当前位置: 仪器信息网 > 行业主题 > >

核酸酶

仪器信息网核酸酶专题为您提供2024年最新核酸酶价格报价、厂家品牌的相关信息， 包括核酸酶参数、型号等，不管是国产，还是进口品牌的核酸酶您都可以在这里找到。 除此之外，仪器信息网还免费为您整合核酸酶相关的耗材配件、试剂标物，还有核酸酶相关的最新资讯、资料，以及核酸酶相关的解决方案。

核酸酶相关的论坛

  • 全能核酸酶SuperNucleaseFAQ详解：解开核酸酶的神秘面纱

    [font=宋体][font=宋体]全能核酸酶（[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]）是一种来自于粘质沙雷氏菌（[/font][font=Calibri]Serratia marcescens[/font][font=宋体]），经基因工程改造的核酸内切酶。可降解双链、单链、线状、环状的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]，完全将核酸降解成[/font][font=Calibri]3~5[/font][font=宋体]个碱基长度的[/font][font=Calibri]5'-[/font][font=宋体]单磷酸寡核苷酸。义翘神州不仅可以提供研究级核酸酶，依托于[/font][font=Calibri]ISO 13485[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]体系，还可提供高效、高质量、应用广的[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级别全能核酸酶。同时我们提供核酸酶残留检测试剂盒，在解决生物制品核酸污染的同时，有效降低酶本身的残留风险。下面通过问答形式向大家详解全能核酸酶：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 如何处理粘附细胞？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 用[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]洗涤后，向[/font][font=Calibri]100μL RIPA[/font][font=宋体]裂解物（或其他哺乳动物细胞裂解物）中加入[/font][font=Calibri]1-5μL[/font][font=宋体]全能核酸酶，在室温下孵育[/font][font=Calibri]30min[/font][font=宋体]，收集裂解物，离心上清液进行下游实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 如何处理悬浮细胞？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 离心收集悬浮细胞后，将[/font][font=Calibri]100μL RIPA[/font][font=宋体]裂解物（或其他哺乳动物细胞裂解物）加入含有[/font][font=Calibri]1-5μL[/font][font=宋体]全能核酸酶的离心管中，在室温下孵育[/font][font=Calibri]30min[/font][font=宋体]，收集裂解物，离心上清液进行下游实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 如何处组织样本呢？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 研磨[/font][font=Calibri]30[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]100mg[/font][font=宋体]动植物组织后，加入[/font][font=Calibri]100[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]200μL[/font][font=宋体]裂解液和[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]5μL[/font][font=宋体]全能核酸酶，室温孵育[/font][font=Calibri]30min[/font][font=宋体]，收集裂解液并离心上清液进行下游实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 大肠杆菌或其他细菌呢？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 离心收集细菌后，裂解液或研磨破碎后，每[/font][font=Calibri]100μL[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]1~5μL[/font][font=宋体]全能核酸酶，室温孵育[/font][font=Calibri]30min[/font][font=宋体]，收集裂解液，离心上清液进行下游实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 如何稀释[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 正常推荐稀释比（终浓度）为[/font][font=Calibri]1:1000[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]1:20000[/font][font=宋体]，其中时间、温度和稀释比是影响反应的积极因素。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 是否用[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]稀释[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 是[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 你能减少剂量吗[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 如果你想减少剂量，可以适当提高反应温度或延长反应时间[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 反应辅因子[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 必须向反应溶液中加入[/font][font=Calibri]2-5mM Mg2+[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 反应缓冲液[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 常用的生物缓冲液，如[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MOPS[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]pH6-8[/font][font=宋体]）等[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 稀释后每次使用多少？如何测试梯度？一开始多少钱？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 根据不同的实验要求，添加量可以在[/font][font=Calibri]1/100[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]1/10000[/font][font=宋体]之间。真核细胞所需的量高于原核细胞，因为真核细胞的核酸含量高，并且可以按照[/font][font=Calibri]1/1000[/font][font=宋体]的比例添加真核细胞初始添加量，可以按照[/font][font=Calibri]1/10000[/font][font=宋体]的比例添加原核细胞。由于全能核酸酶活性在室温下较高，因此在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下消化的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]添加比例高于室温下。普通的[/font][font=Calibri]CoIP[/font][font=宋体]实验、蛋白质表达实验可以适当地略微增加，并且可以按照[/font][font=Calibri]1/100[/font][font=宋体]的比例添加对[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]残基要求高的实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 如何灭活全能核酸酶？如何移除？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： [/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]螯合金属离子的使用可以可逆地抑制全能核酸酶的活性，极端条件下可以引起不可逆的失活，如[/font][font=Calibri]100mM NaOH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]℃处理[/font][font=Calibri]30min[/font][font=宋体]。可以通过阴离子交换柱或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相色谱[/color][/url]法从目标产物中分离全能核酸酶。由于这种核酸内切酶的高稳定性，建议不要在最终产物需要排除核酸酶的应用中使用全能核酸内切酶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 储存条件[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： 储存温度为[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃。储存缓冲液：[/font][font=Calibri]20mM Tris-HCl pH 8.0[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]50mM NaCl[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]2mM MgCl2[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]甘油。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q[/font][font=宋体]： 全能核酸酶应用[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]A[/font][font=宋体]： [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、蛋白质提取过程中核酸污染的去除：当重组蛋白质纯化或哺乳动物细胞裂解物下游需要低粘度时，全能核酸酶可用于降低样品粘度，以便于操作；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、有效减少储存的外周血单个细胞（[/font][font=Calibri]PBMC[/font][font=宋体]）的聚集；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、有利于不溶性蛋白在复性前的高质量包合体系制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、有效去除带负电荷核酸对双向[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]蛋白样品的影响；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、在宽范围的条件下（[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]尿素、[/font][font=Calibri]0.1M[/font][font=宋体]盐酸胍、[/font][font=Calibri]0.4%Triton X100[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]0.1%SDS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1mM EDTA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1mM PMSF[/font][font=宋体]），降解所有形式的（双链、单链、线性、环状）[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、根据美国食品药品监督管理局的核酸污染去除程序，去除蛋白质产品中的污染；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、本品可与多种细胞细菌裂解液配合使用，去除粗提液中的核酸，降低溶液粘度，提高蛋白质产量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同级别全能核酸酶，[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级条件下生产的[url=https://cn.sinobiological.com/category/supernuclease-kit][b]全能核酸酶[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/category/supernuclease-kit][b]SuperNuclease[/b][/url][/font][font=宋体]，无动物源性，可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]。超高活性，应用场景广泛且使用量低不易残留，质量、性能、供货能力可靠，并已完成在[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]的药物主文件申报备案（[/font][font=Calibri]DMF Number#:35978[/font][font=宋体]），满足药物申报的规范。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/supernuclease-kit[/font][/font][font=Calibri] [/font]

