合生物领域应用要求的超纯水（无热原、无DNase、无RNase、无菌），纯水中内毒素含量低于0.001 Eu/mL，核酸酶的含量低于可检测范围，微生物的含量低于0.1 cfu/mL，可以满足动物细胞和植物细胞的需求。Tips: 通常情况下乐枫RephiBio 终端过滤器的更换周期为3 个月，以达到好的使用效果。

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新冠病毒肺炎疫情至今已造成全球1.4亿人感染和300余万人死亡。随着疫情进展，突变病毒株不断出现，对中和抗体和疫苗的防护效果提出了严重挑战，迫切需要针对各型突变株中高度保守的转录复制过程开展深入研究，阐明关键药物靶点的工作机制，发现能够有效应对各种突变株的抗病毒药物。 新冠病毒是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种病毒（约30 kb），其基因组编码了一系列非结构蛋白，并按照一定的空间和时间顺序，形成复杂的超分子蛋白质机器“转录复制复合体”（RTC），负责病毒转录复制的核心过程，包含了众多保守的抗病毒药物设计的关键靶点。由于基因组极大，同时聚合酶复制保守性较差，新冠病毒进化出一种独特的“复制矫正”（proofreading）机制，利用转录复制复合体中关键的nsp14蛋白对复制过程进行矫正，一旦发现聚合酶合成了错误配对的碱基，立刻通过nsp14具有的外切核酸酶（ExoN）将错误碱基处理掉，保证复制的准确进行，这也是病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键途径。同时，nsp14是一个独特的双功能蛋白，除负责复制矫正的外切核酸酶外，还拥有一个N7甲基化酶（N7-MTase），负责mRNA加帽过程关键的第三步催化反应。复制矫正和加帽过程如何进行，特别是两个截然不同的生化过程如何在一个nsp14蛋白中协同作用，是20多年来冠状病毒研究领域中最关键的几个“未解之谜”之一。 2021年5月24日，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队与上科大高岩博士合作在Cell发表研究论文Cryo-EM Structure of an Extended SARS-CoV-2 Replication and Transcription Complex Reveals an Intermediate State in Cap Synthesis，解析了新冠病毒超分子蛋白质机器“转录复制复合体”关键状态的三维结构，揭示了病毒mRNA加帽、基因组复制矫正、逃逸核苷类抗病毒药物的分子机制。这是该团队在新冠病毒转录复制复合体研究中，继在Science、Cell等期刊上连续发表4项成果后的又一重要工作。 新冠疫情爆发后，清华大学饶子和院士、娄智勇教授团队针对新冠病毒转录复制机制开展的深入研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作机制。在此基础上，研究团队成功解析了Cap(-1)’-RTC与nsp10/nsp14形成的超级复合体Cap(0)-RTC的三维结构（图1）。 图1 新冠病毒Cap(0)-RTC的工作机制 在该复合体中，nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，通过与nsp14蛋白相互作用，将nsp10/nsp14复合体招募到Cap(-1)’-RTC中，从而利用nsp14的N7甲基化酶结构域完成mRNA加帽过程的第三步关键反应。尤为重要的是，研究团队发现Cap(0)-RTC在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体。在二聚体中，解旋酶nsp13通过其1B结构域的重大构象变化，引导模板核酸链反向移动，引发产物链backtracking机制，从而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心，完成错配碱基的矫正过程（图2）。 图2新冠病毒复制矫正的in trans backtracking机制 这一发现所提出的in trans backtracking的复制矫正机制，与真核/原核细胞RNA聚合酶Pol II的复制矫正机制具有一定的类似性，表明作为基因组最复杂的RNA病毒，新冠病毒的转录复制过程已与高等生物具有一定的类似性，阐明了冠状病毒研究领域20多年来悬而未决的关键科学问题。同时，复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物（如瑞德西韦）的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，即会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性，目前仅有NHC及其衍生物可以逃逸该过程。该成果也将对未来进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供关键的结构基础。 该成果的获得得益于研究团队在冠状病毒转录复制领域中17年多的长期积累。自新冠疫情发生后，研究团队系统研究了新冠病毒转录复制过程，阐明了关键药物靶点蛋白主蛋白酶Mpro和转录复制复合体多个状态三维结构，为认识病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature[4]、Science[1]、Cell上[3,5]和Nature Communications[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 清华大学饶子和院士、娄智勇教授/ChangJiang学者特聘教授和上海科技大学的高岩博士为共同通讯作者，清华大学医学院和生命学院的闫利明博士、杨云翔博士，以及博士生李明宇、张盈、郑礼涛、葛基、黄雨岑、刘震宇为共同第一作者。 专家点评（一） 钟南山（中国工程院院士） 从“非典”到“新冠”，科学依靠坚守 基础研究是科技创新的源头，是人类认识自然、适应和改造自然的知识源泉，需要科学家长期的坚守和耕耘。 自2003年“非典”开始，在不到20年的时间里，全球已经出现了3次由冠状病毒导致的传染病。尤其是此次新冠疫情，在全球已经造成超过1亿多人感染，而且随着疫情发展，突变病毒不断出现，一些已有的中和抗体不能很好的中和突变病毒，部分疫苗针对突变病毒的保护效果也有一定程度下降。深入认识病毒的生命周期，开发能够有效应对各种突变病毒的广谱抗病毒药物，将成为今后一段时间抗疫工作的重点内容之一。 目前针对新冠病毒的抗病毒药物研究，主要针对的是病毒转录复制过程的关键靶点蛋白，如蛋白酶和聚合酶等。针对这两个靶点的抑制剂已有相当数量的进入临床实验，例如瑞德西韦（Remdesivir）等。以瑞德西韦为代表的核苷类抗病毒药物主要作用于病毒的聚合酶，在被掺入产物核酸链后，阻断病毒核酸的合成，进而抑制病毒的转录复制过程。然而，在此类抑制剂进入临床研究后，其抗病毒效果与预期有一定差距。除药物代谢等问题外，冠状病毒通过特有的“复制矫正”（proofreading）机制逃逸核苷类抗病毒药物的抑制，可能是此类抗病毒药物抑制效果不佳的一个重要原因，目前仅有NHC及其衍生物能够躲避病毒复制矫正机制的干扰。对这个机制开展深入研究，将为今后发展广谱、高效的抗冠状病毒药物提供关键的科学信息。 子和教授及其团队在新冠疫情爆发后，针对新冠病毒转录复制机制开展了系统研究，先后阐明了“核心转录复制复合体”（C-RTC）[1]、“延伸转录复制复合体”（E-RTC）[2]和“加帽中间态转录复制复合体”[Cap(-1)’-RTC][3]的工作机制。在这些工作的基础上，他们又在世界上第一次成功组装成含有形式复制矫正功能的nsp14蛋白的超分子机器Cap(0)-RTC。通过结构分析，他们发现在Cap(0)-RTC形成的同源二聚体中，解旋酶通过自身构象改变，引导模板核酸链反向移动，引发产物链“回溯”（backtracking）机制，进而将产物链3’末端传输至另一Cap(0)-RTC的nsp14外切核酸酶结构域的反应中心。复制矫正机制是新冠病毒逃逸核苷类抗病毒药物的关键机制，一旦核苷类药物被加入RNA产物链中，在其被聚合酶感知为“错配碱基”后，立刻会被病毒的复制矫正过程去除，从而丧失抑制活性。他们的研究工作，为我们生动展现了这一过程的可能机制。复制矫正的回溯机制，是从低等到高等生物细胞保证基因复制准确性的重要机制，但在病毒中以往还没有发现此类机制。这一研究成果不但发现病毒中的类似机制，是认识生命进化的重要成果，而且为进一步优化和发展新型核苷类抗病毒药物提供了关键的结构基础。 子和教授自2003年SARS爆发后，就一直在冠状病毒转录复制机制研究领域开展工作，至今已坚持了18年。2003年SARS疫情爆发期间，我当时即已了解子和教授在SARS病毒的一系列成果，智勇教授那时才刚刚开始博士阶段的学习。