  • 基因组编辑工具新星---转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)

    http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201112/2011121813583277.gifTALE第171位Ser删除后的三维构象模型也显现出非常类似的球状结构，图片篇来自Biochemical Journal, 2004, 382: 725-731.2011年6月，位于美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市的生命科技公司(Life Technologies)获得美国伊利诺斯州埃文斯顿市双刀片基金会(Two Blades Foundation)和德国哈雷市马丁-路德大学一组植物学家的独占性许可以便对一种新的基因组编辑技术---转录激活子样效应因子(transcription activator like effector, TALE)进行商业化生产。随着生命科技公司新获得的许可，研究人员可能很快能够从几个设计物TALE商业来源中进行选择。而2011年1月，美国明尼苏达大学和爱荷华州立大学开发的类似技术已被许可给法国公司Cellectis，而且该公司已经提供定制的基因特异性的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)。与此同时，几个研究小组就像学术界之前对ZFN那样正在建立大众都可获取的TALEN来源。当然，现在预测利用只在2007年发现的TALE进行基因组编译的最终影响仍嫌过早。相反，ZFN技术开发了将近15年，并且已经正在人临床试验中进行测试。但是这两种技术的差别是显而易见的。不同于ZFN---该技术的知识产权是由Sangamo生物技术公司和它的商业伙伴Sigma-Aldrich所有，TALE的使用、成本和可获得性则是完全不同的情形。TALEs首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的，特异性地结合到DNA，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。

  • 义翘神州核酸高效清除解决方案及FAQ

    [font=宋体][font=宋体]随着生物医药领域的发展，生物制品（治疗性抗体药物、疫苗等）需求日益庞大。生物制品和生物技术药物在生产过程中通常使用到工程细胞（菌），可能会造成外源性核酸残留（如宿主的），存在致瘤、感染、干扰代谢等潜在安全风险。我国参照[/font][font=Calibri]WHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]和欧盟标准，在药典中对生物制品的核酸残留量有明确规定。生物制品的核酸残留主要集中在重组蛋白、抗体及疫苗的大规模纯化及生产过程。药典规定要求酵母、大肠杆菌表达的生物制品中[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]残留量不超过[/font][font=Calibri]10ng/[/font][font=宋体]剂，[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Vero[/font][font=宋体]细胞表达的狂犬疫苗、[/font][font=Calibri]EPO[/font][font=宋体]、乙肝疫苗等不超过[/font][font=Calibri]100[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]10pg/[/font][font=宋体]剂。因此控制这些产品中外源性核酸的残留就显得极为重要。而外源性核酸残留的控制，会对生产工艺、规模放大、生产效率等产生一定程度的制约，那么如何能够二者兼得呢？全能核酸酶在生物制品宿主核酸残留方面具有一定的优势。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/supernuclease-kit][b]全能核酸酶[/b][/url]（[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]）是一种来自于粘质沙雷氏菌（[/font][font=Calibri]Serratia marcescens[/font][font=宋体]），经基因工程改造的核酸内切酶。可降解双链、单链、线状、环状的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]，完全将核酸降解成[/font][font=Calibri]3~5[/font][font=宋体]个碱基长度的[/font][font=Calibri]5'-[/font][font=宋体]单磷酸寡核苷酸。义翘神州不仅可以提供研究级核酸酶，依托于[/font][font=Calibri]ISO 13485[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]体系，还可提供高效、高质量、应用广的[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级别全能核酸酶。同时我们提供核酸酶残留检测试剂盒，在解决生物制品核酸污染的同时，有效降低酶本身的残留风险。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供不同级别全能核酸酶[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级条件下生产的全能核酸酶[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]，无动物源性，可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]。超高活性，应用场景广泛且使用量低不易残留，质量、性能、供货能力可靠，并已完成在[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]的药物主文件申报备案（[/font][font=Calibri]DMF Number#:35978[/font][font=宋体]），满足药物申报的规范。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]应用场景：[/font][font=宋体]①去除疫苗、重组蛋白等生物制品中的外源性核酸。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②降低大分子样本制备过程中因核酸引起的粘度问题。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③去除病毒等颗粒表面的核酸，利于病毒颗粒的纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④用于预防细胞结团。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]核酸高效清除解决方案常见问题[/font][font=Calibri]FAQ[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①哪些因素会影响[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]的消化效果？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]酶的添加量，反应条件（例如：时间、温度、[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值），缓冲环境（例如：是否存在酶的抑制剂）等。不同样本的最佳使用量，需要经过实验摸索。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②哪些条件会抑制[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]的活性？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]可在较宽条件下保持活性，二价阳离子（[/font][font=Calibri]Mg2+[/font][font=宋体]）对其活性至关重要。当在含有以下物质的体系中， [/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]的活性会受到抑制：[/font][font=Calibri] 300 mM[/font][font=宋体]一价阳离子，[/font][font=Calibri] 100 mM[/font][font=宋体]磷酸盐，[/font][font=Calibri] 100 mM[/font][font=宋体]盐酸胍， [/font][font=Calibri] 100 mM[/font][font=宋体]硫酸铵等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③如何去除[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]使用常规色谱法，如亲和色谱法和离子交换色谱法，可以很容易地去除[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]。其他方便的纯化方法，如切向流过滤（[/font][font=Calibri]TFF[/font][font=宋体]）也适用于从生物制品中去[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④如何灭活[/font][font=Calibri]SuperNuclease[/font][font=宋体]？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]采用[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]螯合金属离子会可逆地抑制全能核酸酶活性，极端条件会造成不可逆失活，例如[/font][font=Calibri]100 mM NaOH[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]℃处理[/font][font=Calibri]30[/font][font=宋体]分钟等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤[/font][font=Calibri]KIT-SSNP01[/font][font=宋体]是否可以用于其他品牌全能核酸酶残留检测？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]实验数据显示[/font][font=Calibri]KIT-SSNP01[/font][font=宋体]可检测主流进口品牌全能核酸酶产品。但由于各个公司的全能核酸酶可能在序列及工艺方面存在差异，建议进行实验验证确认后再使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情就可以参看：[/font][font=Calibri]http[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]s[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]://cn.sinobiological.com/category/supernuclease-kit[/font][/font][font=Calibri] [/font]