子和教授的研究组在国际上率先解析了SARS-CoV主蛋白酶的三维结构[6]，并研发了一系列高效抑制剂[7]，他们当时在转录复制复合体上的研究[8]至今仍被国际同行认为是冠状病毒转录复制复合体机制研究的“开篇之作”。这些积累，为新冠疫情爆发后他们在新冠病毒基础研究中取得的一系列重要成果奠定了坚实的基础，通过阐明新冠病毒主蛋白酶和转录复制复合体多个状态的三维结构，为认识该病毒的生命过程、发展高效抗病毒药物提供了关键信息，先后在Nature[4]、Science[1]、Cell[3,5]和Nature Communications[2]上发表系列研究论文，是国际上抗新冠药物靶点研究中最为系统、引用最多的工作之一。 2020年9月11日，习近平总书记在科学家座谈会上总结了新时代科学家精神，强调要有勇攀高峰、敢为人先的创新精神，追求真理、严谨治学的求实精神，淡泊名利、潜心研究的奉献精神，集智攻关、团结协作的协同精神，甘为人梯、奖掖后学的育人精神。18年来，子和教授的团队中有100多人先后参与冠状病毒研究，累计发表50余篇研究论文，引用超过6000余次，均篇引用超过100次，一批早期参与的俊彦陆续成长为国家科研骨干。科学依靠坚守，子和教授团队在冠状病毒的奋斗历程，对科学家精神做了一个很好的诠释。 专家点评（二） 康乐（中国科学院院士） 从结构生物学角度认识新冠病毒的转录复制机制 新冠病毒造成的疫情，是近一个世纪以来人类面对的最大的一次公共卫生事件，深入研究病毒生命周期的分子机制，是认识病毒特征、研发抗病毒手段的关键所在。新冠病毒非常特殊，它的基因组是目前已知RNA病毒中基因组最大的一种，其生命过程所涉及的分子机制也非常复杂。新冠病毒通过两个机制保证蛋白质翻译和相对准确的转录复制过程，一是要在病毒mRNA前端加上一个帽结构（cap），用于维持mRNA的稳定性和蛋白翻译的有效进行；二是通过一个独特的“复制矫正”（proofreading）机制，对病毒基因组的复制实施控制，一旦发现核酸中的错配碱基，随时进行修正。病毒转录复制复合体上的nsp14蛋白参与了这两个关键过程，可通过其C端的N7甲基化酶完成mRNA加帽过程的第三步催化反应，同时还可通过其N端的外切核酸酶完成复制矫正过程。这一现象在“非典”病毒（SARS-CoV）即已发现，但20年来一直无法回答两个截然不同的过程如何由一个蛋白来协同执行，是冠状病毒研究领域中多年来关注的核心基础生物学问题之一。 清华大学饶子和教授、娄智勇教授团队与上海科技大学合作在Cell发表的这一工作，解析了两种不同状态的“Cap(0)转录复制复合体”Cap(0)-RTC的三维结构，发现在转录复制复合体中，病毒编码的nsp9蛋白发挥了“适配器”（adaptor）的作用，将nsp10/nsp14形成的复合体招募到聚合酶上，与聚合酶上的NiRAN结构域共同形成一个“共转录加帽复合体”（Co-transcriptional Capping Complex, CCC），展示了mRNA加帽过程中，mRNA 5’端在多个关键酶分子之间的传输路径，第一次明确揭示了基因组超大的RNA病毒是如何将以聚合酶为中心的“延伸复合体”（Elongation Complex, EC）与“加帽复合体”连接起来。更加重要的是，他们在研究中发现Cap(0)转录复制复合体在溶液状态下会形成稳定的同源二聚体，通过深入研究该二聚体的结构，提出了冠状病毒复制矫正中称之为反式回溯（in trans backtracking）的机制。进一步的研究发现，在二聚体中，一个Cap(0)转录复制复合体的聚合酶催化中心与另一个Cap(0)转录复制复合体的nsp14外切核酸酶结构域催化中心相对，使合成的产物RNA 3’末端能够通过回溯的方式传输到nsp14外切核酸酶结构域进行加工。同时，他们还发现解旋酶nsp13的1B结构域发生了重大构象变化，并通过与模板核酸链的作用，引导模板核酸链反向移动，引发产物链回溯机制。值得指出的是，通过回溯的方式进行复制矫正，在真核/原核细胞中广泛存在，但是在病毒中还是第一次观察到此类机制。虽然该过程与真核/原核细胞Pol II转录过程的复制矫正机制具有一定类似性，但在Pol II的研究中，并未观测到蛋白具有巨大的构象变化，因而Pol II中回溯的驱动力也不是十分明确，而该工作表明解旋酶通过构象变化提供了回溯的驱动力，为深入理解这一基础生物学过程提供了重要的范例。

当前，COVID-19 在世界范围内大流行，已造成超过两亿人次的感染和四百多万人次的累计死亡，基于 qRT-PCR（定量逆转录酶-聚合酶链反应）的检测是当前诊断 COVID-19 的金标准。尽管说这种方法具有很高的敏感性，但其操作仍然过于复杂，检测时间长达数小时，无法实现快速的即时检测。因此，开发比 qRT-PCR 更快速、更容易实施的诊断检测策略显得尤为重要。CRISPR/Cas 系统是用于基因编辑的分子生物学工具，有准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编辑技术。随后，多项 CRISPR-Cas9 基因编辑临床实验开启并获得突破性结果，并已成功应用于人类疾病的治疗。与 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特异靶向 RNA 序列，能够在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表现出不加区别的切割活性。这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个独特的优势，例如通过切割降解已标记的核酸来产生荧光信号，具有被应用于核酸检测的潜力。加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的诺贝尔化学奖得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科学家领导的研究团队在 Nature Chemical Biology 杂志上在线发表了题为 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。研究人员结合了两种不同的 CRISPR 酶，创造了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的方法，这种被称之为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）的无扩增技术，可以为许多传染病及当前流行的 COVID-19 提供快速且廉价的诊断策略。主要研究内容LbuCas13a 结合嗜热栖热菌 Csm6（TtCsm6）可用于快速 RNA 检测Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 内切酶，可被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子，基于其信号放大的内源性功能，有可能提高 RNA 检测的敏感性。通过筛选，研究人员发现寡核苷酸 A4-U6 可结合并刺激 TtCsm6 对报告蛋白的切割，并释放出荧光分子。此外，不同浓度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分钟内出现荧光增长，随后达到一个平台值，最终荧光水平与 Csm6 激活剂的数量成正比。在荧光已经趋于平稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反应中加入 A4-U6 激活剂可以迅速增加 TtCsm6 对靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响。这些数据表明 Csm6 的 A4P 配体会随着时间的推移而耗尽，从而使其 RNA 切割活性失活，而这种失活则限制了其产生荧光信号的数量。Csm6 激活剂的化学修饰为了解决 Csm6 激活剂失活的难题，他们想到了位点选择性化学修饰的方法，实验结果发现，这种策略不仅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同时还能保持 Csm6 的高水平激活状态，使其可以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。灵敏度比未修饰的 A4-U6 激活剂提高了 100 倍。RNA 检测的可编程性为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂能够用于提高 RNA 检测的灵敏度和检测速度，必须保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程特性。为此，他们将 TtCsm6 及其激活剂添加到一个 LbuCas13a 蛋白中，该蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列进行检测，发现其具有相似的灵敏度和动力学，这表明，这种「一步法」可以对不同的 crRNA 序列进行编程，因此可能适用于几乎任何 RNA 序列的检测。