  • 【转帖】蛋白水解酶配制

    【转帖】蛋白水解酶配制

    [img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/12/200812230812_125660_1643419_3.jpg[/img]a：链霉蛋白酶是从链球菌（streptomyces griseus）中分离到的一种丝氨酸酶和酸性蛋白酶的混合物。b：自消化可消除dna酶和rna酶的污染，经自消化的链酶蛋白酶的配制方法如下：把该酶的粉末溶解于10mmol./l trishcl(ph7.5)、10mmol/l nacl中，配成20mg/ml浓度，于37℃温育1h。经消化的链霉蛋白酶分装成小份放在密封试管中，保存-20℃。c：蛋白酶k是一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中纯化得到。该酶有两个ca[sup]2[/sup] 结合位点，它们离酶的活性中心有一定距离，与催化机理并无直接关系。然而，如果从该酶中除去ca[sup]2[/sup] ，由于出现远程的结构变化，催化活性将丧失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情况下污染酸制品的蛋白质。所以，蛋白酶k消化过程中通常加入edta（以抑制依赖于mg[sup]2[/sup] 的核酸酶的作用）。但是，如果要消化对蛋白酶k具有较强耐性的蛋白，如角蛋白一类，则可能需要使用含有1mmol/l ca[sup]2[/sup] 而不含edta的缓冲液。在消化完毕后、纯化核酸前要加入egt（ph8.0）至终浓度为2mmol/l,以鳌合ca[sup]2[/sup] 。

  • 【分享】PCR和RT-PCR基础大全（四）

    【分享】PCR和RT-PCR基础大全（四）

    第七章 提高忠实性带有校正功能的酶 包括克隆和效率分析，PCR产物表达或定点突变在内的PCR应用都需要高忠实性的PCR。Taq DNA聚合酶被看做是低忠实性的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。PlatinumPfx DNA聚合酶明显比Taq DNA聚合酶忠实性高，而且带有Platinum产品产量和特异性高的优点（图25）。 图25. Platinum® Pfx Taq DNA聚合酶的高灵敏度和特异性使用人thrombospondin的1.1kb片段的探针对基因组DNA（泳道1到6分别为100，50，10，5，1和0ng）扩增35个循环。A组，使用1单位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组，使用2.5单PfuTurbo™ DNA聚合酶，在冰上配制反应液。C组，使用1单位Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液。酶混合物 将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。Gibco BRL高保真酶混合物，PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity忠实性是单独TaqDNA聚合酶的6倍，并可以最高扩增到12kb。 其他参数 除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度。如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。第八章 其他需要考虑的事情扩增长目的片段 当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（参见第十三章，PCR聚合酶的比较和图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3'-5'外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。 除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用[font=Times New Ro

  • 【分享】生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用

    【分享】生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用

    生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用项目完成人：桑志红 蔡 耘项目完成单位：国家生物医学分析中心 随着人们对糖蛋白参与生命活动机理的日益深入了解，对天然糖蛋白及重组糖蛋白类药物的分析越来越受到重视。重组糖蛋白类药物的质量控制更是直接关系到药物的疗效及至人类的健康。九十年代以来，随着带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和纳升电喷雾串联质谱（nano-ESI-Q-TOF）等具有软电离方式的现代质谱 技术的发展，质谱以其高灵敏度和强有力的分析混合物的能力，提供了生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等方面的信息，使糖基化分析有了重要的进展。 通常研究糖蛋白的方法是把蛋白链上的寡糖切下来，分别研究蛋白部分和寡糖部分的结构，因此无法研究与两部分共同相关的结构问题，也不能区分不同糖基化位点上切下来的寡糖。自90年代初，国外有人开始用质谱法研究糖蛋白的结构，同时描述了各个位点的不均一性。我们用建立的现代生物质谱技术研究糖蛋白一级结构的方法，将其应用与基因重组糖蛋白的结构分析。为糖蛋白结构分析及基因重组糖蛋白类药物的质量控制提供新的手段。一、 生物质谱研究糖蛋白结构方法的建立实验所用仪器为：1.德国BRUKER 公司的REFLEXIII型基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪，N2激光器，波长337nm，线性飞行距离150cm，加速电压2kv。2.英国Micromass 公司Q-TOF型电喷雾串联质谱仪。源温80°C，气体流速40L/h，枪头电压650V，检测频率2.4S，氩气碰撞池压力6*10-5mbar。1. 基质的选择，在MALDI-TOF-MS分析中，基质起着相当重要的作用。不同的基质对不同类的物质响应不同，a-氰基-4-羟基肉桂酸用于测定糖蛋白核糖核酸酶B效果相对较好。2. 糖蛋白分子量的测定，糖蛋白核糖核酸酶B由124个氨基酸组成，在34位Asn处连有一个高甘露糖型N-糖链。由于糖链的微不均一性，与普通蛋白质及核酸不同，其分子离子峰在MALDI-TOF-MS 质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个糖基。正是由于这种微不均一性，使得其分子离子峰变宽，灵敏度降低。糖链分子量越大，峰越宽，灵敏度越低，所以一般只有糖链较短，蛋白的质量不太大的糖蛋白才能测定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接测定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量为 15208.6Da。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/03/201103211511_284179_1604317_3.jpg3. 糖含量的测定，采用O聚糖酶及内糖苷键酶F分别作用于核糖核酸酶 B，只有内糖苷键酶F能够是其分子量发生变化，表明核糖核酸酶B分子中不存在O-连接糖链存在着N-连接糖链。内糖苷键酶F切断N-糖链五糖核心最内侧的GlcNAc-GlcNAc糖苷键，得到含一个GlcNAc的肽链，减去GlcNAc，可以计算出准确的肽链分子量T=13695.6，与糖蛋白平均分子量之差为糖链的平均分子量G=1513.4，平均糖含量为：(糖链大小/糖蛋白分子量)×100%=9.95%。4. 糖基化位点的确定，研究糖基化类型及糖基化位点的策略：采用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法，通过酶切前后含糖肽片的位移，结合网上数据库检索，可以确定糖基化类型和糖基化位点。以不同类型的糖苷内切酶作用于糖蛋白（N-糖苷键酶或O-糖苷键酶），在MALDITOF-MS 上观察其质量的变化，可以直接确定糖蛋白中是否含有响应类型的糖链，这是我们确定糖蛋白中糖苷键类型的基础。我们采用先将核糖核酸酶B还原烷基化，加Glu-C酶切，产物再用内糖苷肩酶F酶切，可观察到含糖肽段出现位移，将核糖核酸酶B的肽质量指纹图进行数据库检索，证实发生位移的肽段中含有N-糖链特异连接位点，由此确定34位Asn为糖基化位点。另外我们采用内糖苷键酶F及肽-N-聚糖酶F两种酶进行差位酶切法对含糖肽段进行验证，两种酶酶切后分子离子峰的差值除以GlcNAc的质量，结果就是N-糖基化位点的个数5. 质谱测定氨基酸序列， 我们对核糖核酸酶B肽质量指纹谱中的含糖肽段进行了串联质谱测定，首先在一级质谱图中选择离子4972.23，在串联质谱的碰撞活化室以氩气与其碰撞产生碎片，从碎片的质荷比推算出此肽片中的一段氨基酸序列，检索结果为核糖核酸酶B，从而判断其理论序列是否一致。6. 糖链结构的研究，凝集素对糖肽的亲和提取，进一步分析糖肽序列及糖链结构的关键是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖链为高甘露糖型，我们选用对其有特异性吸附的伴刀豆球蛋白对其进行提取利用这种简捷的亲和质谱的方法，对糖肽段进行了分析。建立了亲和质谱分析糖肽类物质的方法，为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基础。二、基因重组糖蛋白人促红细胞生成素（rhEPO）的结构分析。 利用以上建立的方法，我们对样品重组人促红细胞生成素进行了分析，断定此样品为非完全糖基化，样品中只存在N-连接的糖链，无O-糖链。应用酶切法用肽-N-聚糖酶处理后，得到两个含糖肽段，进行数据库检索，测得38位及83位为N-糖基化位点，与文献报道相符，结果可靠。因此，该项课

  • 核酸抽提经验及原理

    1、核酸抽提原理 简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。 最常用的纯化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。2、了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。 绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。3、裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质“缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。有些样品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质)，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。 含 CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。 SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C静置一段时间以及采用 4C 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒(50 kb 以上)，该方法可能会有问题。 PCR模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性)比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。 选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 组织或者 C个细胞；我的建议是，你的样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率)没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。4、纯化方法 评价 PC 抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC抽提都会损失一部分核酸(因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。 PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀 –此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可

  • 【求助】如何用质谱检测RNA甲基化

    我准备分离小RNA，然后用核酸酶将其切成单个核苷酸，ESI质谱，首先先来检测是否有甲基化修饰的核酸，不知道这样行不行。如果行的话，对样品的纯度浓度有什么要求，希望各位有经验的大侠多多指点。先谢过了