为了确定添加 TtCsm6 是否能加快检测时间，他们在反应 20 分钟后比较了这两种检测策略的结果，发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可完成对每微升 31 个拷贝的样品检测。综上这些结果表明，通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂，串联 CRISPR 核酸酶检测能够实现对传染性病原体 RNA 序列的无扩增检测，在加速检测病原体的同时兼具高灵敏度，他们称这种策略为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）。集合检测器实现 FIND-IT 即时检测病毒 RNA最后，为了证明将上述 FIND-IT 纳入即时测试流程的可行性，他们开发了一种便捷检测器，该检测器由一个带有反应室的微流控芯片、一个将反应维持在 37℃ 的加热模块和一个荧光成像系统组成。将含有靶标 RNA（SARS-CoV-2 RNA）或水（无靶标 RNA）的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反应室内，1 小时后发现，当 SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷贝时，反应信号呈非线性增加，1 h 内增加约 4.7 倍；而不含靶 RNA 的阴性对照则出现约 1.7 倍的变化。此外，与背景对照相比，每微升反应 400 拷贝的荧光量增加了 270%，而两个阴性对照的荧光量则同时增加了 3%。鉴于阳性和阴性样品之间荧光信号的巨大差异，这表明 LbuCas13a-TtCsm6 反应可在一个紧凑的检测器中实现，并可以用于即时诊断检测。结语综上所述，在这项研究中，该团队证明了 LbuCas13a 与 TtCsm6 联合可用于快速 RNA 检测，对其激活剂进行化学修饰后可使其敏感性提高约 100 倍。同时，将 TtCsm6 与含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效应体相结合，也可使提取的病毒 RNA 检测低至每微升 31 个拷贝，60 分钟检测准确率更是达到 100%。最后，他们还将这种分析策略应用于集成检测设备，保证了其便捷性。因此，这种「一键式」检测策略具有高灵敏性和快速的反应能力，未来可广泛应用于检测 SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或细胞 RNA 序列或环境样本中的植物、真菌或微生物 RNA。不过，使用 FIND-IT 实现完整的即时检测还需要进一步开发合适的样本收集和处理程序，以及强大的数据分析流程，将来仍需要进行更多人类样本的测试，以验证其在临床样本检测中的稳定性和准确性。本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「这种串联核酸酶方法——Cas13 联合 Csm6，在 37℃ 的单一温度下发生反应，并不需要其他诊断技术所需的高温加热，这为更快更简便的测试提供了可能，同时这些测试的灵敏度当前已经可以达到与其他检测技术相当的水平，并且可能在未来做到更加灵敏。」研究团队在接受采访时说到：「虽然我们确实是为了 COVID-19 而启动了这个项目，但我们认为这种特殊的技术不仅仅适用于此次疫情，因为 CRISPR 是可编程的，因此可以将针对流感病毒、HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，该系统均可用相同的方式工作。这一研究证明了这种生物化学方法是一种更简单的检测 RNA 的方法，并且快速敏感，这可能被应用于未来的即时诊断中。

仪器信息网讯 9月27日-29日，两年一度的北京分析测试学术报告会暨展览会（BCEIA 2021）在北京中国国际展览中心盛大召开。乱花渐欲迷人眼，国内外七百余家分析测试领域仪器研发制造企业携新品、拳头产品竞相亮相。在众多科学仪器新品中，一家专注智能自动化技术应用与解决方案的高科技公司格外吸睛——镁伽。成立于2016年的镁伽颇受资本市场青睐，目前已经完成七轮超10亿人民币的大额融资。在BCEIA 2021展会现场，镁伽携样本前处理系统、超高通量全自动核酸检测系统等多款核酸检测产品首次公开亮相，仪器信息网小编来到镁伽公司展位，向该公司高级产品经理武文婷女士详细了解了这几款参展产品。仪器信息网编辑展位采访镁伽高级产品经理武文婷女士镁伽超高通量全自动病毒核酸检测系统首次公开亮相今年8月，镁伽推出最新自主研发的MegaMicro超高通量全自动病毒核酸检测系统（MRA-CDF-800），本次展会也是这款超通量系统首次公开亮相。据了解，镁伽超高通量全自动病毒核酸检测系统日单管检测通量可高达11,000份，同时支持5混1、10混1等混样检测，人效提升可高达40倍，名副其实超高通量！该系统能实现从核酸样本开盖分杯，核酸提取，PCR体系构建，再到封膜和qPCR检测的全流程自动化，是国内同类产品中唯一连入了分杯模块并能够真正实现超高通量的“样本进-结果出”全自动病毒核酸检测系统。了解核酸检测的同行应该知道，核酸检测的“交叉污染”问题是一大风险。镁伽这款系统内置HEPA过滤系统和紫外消毒系统，并配有传递窗，能够实施严格的PCR分区，保证生物安全的同时也符合相关法律法规的要求，能够在大规模检测时最大程度避免核酸假阳性和假阴性情况，也能更好的保证一线医务检测人员的个体安全。样品前处理机器手臂备受瞩目在核酸样品检测全流程，咽拭子样本处理是第一步，也是最危险的一步。镁伽自主研发的样品前处理系统（MRA-CDS-600）作为超高通量全自动病毒核酸检测系统（MRA-CDF-800）的重要组成部分，能够自动处理最前端的分杯步骤，其主要工作是将采集样品后的咽拭子管开盖打开，用安全的机器操作代替人工操作，最大程度保护医护人员，避免医护人员感染和暴露。该系统为去年疫情肆虐时镁伽为核酸检测应用需求专项研发的解决方案，日处理量超过12万人次，通量对比人工提升20倍以上，能够极大助力“时间紧、任务重”的核酸检测工作。核酸检测技术是一项非常灵敏的分子诊断技术，镁伽公司的高级产品经理武文婷表示，尽管镁伽研发的产品最初定位为新冠病毒核酸检测，尤其是在大规模“万人检测”方面这款超高通量全自动病毒核酸检测系统具有绝对优势。但MRA-CDF-800系统不仅可以应用到新冠病毒疫情防控，还可以应用到其他核酸检测项目，其在众多生命科学和医学应用领域具有广阔的拓展空间。不只是单品类仪器设备，镁伽还能够提供新冠病毒核酸检测全流程仪器、试剂、耗材等技术全流程整体解决方案。小编观后有感：自动化、一体化是科学仪器一大发展趋势，此外在医学应用领域，检测仪器的安全性和高通量更加关键。镁伽将机器人研发思维与医学仪器研发理念深度融合，开发出国内首款连入了分杯模块并能够真正实现超高通量的“样本进-结果出”全自动病毒核酸检测系统，这也意味着国产仪器突破了生命科学实验室自动化领域受国外垄断的“卡脖子”困境。在新冠疫情零星爆发，新冠病毒变异升级，防控难度加大的情形下，这款全自动超高通量核酸检测系统能够协助疫情防控开展大规模核酸检测，在保障基层医护人员安全的基础上，让核酸检测更高效、便捷。

日前，德祥集团CEO Mr. Stephen Yu与美国LABCON North America公司销售经理Tom Moulton正式签署了双方友好合作协议，德祥集团成为LABCON产品的中国区一级代理。 成立于1959年的LABCON，位于美国加州的Petaluma，专业生产实验室塑料制品。产品多达800多种，遍布世界各地，是美国*的实验室耗材销售商VWR 的耗材供应商。LABCON主要产品有各类移液吸头，各种规格离心管、细胞培养管、PCR反应管等。 LABCON自1995年开始致力于环保型耗材的研发与生产，自1996年开始进行内部批量核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶、内毒素的测试，并于1997年通过了ISO 9001质量管理体系认证。 此次协议签订之后，LABCON公司销售主管Steven Teng现场为德祥集团上海分公司全体员工做了产品培训以及技术指导，为LABCON产品的推广奠定了良好的基础。作为LABCON在中国地区的主要经销商，德祥集团将全权负责LABCON系列产品在该区域的市场推广、技术、销售和应用支持工作，一如既往的为LABCON的广大新老用户提供完善*的服务！