  • 【06年】细菌DNA的提取

    细菌DNA的提取2006-10-24 17:19这里提供的是由Marmur于1961年建立，经Dale等人简化和发展，此方法略加修改后可用于其他细菌种类。主要原理是：采用去垢剂破碎细菌细胞，酚－氯仿萃取蛋白，使用核糖核酸酶和蛋白酶K进行进一步的纯化，所提取的DNA无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子克隆。⑴材料①20倍SSC缓冲液：3mol/l NaCl; 0.3mol/l 醋酸钠；pH 7.0(高压灭菌后，4摄氏度保存可长期使用)②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/L pH 8.0Tris 缓冲液抽提，再用0.1mol/L pH 8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH 7.5)15mmol/L Nacl 溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。④蛋白酶K ⑤TES缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, pH 8.0; 10mmol/L NaCl;1mmol/l EDTA⑵方法①取单菌落接种于5mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用试管）②将上述菌液接种于200mlLB培养液中，37℃振荡培养过夜。（使用500ml或1000ml三角瓶）③离心，收集沉淀（5000r/m,10分钟）④将沉淀悬浮于20ml 20倍SSC缓冲液中，混匀。⑤加入200mg SDS，室温下振荡过夜，使细菌细胞充分裂解，裂解液呈粘稠状⑥加入等体积的酚/氯仿溶液，温和地混匀，细心地回收上层水相（注意不要触及二相之界面），重复萃取三次⑦加入2倍体积无水乙醇，此时可见到絮状DNA沉淀或用玻璃棒绕取收集⑧将DNA溶于15ml 2倍SSC溶液中，加入核糖核酸酶（最终浓度50ug/ml），37℃保温1小时⑨加入蛋白酶K（50ug/ml）,继续保温1小时⑩加入等体积苯酚萃取一次，在回收的水相中加入2.5倍体积的无水乙醇，－20℃静止过夜25000g，4℃，离心15分钟，收集沉淀，用－20℃无水乙醇洗涤一次；将DNA在真空干燥器中抽干，溶于10mlTES缓冲液中，4℃保存备用。⑶说明①本方法可用于其他种类细菌，但是溶菌条件需略加修改，对革兰氏阳性菌（如葡萄球菌），在SDS处理前需要使用溶菌酶裂解细胞壁，对于另外一些细菌（如分枝杆菌），在加入SDS后，将溶液加温至65℃是可取的。②一些种类的细菌含大量核酸酶，去垢剂不能完全抑制其活性，用TES缓冲液代替SSC缓冲液可通过EDTA的作用抑制核酸酶活性，必须注意的是，TES缓冲液离子强度较低，在加入乙醇之前需用醋酸钠调节DNA溶液的离子强度（醋酸钠的最终浓度为0.3mol/L）③DNA溶液中残留少量酚和氯仿，可在乙醇沉淀之前用水饱和乙醚萃取去除④比较纯净的DNA溶液的Ａ260/A280及A260/A235大于1.7

  • 关于革兰氏阳性细菌的转化

    【关键词】中检所对照品目录 药检所标准物质 标准物质网站 中华标准物质网 内容摘要：双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。 一、革兰氏阳性细菌，转化过程的几个阶段： 1.细菌感受态的形成 由于分泌一种称为感受态因子的小蛋白而导致细菌感受态的形成。 2.转化因子的吸收 双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合，并激活临近的核酸酶。DNA双链中的一条单链逐步降解，同时另一条单链逐步进入细胞。 3.整合复合物前体的形成 一种特殊蛋白与单链DNA结合，有效保护单链DNA免遭核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。 4.单链DNA转化因子的整合 转化DNA单链可以通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区，形成异源杂合双链DNA结构。 5.转化子的形成 受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦半保留复制，当细胞分裂后，此染色体发生分离，于是新形成一个转化子。 二、影响转化的因素 1.DNA能否进入细胞； 2.DNA进入细胞后的稳定性； 3.质粒DNA的大小，大质粒的转化效率低于小质粒，到目前，大于30kb的质粒，转化效率仍很低； 4.DNA的浓度、纯度和形状； 5.诱导感受态细菌所用的离子的种类和浓度； 6.热休克时间的长短及平板培养条件等。 本文参考了 国家标准物质网

  • 核酸提取仪的工作原理

    核酸提取(核酸的分离与纯化)主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开,但在分离核酸时,应保证核酸分子一级结构的完整性,并排除其他分子污染。核酸提取方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤,而每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。操作过程中首先通过物理、化学或酶解作用裂解细胞,使核酸释放出来,并去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂肪类等生物大分子的过程。在此基础上,沉淀核酸、去除盐类和有机试剂等杂质,从而得到纯化的核酸。核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸的提取工作的仪器。在传统的手工核酸提取过程中通常采用离心澄清的方法，操作时费时费力。近年来,出现了磁珠分离技术，利用磁珠在一定条件下对核酸具有很强亲和力的特点，吸附核酸。当条件改变时，磁珠又可以与其吸附的核酸分离,从而得到纯化的核酸。这种方法简便、高效、易于操作，是目前核酸提取仪采用的主要方法。具体来说，磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。磁珠法不需要离心、不需要加入多种试剂，操作简单，符合核酸自动化提取要求，是未来核酸纯化方法发展的一个重要方向。