p　　12月24日，The Scientist评选出了“Top Technical Advances 2015”，成像、光遗传学、单细胞分析以及基因编辑技术CRISIPR入选。那么，我们就一起看看这四大技术在过去的一年中都取得了哪些进展吧。/pp　　strong成像/strong/pp　　今年，a title="" style="color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "生命科学/span/a的成像领域打破了过去的壁垒，科学家们通过显微镜学方法越来越深入的观察到了生命组织。/pp　　Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances./pp style="text-align: center "img width="500" height="281" title="1.jpg" style="width: 500px height: 281px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/550d29a2-5d13-4f9b-80da-ed1514392728.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"/ /pp　　在过去的十年里，一种称作为体内振动光谱成像(vibrational spectroscopicimaging)的技术一直被用来捕捉一些活体组织中蛋白质、脂类、核酸和其他分子的活动。尽管这一技术可在无需荧光标记的条件下显影组织，但它仍然太慢而无法适用于大多数的研究和a title="" style="color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "临床应用/span/a。/pp　　10月30日，Purdue大学的科学家们报告称，他们利用体内振动光谱成像技术大大提高了收集图片的速度(从分到秒)。新技术最关键的改进是不再需要收集分子振动信号的光谱仪。取而代之的是，这一改进的技术在光子进入组织前会对其进行颜色编码。/pp　　该研究的通讯作者 Ji-Xin Cheng 说：“我们的想法是在将光子发送到组织前，用不同的兆赫频率进行颜色编码。通过这样的方式，我们能够在几十微妙内收集漫射光子，并通过编码频率和光颜色之间的一一对应检索光谱。”/pp　　Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods./pp style="text-align: center "img width="500" height="281" title="2.jpg" style="width: 500px height: 281px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/b0bb94ab-9898-4818-9de9-d2b62801551e.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　同一个月，发表在《Nature Methods》上的一项研究中，霍华德休斯医学研究所Philipp Keller领导的研究小组发明的一款新型显微镜让科学家们能够更加清晰、全面的观察活体动物的生物过程。/pp　　这款显微镜能够产生完整的、不透明生物体的图像，包括斑马鱼或果蝇的胚胎，在三个维度都有足够的分辨率，每个细胞都能展现出明显的结构。更重要的是，它能够观察到胚胎发育过程中细胞的移动，还能够监测大脑活动。研究人员用它记录了果蝇神经系统发育的过程，最终共有10,000个细胞。/pp　　strong光遗传学/strong/pp　　All-Optical Interrogation of Neural Circuits. Journal of Neuroscience ./pp style="text-align: center "img width="500" height="281" title="3.jpg" style="width: 500px height: 281px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/f53a88eb-91d0-4b20-b9af-9dabdc4fbcc1.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　今年11月，MIT的Edward Boyden和斯坦福大学的Karl Deisseroth因他们在光遗传学领域的工作获得了表彰。光遗传学技术是指通过光线来操控神经元，科学家们一直在不断的改进这一技术。/pp　　本月前，在芝加哥举行的神经科学学会会议上，Deisseroth等人提出了全光电生理学(all-optical electrophysiology)的升级版。哈佛大学Adam Cohen和他的团队开发出了一种reporter，当引入到细胞中去时，在电压发生改变的情况下会发出红外线。Cohen与Boyden一起，将电压指示器与一种响应蓝光的膜通道一起导入到了细胞中，这使得研究人员能够用蓝光开启细胞，用红外线记录它们的活动。/pp　　Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science./pp　　今年6月，发表在《科学》杂志上的一项研究中，研究人员在海藻中发现了一种紫红质通道蛋白(channelrhodopsin)，与先前开发的工程通道相比，它能够更快地抑制神经元活动。科学家们还开发出了一种对在光遗传学控制下神经元作出即时反馈的方法，维持它们的活性在一个理想的状态。这一“神经恒温器”(neuro thermostat)可在24小时内控制细胞的firing rate常数。/pp　　strong单细胞分析/strong/pp　　Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell/pp　　Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell/pp style="text-align: center "img width="400" height="400" title="4.jpg" style="width: 400px height: 400px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/21d86143-27bf-4226-8414-b90e7a49c325.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　近年来，单细胞分析蓬勃发展，研究成果不断涌出，技术也越来越精准。今年，通过单细胞分析，科学家们鉴定出了一个新的细菌们，检测了小鼠肠道内最珍贵的细胞类型。5月，发表在《细胞》杂志上的两项研究使单细胞转录组学有了一个相当大的飞跃，并行检测的细胞数量从约100增加到了几千。/pp　　哈佛大学的Marc Kirschner和Steve McCarrol实验室开发出了一些高通量技术，能够在样本进入到搅拌器中去之前，快速、轻松、廉价地赋予每个细胞独特的遗传条形码。研究小组希望他们的技术将能够帮助生物学家们更深入地发现和分类机体中的细胞类型，绘制出大脑一类复杂组织中的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，以及获得更多有关疾病遗传学的认识。/pp　　两个研究小组各自开发了一些方法利用微珠将大量不同的DNA条形码同时传送到几十万纳米大小的液滴中。两种方法都利用了微流体装置来将细胞和微珠一起装入这些液滴中。这些液滴是在一个小型装配线上生成，沿着一根头发宽的槽道流动。微珠条形码附着到每个细胞的一些基因上，因此科学家们可以一批次测序所有的基因，追踪每个基因的来源细胞。/pp　　strongCRISPR/strong/pp　　我们熟知的基因编辑工具CRISPR不断带来新的研究成果，在许多研究人员利用CRISPR的同时，其他一些人则专注于改进这一技术。/pp　　Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nature Biotechnology./pp style="text-align: center "img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/153730c1-5f84-484b-a957-9d99a4d6fd77.jpg"//pp　　6月15日，发表在《Nature Biotechnology》上的一项研究中，科学家们结合CRISPR与光遗传学构建出了一种系统：一种光激活的新型Cas9核酸酶使得研究人员能够在空间和时间上更好地控制RNA引导的核酸酶的活性。/pp　　研究人员通过首先将Cas9蛋白分成两个失活的片段构建出了paCas9。随后他们让每个片段连接一个光控开关蛋白Magnet。当受到蓝光照射时，两个Magnet蛋白结合到一起，分开的Cas9片段随之结合重建出了RNA引导的Cas9核酸酶活性。重要的是，这一过程是可逆的：当切断光线时，paCas9核酸酶会再度分裂，核酸酶活性终止。/pp　　Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science./pp　　Cas9酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是CRISPR技术需要克服的重大技术问题。11月30日，发表在《科学》杂志上的一项研究中，麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所CRISPR大神张锋的研究小组又取得了一项突破性的成果。研究人员通过创建了3个新版本的Cas9酶大大降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应 有效改善了这一技术的最大局限性之一。/pp　　In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.Nature./pp style="text-align: center "img width="450" height="281" title="6.jpg" style="width: 450px height: 281px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/48e6fc4c-b79f-4a44-bdb7-88bcca74d8dc.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　4月1日，发表在《自然》杂志上的一项研究中，张锋研究小组还鉴别出了一种更小的Cas9核酸酶版本。最常使用的Cas9酶源自化脓性链球菌(SpCas9)，因太大而无法装入到腺病毒载体中。这项研究中介绍了一种来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(saCas9)，它比SpCas9小25%，从而为腺病毒的包装问题提供了一个解决方案。并未参与这项研究的杜克大学的 Charles Gersbach 说：“真正让人兴奋的是saCas9在体内真的能发挥作用。”/pp　　Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology./pp　　同月6日，Gersbach和同事们也在《Nature Biotechnology》发表了他们的研究成果。研究人员结合一种组蛋白乙酰转移酶与Cas9构建出了一种表观遗传编辑器。他们破坏了Cas9切割DNA的能力，转而利用它作为一种自动引导装置到达基因组中的正确位点，并通过组蛋白乙酰化来启动基因。/pp　　span style="font-size: 14px "备注：本文部分内容参考自生物通网站。/span/p

基本信息 关键内容： 核酸提取仪,PCR,大分子作用仪 开标时间： null 采购金额： 450.00万元 采购单位： 眉山市彭山区中医医院 采购联系人： 刘先生 采购联系方式： 立即查看 招标代理机构： 四川勤能建设项目管理有限公司 代理联系人： 吴女士 代理联系方式： 立即查看 详细信息 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目需求论证公示 四川省-眉山市-彭山区 状态：预告 更新时间： 2021-09-18 招标文件: 附件1 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目需求论证公示 2021-09-18 16:29 各潜在政府采购供应商单位、各人： 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目拟采用公开招标方式采购。为保证采购需求科学合理、符合实际，严禁豪华、重复、无用采购发生，根据《财政部关于进一步加强政府采购需求和履约验收管理的指导意见》的通知（财库[2016]205号）文件的规定，于2021年09月18日组织专家对该项目进行了采购需求论证。现将此事项向潜在的政府采购供应商和社会公众广泛征求意见，有关情况公示如下： 一、采 购 人：眉山市彭山区中医医院 二、采购代理机构：四川勤能建设项目管理有限公司 三、项目名称：眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目 四、采购预算：450万元，最高限价：450万元。 五、采购方式：公开招标 六、论证事项包括以下内容： （一）是否属于政府采购政策扶持范围； （二）采购数量、采购标的的功能标准、性能标准、材质标准、安全标准、服务标准以及是否有法律法规规定的强制性标准； （三）拟采用的采购方式、评审方法和评审标准； （四）拟确定的供应商参加采购活动的资格条件； （五）政府采购项目的实质性要求，政府采购项目履约时间和方式、验收方法和标准及其他合同实质性条款； （六）其他需要论证的事项。 七、专家组论证意见：详见附件。 各潜在供应商、单位及个人对公示内容及论证意见有异议的，应于需求论证公示发布之日起3个工作日内（发布当天不计算），以书面形式（包括异议具体内容、事实，供应商名称及联系人姓名和联系人方式等），将异议情况反馈至采购人或采购代理机构。 采购人：眉山市彭山区中医医院 联系地址：四川省眉山市彭山区凤鸣大道三段1038号 联系人：刘先生 联系电话：028-37628519 采购代理机构：四川勤能建设项目管理有限公司 联系地址：四川省眉山市彭山区前程路与彭祖新城大道交叉口-龙门新苑一组团B70号 联系人：吴女士 联系电话：15082352574 附件: × 扫码打开掌上仪信通App 查看联系方式 基本信息 关键内容：核酸提取仪,PCR,大分子作用仪 开标时间：null 预算金额：450.00万元 采购单位：眉山市彭山区中医医院 采购联系人：点击查看 采购联系方式：点击查看 招标代理机构：四川勤能建设项目管理有限公司 代理联系人：点击查看 代理联系方式：点击查看 详细信息 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目需求论证公示 四川省-眉山市-彭山区 状态：预告 更新时间： 2021-09-18 招标文件: 附件1 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目需求论证公示 2021-09-18 16:29 各潜在政府采购供应商单位、各人： 眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目拟采用公开招标方式采购。为保证采购需求科学合理、符合实际，严禁豪华、重复、无用采购发生，根据《财政部关于进一步加强政府采购需求和履约验收管理的指导意见》的通知（财库[2016]205号）文件的规定，于2021年09月18日组织专家对该项目进行了采购需求论证。现将此事项向潜在的政府采购供应商和社会公众广泛征求意见，有关情况公示如下： 一、采 购 人：眉山市彭山区中医医院 二、采购代理机构：四川勤能建设项目管理有限公司 三、项目名称：眉山市彭山区中医医院医疗设备（PCR扩增仪、核酸提取仪、移动PCR方舱实验室、生物安全采样工作站）采购项目 四、采购预算：450万元，最高限价：450万元。 五、采购方式：公开招标 六、论证事项包括以下内容： （一）是否属于政府采购政策扶持范围； （二）采购数量、采购标的的功能标准、性能标准、材质标准、安全标准、服务标准以及是否有法律法规规定的强制性标准； （三）拟采用的采购方式、评审方法和评审标准； （四）拟确定的供应商参加采购活动的资格条件； （五）政府采购项目的实质性要求，政府采购项目履约时间和方式、验收方法和标准及其他合同实质性条款； （六）其他需要论证的事项。 七、专家组论证意见：详见附件。 各潜在供应商、单位及个人对公示内容及论证意见有异议的，应于需求论证公示发布之日起3个工作日内（发布当天不计算），以书面形式（包括异议具体内容、事实，供应商名称及联系人姓名和联系人方式等），将异议情况反馈至采购人或采购代理机构。 采购人：眉山市彭山区中医医院 联系地址：四川省眉山市彭山区凤鸣大道三段1038号 联系人：刘先生 联系电话：028-37628519 采购代理机构：四川勤能建设项目管理有限公司 联系地址：四川省眉山市彭山区前程路与彭祖新城大道交叉口-龙门新苑一组团B70号 联系人：吴女士 联系电话：15082352574 附件:

导读目前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)已经在全球范围内呈大流行趋势，为全球社会带来重大损失。大约15-30% 的住院 COVID-19 患者出现急性呼吸窘迫综合症、全身性组织损伤和/或多器官衰竭，导致大约 45% 的病例死亡。因此非常需要生物标志物来量化组织损伤、预测临床结果并指导住院 COVID-19 患者的临床管理。近日来自巴黎公共援助医院微生物学系的科学家在《Clin Infect Dis.》发表了一篇文章，题目为“Circulating Ubiquitous RNA, A Highly Predictive and Prognostic Biomarker in Hospitalized Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Patients”。文章中运用naica微滴芯片数字PCR对SARS-CoV-2 RNAemia和核糖核酸酶P (RNase P) RNAemia进行定量分析，结果表明这两种标志物可以用于COVID-19住院患者的临床监测和管理。应用亮点：▶ 利用naica微滴芯片数字PCR对SARS-CoV-2 RNAemia和核糖核酸酶P (RNase P) RNAemia进行检测。▶ 患者入院时SARS-CoV-2 RNAemia和RNase P均与临床严重程度和有创机械通气(IMV)有相关性。▶ 入院时血浆RNase P RNA浓度与生存率有相关性。首先作者利用naica微滴芯片数字PCR对139例COVID-19患者入院时血浆中SARS-CoV-2 RNAemia和核糖核酸酶P (RNase P) RNAemia进行定量分析。随后采用统计学公式对两种标志物在COVID-19患者入院时的临床严重程度方面的价值进行评估，并将它们与患者治疗期间的临床结果进行关联。结果表明：患者入院时SARS-CoV-2 RNAemia与临床严重程度和有创机械通气(IMV)有相关性，与患者入院时CT扫描显示的肺部严重程度没有相关性(图1)。▲图1. A，139例临床严重程度不同的COVID-19患者的SARS-CoV-2 RNAemia浓度。B，根据IMV状态分析139例COVID-19患者的SARS-CoV-2 RNAemia浓度。C， SARS-CoV-2 RNAemia浓度(log copy/mL)与肺部严重程度的相关性。血浆RNase P浓度与临床严重程度等级和有创机械通气状态高度相关，RNase P RNAemia与患者入院时CT扫描显示的肺部严重程度之间没有相关性(图2)。▲图2. A，139例COVID-19患者根据临床严重程度的血浆RNase P浓度。B，根据IMV状态分析139例COVID-19患者血浆RNase P浓度。C，RNase P RNAemia浓度(log copy/mL)与肺严重程度的相关性。患者入院时血浆RNase P RNA浓度与治疗期间的死亡显著相关，而SARS-CoV-2 RNAemia值并不能预测死亡率(图3)。▲图3. RNase P RNAemia的总生存率(log copy/mL)因此，在住院的COVID-19患者中，SARS-CoV-2 RNAemia和普遍存在且具有特异性的人类细胞内RNA标记物RNase P可以作为生物标志物，指导COVID-19住院患者的管理，提供准确的预后。期刊介绍：Clin Infect Dis杂志是美国感染病协会（IDSA）的官方出版物，主要刊登感染病学各方面的原创前沿研究和一些综述性文章，致力于将研究结果应用于临床，直到临床医生对感染性疾病的诊治。CID还定期发布感染性疾病最新治疗指南。CID杂志影响因子为8.195，在所有感染病专业期刊中排名第一。

美国Labcon生物耗材携手德祥首次圆满亮相BCEIA 2009年11月25日-11月28日，美国知名厂家Labcon联合德祥集团携手参展了北京BCEIA展会。 美国Labcon公司成立于1959年，位于加州的Petaluma，专业生产实验室塑料制品。产品多达800多种，遍布世界各地，是美国*的实验室耗材销售商VWR 的耗材供应商。 Labcon自1995年开始致力于环保型耗材的研发与生产，自1996年开始进行内部批量核糖核酸酶/脱氧核糖核酸酶、内毒素的测试，并于1997年通过了ISO 9001质量管理体系认证。 图一：美国Labcon生物耗材专柜Labcon主要产品： 1、 SuperClear超透明离心管； 2、 各种吸头&mdash &mdash 普通吸头，带滤芯吸头，高回收率吸头，层叠免装型吸头； 3、 各种规格冻存管、细胞培养管； 4、 PCR相关产品：PCR反应管，PCR反应板，PCR封板膜，real-time PCR专用PCR板； 5、 各类样品储样盒、储样板、深孔板等。 产品主要特点： ◆产品生产所使用原料均经美国FDA CFR21认证，纯净度高，无菌包装，无DNA/RNA污染、无内毒素、无痕量金属； ◆离心管最高承受离心力为40000 RCF； ◆快速填充系列吸头可令您在10秒之内填充完成一盒tip rack，并确保整个过程干净无污染。 图二：美国Labcon超透明环保基架离心管及快速填装吸头 德祥科技公司作为美国Labcon产品在中国的*代理商，专注服务于生命科学、制药、农业、环境、食品，石化及工业实验室等众多领域的客户提供*的产品和服务。 了解更多产品信息，请浏览我们的网站：www.tegent.com.cn 客服热线：4008 822 822 期待您的继续关注！

中国科学院广州生物医药与健康研究院29日发布消息称，该院赖良学课题组利用精确基因编辑技术对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这一研究成果近期被《分子细胞生物学杂志》在线发表。　　根据国际糖尿病联盟在2015年发布的数据，世界范围内共有4.15亿名成年人患有糖尿病。2015年有500万人因糖尿病而死亡，超过了疟疾、肺结核与HIV的致死人数总和。　　据课题组介绍，目前，对糖尿病的治疗包括胰岛素注射和胰岛移植。猪源胰岛素曾经被广泛采用，利用猪胰岛进行异种移植治疗糖尿病最近也取得良好进展。但猪与人相比，胰岛素蛋白存在一个氨基酸的差异，人胰岛素B链第30位氨基酸是苏氨酸，而猪胰岛素是丙氨酸。这一个氨基酸的差异使猪胰岛素在人体中的降血糖效价较低，而且长期使用容易诱发抗体产生。　　研究人员李小平博士、杨翌博士和王可品博士研究生等将TALENs(转录激活因子样效应物核酸酶)及CRISPR(RNA介导的DNA核酸酶)技术与单链寡核苷酸结合，建立了猪基因组无痕定点编辑技术，利用该技术在体细胞中将猪胰岛素基因编码B链第30位丙氨酸的密码子GCC修改为编码苏氨酸的ACG，并获得了纯合子细胞株。同时，研究人员利用该细胞株作为核供体，通过体细胞核移植技术成功构建了人源化胰岛素克隆猪，利用高分辨率液相色谱串联质谱仪检测证实，从该基因修饰猪胰腺中提取的胰岛素完全为人胰岛素，而不含猪胰岛素。　　研究人员说，该研究获得的人源化胰岛素基因修饰猪将为糖尿病的治疗提供人胰岛素，同时也将为临床异种胰岛移植治疗提供更为理想的供体来源。从技术层面来说，该成果也是第一次在大动物中实现无痕的基因组定点修饰，这种定点无痕技术的建立，将推动基因突变大动物疾病模型和具有农业育种价值的基因修饰大动物的培育。

(一)基因治疗领域　　越来越精准(Keeping it precise)　　精准的基因编辑使得我们对一系列难治性且容易产生抗性的疾病进行治疗，来自哈佛医学院研究人员的研究(Nature 528, 490-495,2016)开发出一个新版本的Cas9酶或能够强有力的解决困扰CRISPR/Cas9系统的障碍，使脱靶效应降低到无法检测的水平，让我们离高度特异性的核酸酶更近了一步。　　酿脓链球菌Cas9酶(SpCas9)可以和短链向导RNA(sgRNAs)一起进行基因组编辑，后者通过与靶标互补配对从而引导核酸酶结合DNA。由于sgRNAs不具有特异性，因此可能切割与靶序列相似的DNA序列，从而造成脱靶效应。这项研究中，研究人员认为非特异性剪切可能是由于核酸酶与非特异性DNA序列结合紧密导致，因此他们合成了一种与非特异性序列结合力更弱的突变核酸酶(SpCas9-HF1)，在人体细胞实验中他们发现这个核酸酶可以将超过85%的靶序列切割，但是却检测不到非特异性切割。　　这种方法或使得基因编辑能够进行更安全的治疗，也为研究人员提供了一种优化核酸酶的策略。　　(二)免疫疗法领域　　合乎常理的生物制品(Logical biologicals)　　T细胞在一些临床试验中展现出了惊人的潜力，例如：通过基因工程编辑T细胞内源性受体或者添加外源性嵌合抗原受体(CAR)，使之可以识别癌细胞表面的抗原，但由于这些抗原大多数也会在正常细胞中表达，因此这种疗法经常带来严重副作用。　　今年Wendell Lim实验室报道了一种有可能改善CAR治疗的方法，这种方法依赖于一种进化上的传统信号通路，在这条信号通路中，Notch受体与细胞外信号一起控制基因转录，从而控制细胞行为。　　利用这个特点，研究人员建立了一种新的调控机制：T细胞先通过一种合成的Notch受体(SynNotch)识别癌细胞的一种抗原，以此激活对另一种肿瘤抗原特异性的CARs的转录翻译(Cell 164, 780-791, 2016 Cell 164, 770-779, 2016)。这种组合可以限制T细胞杀伤只表达这两种抗原的细胞。因此这种方法可以提高选择性、更好控制以减小治疗时产生的副作用。在荷瘤小鼠身上，SynNotch T细胞特异性地清除了同时表达两种抗原的细胞，而对只表达一种抗原的细胞无影响。　　在相同课题组随后的一篇文章中，他们表明SynNotch T细胞可以分化为需要的各种效应细胞或者选择性产生细胞毒性分子、抗体、细胞因子及佐剂，同时这些反应仅仅需要通过合成的通路就可以控制，与内源性的T细胞信号通路无关。　　