  • 核酸抽提的基础：仅供献身分子生物学研究者参考

    近日打了一个关于核酸抽提的基础现状的草稿；没有去找参考书润色，所以会有点凌乱。首先声明的是：这篇东西只为有一定核酸抽提基础知识的人准备，同时也将会及时修改 (我突然发现了 edit 的功能)。那些分子生物学的过客，最好不要看本文；一是我的思维有点跳跃，二则是没有必要糟蹋自己的时间。写这篇东西的另外一个原因是，我一直在思考如何简化经典的无介质的核酸抽提程序。最经典的是裂解一步，去蛋白质一步，核酸沉淀一步； DNAzol 将这三步并成了一步，按道理已经简化到了极致。事实是，DNAzol 并没有被大家认可，其原因大概还是质量不太可靠吧。现在也有使用 Proteinase K 消化后直接沉淀核酸的方法，三步简化成了两步，可我总觉得醇的沉淀不可能彻底去除 Proteinase K。明年大概还没有生物学的诺贝尔奖会花落中国的，那么先求得一个核酸抽提最简单的非介质方法世界领先如何？一笑！也一定。================================================1：核酸抽提原理简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 2：了解你的实验样品如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始量去抽提鸟血的基因组 DNA，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了解，才能正确选择裂解方法。绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C 保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选择。3：裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是，如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势，则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质的形式被去除，导致 DNA 的损失。有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时。控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法，是抽提 RNA 的首选。总 RNA 的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，至于与基因组 DNA 相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质 “缠”住的问题，因为都不会对以后的纯化产生大的影响，可以不考虑。高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的 RNA 酶，从而确保了 RNA 的完整性。除了极少量不适用该方法的样品 – 主要是植物，其它绝大部分样品的 RNA 的抽提，都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。该方法也可用于基因组 DNA 抽提，非常快速简单，但纯度不是很高。含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB 的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的 CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB 的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用 65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C 静置一段时间以及采用 4C 离心去蛋白质，都可以提高质量。该方法不一定要使用 PC 纯化，但结合 PC 纯化，可以获得纯度很高的质粒。RNA 的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在最后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml) 来实现。总的感觉是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的残留少一些。不过，经典沉淀几乎没有办法彻底去除 RNA 残留。另外，对大质粒 (50 kb 以上)，该方法可能会有问题。PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。也正因为不纯化，所以，假阴性 (即没有扩增出来的阳性) 比例也比较高。该方法最简单的裂解液就是水，复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的 PCR 反应，而且能提高裂解效率，甚至还可能部分消除样品内抑制 PCR 反应杂质的东西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再复杂一点的就会含有诸如 Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质。操作也非常简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品，但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。降低样品使用量可以提高阳性率，因为样品量的降低，同时意味着 PCR 的抑制物量的降低。选择了合适的裂解液，下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。这个问题非常重要，但却没有获得足够的重视。严肃的参考资料，都应该会提供一个简单的比例，如 1ml 裂解液可以用于 T mg 组织或者 C 个细胞；我的建议是，你的样品量绝对要小于资料所提供的。起始样品用多大，并没有具体的说法。如果不是样品量有限，则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量，作为决定样品起始量的基础，会比较合理的。不要因为 1ml 裂解液可以抽提 100mg 样品，就一定使用 100mg 样品。裂解液的用量，表面上与抽提的结果 (纯度及得率) 没有关系，然而，在实际操作中，对结果是有比较大的影响的。裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。

  • 【求助】求助中文文献

    【序号】：1 【作者】：姜忠义陈洪钫【题名】：酶膜反应－萃取耦合过程传质特性的研究【期刊】：第六届全国生物化工学术会议论文集 【年、卷、期、起止页码】：1995年05月29日 【全文链接】： 【序号】： 2【作者】：姜忠义 【题名】：酶膜反应-萃取器的研究 【期刊】： 【年、卷、期、起止页码】： 1994【全文链接】： 【序号】： 3【作者】：陈洁 【题名】：麦芽根中核酸酶的性质研究及其在酵母抽提物中的应用【期刊】： 【年、卷、期、起止页码】：2000 【全文链接】： 【序号】：4 【作者】：张群【题名】：麦芽根中5'-磷酸二酯酶提取和纯化 【期刊】： 【年、卷、期、起止页码】： 2008【全文链接】： 【序号】： 5【作者】：李德莹【题名】：应用5′-磷酸二酯酶酶法生产5′-[color=bla