事实上，SynNotch T细胞可以用于对抗病毒感染、过度活化或其他功能紊乱的细胞，这大大拓宽了它的应用领域，但是还需要优化进而将之转化为临床应用。　　(三)传染病领域　　设计HIV抗体(Blueprints for HIV antibodies)　　全世界有超过3600万的HIV感染患者，2015年新发感染病例超过200万，因此开发可以预防HIV感染的疫苗是全球公共卫生的首要目标。但是由于HIV病毒可以很快躲过免疫系统的监视，因此传统的疫苗对之无效。　　近年来，从部分感染患者身上找到可以中和一系列HIV病毒的广谱性中和抗体(bNAbs)促使研究人员尝试通过人工抗原去产生这种抗体。但是，由于这些bNAbs的前体蛋白并不与HIV结合，这个过程就变得异常复杂。　　采用一种工程化手段，Amelia Escolano及其同事发现通过不断修饰针对HIV包膜蛋白(Env)的抗原，并逐步免疫小鼠，这些小鼠成功产生了针对难中和二级抗体的HIV特异性bNAbs(Cell 166, 1445-1458, 2016)，而反复注射针对Env的单一抗原则不会产生bNAbs。　　尽管一些HIV阳性的感染者激发了HIV bNAbs，但是这项研究是人类首次采用免疫的方法成功产生HIV bNAbs。尽管这种方法太复杂以至于很难直接进行临床转化，但是它为合成HIV人工抗原并通过特殊方法激发HIV抗体带来了曙光。　　(四)癌症领域　　1)致命的逃逸(A deadly escape)　　在癌症转移的过程中，癌细胞必须先突破血管周围的内皮细胞障碍，从而进入循环系统并到达新的组织。　　而一项新研究表明：癌细胞可以通过诱导内皮细胞死亡而通过血管壁进入血管(Nature 536,215-218,2016)。　　来自马克斯-普朗克心肺研究所(Max Planck Institute for Heart and Lung Research)的研究人员首次发现：癌细胞与内皮细胞共培养时会通过癌细胞表面的淀粉样前体蛋白激活内皮细胞表面的死亡受体6(DR6)，从而诱导内皮细胞死亡。这个效应对小鼠体内肿瘤转移至关重要：抑制癌细胞诱导的内皮细胞死亡可以抑制血管中的癌细胞在肺部形成转移灶。　　当然，该研究还需要进一步深入以阐明：内皮细胞死亡如何促进癌细胞穿过血管以及整个过程如何促进人体内肿瘤转移。　　2)突变受体(Going after receptor mutants)　　内皮生长因子受体(EGFR)突变的非小细胞肺癌病人往往因此受益，但是这些受体往往又会再次突变导致肿瘤产生抗药性。　　抗表皮生长因子受体(EGFR)耐药性突变肺癌的新型异位抑制剂(第四代新药)EAI045的研发成功，是国际上第一个可以克服T790M/C797S耐药突变的抑制剂，具有广谱的EGFR抑制效果。　　这个由美国科学家和工业界合作发现的变构EGFR抑制剂对一系列EGFR突变型都具有较强的抑制效果(Nature 534, 129-132, 2016)。　　通过对250万个化合物的筛选，研究人员发现了这个特别的抑制剂，它可以结合突变受体的一个变构点，使受体保持一种失活的构象，同时不影响它结合ATP的功能，也不会影响正常EGFR受体的功能。与西妥昔单抗(cetuximab)联合使用时，这个抑制剂可以让耐受目前所有疗法的肿瘤缩小。　　(五)再生医学领域　　细胞介导修复晶状体(A lens on cell-mediated repair)　　使用内源性干细胞(endogenous stem cells)进行组织修复是再生医学的一个主要目标，这可有效避免免疫排斥及外源性干细胞引入导致的肿瘤形成。　　眼部疾病修复就是再生医学的一个重要领域，由于此前已经发现了晶状体内皮前体细胞(LECs)，而促进LECs的增生是治疗白内障的有效方法。　　一项由中美科学家合作完成的新研究(Nature 531,323-328,2016)找到了一种新的侵入程度低的手术方法，未来有可能用于治疗先天性白内障的婴儿，同时并发症发生概率极低。研究人员通过在晶状体边缘以远小于此前的创口在健康兔子和猕猴眼内进行了手术，这在最大程度上保留了LEC，并保持了晶状体的自然恢复时间。　　这种方法如果成功转化到临床，将显着降低术后并发症及再次手术的概率。　　目前通过在12例儿童白内障患者身上进行实验，他们发现这项技术可以和常规手术一样提高视力，但是并发症发生率由常规的92%降低到了17%。　　不过由于年龄相关的白内障患者体内LECs数量降低，这个方法是否对老年白内障也有效还需要进一步验证。　　(六)自身免疫疾病领域　　迈向抗原特异性治疗(Toward antigen-specific therapy)　　尽管被批准的自身免疫疾病治疗药物非常少，但两项最新研究提供了一种概念性的自身免疫病治疗新方法：通过特殊手段特异性清除攻击病人自身组织的淋巴细胞而不影响免疫系统的其它部分。　　慢性天疱疮是一种由于抗体结合皮肤蛋白桥粒芯蛋白3(Dsg3)导致的罕见起疱疾病，受到肿瘤免疫治疗的启发，来自宾夕法尼亚大学的研究人员(Science 353,179-184,2016)设计了一种工程化T淋巴细胞(将嵌合抗原受体更换为了Dsg3)，可特异性攻击产生自身抗体的B淋巴细胞，从而抑制了自身抗体的产生。　　而来自加拿大的卡尔加里大学(University of Calgary)研究人员(Nature 530,434-440,2016)采用了另一种方法，他们通过增强调节性T细胞的功能来治疗疾病，而非杀死B细胞。　　他们通过在纳米颗粒上修饰抗原肽-主要组织相容性复合物(MHC)，可以促使T细胞转变为调节性T细胞，系统注射这样的纳米颗粒后，1型糖尿病小鼠体内产生了大量的调节性T细胞，从而维持了血糖的正常水平。　　据悉，一旦临床试验成功，这种Navacims纳米候选药物或有望帮助治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等一系列疾病。　　(七)神经生物学领域　　解析突触的剪切(Parsing synaptic pruning)　　经典的补体级联放大信号通路已经被证明会影响中枢神经系统中神经回路的发育和重塑，但是否补体系统也会促进神经疾病发生还不清楚。而今年发表的3项研究则揭示了补体介导的突出清除对神经精神病学疾病及神经退行性疾病的影响。　　Broad研究所的Stanley精神中心、哈佛医学院和波士顿儿童医院的研究人员根据近6万5千人的遗传分析，揭示了如果一个人继承的“突触修剪”相关的基因(消除神经元之间的连接)，他们的精神分裂症的风险会增加。研究人员发现：补体4基因(C4)突变导致的结构变化与精神分裂症相关(Nature 530,177-183,2016)，其中精神分裂症患者脑部C4A的含量升高，C4存在于神经元中的突触部位，而清除C4则会降低突出剪切的比例。这表明引起C4表达上调的基因突变也许导致了过量的突触剪切，从而导致了精神分裂症。　　第二项研究是由Stanley Center的研究人员发现：补体信号和吞噬性小神经胶质细胞与阿尔兹海默症早期的突触缺失相关(Science 352,712-716,2016)，他们发现补体C1q的上调会激活吞噬性小神经胶质细胞，最终导致突触被清除。　　第三项来自加尼福利亚大学旧金山分校的研究(Cell 165, 921–935, 2016)表明在神经退行性疾病额颞叶痴呆小鼠模型中，C1qa会促进小神经胶质细胞依赖的突触清除。　　这些研究共同表明了补体介导的突触清除在一系列神经退行性疾病及精神紊乱中发挥重要作用。

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Argonaute 蛋白的特点是高效的指导 DNA/RNA 定向结合目标核酸。 2022年2月22日，河北科技大学韩春雨团队在预印版bioRxiv 在线发表未经同行评审的题为“Introducing an argonaute-facilitated PCR platform”的研究论文，该研究设计了一个 argonaute 促进的 PCR 平台，利用源自 Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo) ，该平台不携带核酸酶活性并在结合时暴露引导 DNA 的 3' 端。 MejAgo-PCR 平台的每个反应循环都由变性步骤和聚合酶介导的延伸步骤组成，省略了传统 PCR 所需的退火步骤。更重要的是，MejAgo-PCR 可以显著提高 PCR 在模板检测中的灵敏度，这是由于向导 DNA/引物和模板之间的 argonaute 促进配对。因此，argonaute 促进的 PCR 具有发展为具有更高灵敏度和效率的PCR 平台的潜力。另外，2022年1月21日，河北科技大学韩春雨团队在Nucleic Acids Research（IF=17）在线发表题为“A Cas6-based RNA tracking platform functioning in a fluorescence-activation mode ”的研究论文，该研究利用这一特性设计了一个基于 Cas6 的开关平台，用于在体内检测目标 RNA。将split-Venus片段与内切核糖核酸酶突变的大肠杆菌 Cas6 (dEcCas6) 的两端结合，允许配体 (CBS) 激活分split-Venus互补。该研究将此平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)。在活细胞中，Cas6FC 可以检测几乎没有背景噪声的目标 RNA。此外，只要在感兴趣的 RNA 中标记一个 CBS (29nt) 副本，就能够打开 Cas6FC 荧光，这大大降低了目标 RNA 构象和定位的潜在改变的可能性。因此，该研究开发了一种新的 RNA 跟踪平台，其固有地具有高灵敏度和特异性聚合酶链式反应（PCR）的发明极大推进了现代生物学研究。此外，鉴于测试追踪和隔离策略 (TETRIS/TTI) 是迄今为止控制传染病的最有效方法，PCR 已广泛用于医疗保健服务。一个明显的例子是在当前 COVID-19 大流行中使用 PCR 检测受感染但无症状的个体。尽管出现了许多核酸检测新技术，但世界卫生组织建议，基于定量 PCR (qPCR) 的检测平台仍被认为是 COVID-19 检测的黄金标准。核酸扩增是包括传统PCR在内的所有已开发的核酸检测系统的基础。也不例外，最近开发的SHERLOCK系统利用了重组酶-聚合酶扩增 (RPA)。因此，某个检测系统的灵敏度取决于其依赖扩增策略的灵敏度。从这个意义上说，虽然 SHERLOCK 系统具有混杂 RNAse 活性的“附带效应”，但最初的 RPA 促进的扩增决定了随后的 Cas13a 介导的二级信号放大的可靠性。因此，如果目标模板的滴度低于 RPA 灵敏度的阈值，则 SHERLOCK 声称的优势是不存在的。传统的 PCR 是一种异热反应，使用重复的加热和冷却循环来复制特定区域的 DNA。相比之下，等温扩增发生在稳定的温度下，这显然具有无需设备、省时和便携的许多优点。RPA 促进的 PCR 是一种等温反应，其中 UvsX 重组酶携带引物并促进其与双链 DNA (dsDNA) 模板的配对。RPA 采用重组酶-引物复合物扫描双链 DNA 并促进同源位点的链交换，省去了传统 PCR 所需的高温变性过程，从而可以进行等温扩增。然而，RPA 平台还需要单链 DNA 结合蛋白，该蛋白相互作用并防止移位的模板链通过分支迁移弹出引物。此外，重组酶反应需要 ATP 的存在用于能量输入。此外，重组是一个复杂的过程，其机制尚未完全解决。因此，对于用于 RPA 平台的引物的优化，尚未建立明确的规则。因此，在应用RPA时，不可避免地需要额外的引物筛选过程，这显然是费力的。无论扩增过程是异温还是等温，引物与模板的结合是扩增的第一步，结合的效果决定了后续扩增的灵敏度。传统PCR的引物-模板配对过程完全依赖于引物和模板之间的随机物理相互作用。在这种依赖热力学定律的系统中，增加引物浓度肯定会提高与模板配对的效率。然而，由于引物之间以及引物和模板之间的非特异性错配，必须考虑对准确性的权衡影响。Argonaute 蛋白可以高效地引导 DNA/RNA 定向结合到靶核酸。对argonaute促进靶向机制的研究表明，argonaute蛋白可以加速引导与靶核酸的结合。在这项研究中，证明了源自Mesorhizobium japonicum的 argonaute (MejAgo) 可用于增强引物-模板配对。借助此功能，MejAgo 促进的 PCR 系统可以提高核酸检测的灵敏度。参考消息：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.02.22.481407v1

CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心（UKE）干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章，建立了称为LATE（长期不良治疗效果鉴定检测）的新型检测方法，该方法使用Stilla naica微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件，且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响，并可在单细胞层面进行评估。为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响，研究人员进行了小规模的原理验证实验：明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势，这是主要的致瘤性标志之一，因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验，并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中，通过“LATE”方法重复检测到低频(0.5%)生长促进事件，这一结果证明了即使在低起始细胞数的情况下，LATE检测也具有高灵敏度，并且可以对单个细胞进行评估。图 1. LATE检测原理LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF)，(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周，(3)读取结果，随着转导细胞数量的增加，作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势在这一过程中，“LATE”读取到的阳性结果（获得生长优势的细胞）会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起，或者是序列存在其他的突变，例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系，研究人员设计了GEF-dPCR（gene-editing frequency digital PCR）实验，即Drop-Off分析方法，该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率，数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率，由GEF-dPCR测量获得。对于TP53 gRNA结合位点的检测，GEF-dPCR使用两个双标记水解探针，一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合，易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针（图2A）。文中使用Stilla naica微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测，实验方法详见原文第12页。随后进行Stilla naica微滴芯片数字PCR系统检测，结果显示随着时间的推移，TP53插入缺失的频率随之增加，转导后第7天插入缺失率为1%–22%，在52天后达到44%–85%的峰值，该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。（图2B）研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测（图2C）。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致，从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应，但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。随后，作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体，并且可以扩展用于其他细胞类型，尤其是高度相关的原代hMSC。因此，“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。图3：LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞综上，“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段，用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响，辅助临床前的安全性研究，是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充，特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004期刊介绍：《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊，是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展，影响因子为6.698。