  • 一些蛋白质的分子量与Stokes半径

    一些蛋白质的分子量与Stokes半径：蛋白质 分子量（kD）Stokes半径（nm）乳清蛋白 12.4 2.01核糖核酸酶 13.7 1.92肌红蛋白 17.0 2.00大豆胰蛋白酶抑制剂 21.5 2.26碳酸酐酶 31.0 2.35辣根过氧化物歧化酶 40 3.00卵清蛋白 45 2.80血红蛋白（人）64.5 3.08牛血清白蛋白 70 3.65酵母醇脱氢酶 150 4.55血浆铜蓝蛋白 151 4.73谷氨酸脱氢酶 258 6.00甲状腺球蛋白 670 8.25芜菁花叶病毒 3500 ~12.0

  • CAR-T细胞制备-慢病毒包装包含哪些？

    [font=宋体][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞基因转导具有一定的挑战性，慢病毒载体、逆转录病毒载体、转座子和 [/font][font=Calibri]mRNA [/font][font=宋体]电穿孔技术是较为常见的转导方法，这些技术的进步赋予 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞新的生命力，实现了[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]对靶细胞高、精、准的持久杀伤，极大地提高了肿瘤特异性 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞的临床治疗效果。慢病毒载体（[/font][font=Calibri]Lentivirus[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]LV[/font][font=宋体]）因其宿主范围广、目的基因表达稳定、对哺乳动物细胞具有高感染效率、转基因负荷量更大，可容纳 [/font][font=Calibri]6.5 kb [/font][font=宋体]外源基因且兼具基因毒性更小等优势，成为了[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞构建中最常用的病毒载体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、慢病毒包装相关产品[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒载体是[/font][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞构建中最常用的病毒载体。义翘神州为慢病毒包装过程提供全方位的支持：[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]培养基以及补料液、[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级核酸酶、核酸酶残留检测试剂盒和[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]细胞建库及细胞库检测服务、大规模质粒开发服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①细胞培养基[/font][font=宋体][font=宋体]在慢病毒包装过程中，为了提高慢病毒的安全性，慢病毒载体系统所需的组分被分成三个质粒：[/font][font=Calibri]VGF[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]psPAX2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]pMD2.G[/font][font=宋体]。使用无血清细胞培养基悬浮培养[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞达汇合度[/font][font=Calibri]90%[/font][font=宋体]，将三个质粒共转染到[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞基因组中。宿主基因组在表达时，随宿主基因转录出的目的基因[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]psPAX2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]pMD2.G[/font][font=宋体]基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州经过十多年的研发，开发出一系列无血清细胞培养基产品，可用于[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞悬浮培养和目标分子表达，培养基生产的整个过程严格按照[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]规范进行管理。所有细胞培养基均为即用型，经过数千种蛋白及抗体表达案例的验证，细胞培养基具有蛋白表达量高、细胞生长好、质控严格、批次稳定性好等特点，已经被多个知名实验室用于细胞培养和蛋白表达研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②细胞培养基补料液[/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州开发的细胞培养基补料液[/font][font=Calibri]SMS 293-SUPI[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Cat#: M293-SUPI[/font][font=宋体]）是一种无蛋白，无血清的液体加料液。其仅用于科学研究，不推荐用于人类或动物的诊断和治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③细胞转染试剂[/font][font=宋体][font=宋体]利用重组慢病毒载体将表达[/font] [font=Calibri]CAR [/font][font=宋体]的基因导入并整合到 [/font][font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞中是一种最常用的 [/font][font=Calibri]CAR-T [/font][font=宋体]细胞改造方法。义翘神州拥有高品质的转染试剂 [/font][font=Calibri]Sinofection Transfection Reagent (Cat#: STF02)[/font][font=宋体]，细胞毒性小、重复性高，可用于慢病毒载体的高效转染，转染效率基本可以达到[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、核酸去除及检测相关产品[/b][/font][font=宋体][font=宋体]利用慢病毒进行[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因转导[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞的过程中会产生核酸残留，这些核酸残留物具有潜在的危害性。残留的核酸可能会在人体内造成细胞增殖失控，变为肿瘤细胞。核酸残留可能存在感染性病毒基因，增加体内免疫反应。因此，利用核酸酶进行有效的核酸残留去除，是非常重要的。同时，核酸酶在慢病毒包装过程中同样不能有残留，所以在使用核酸酶去除核酸后，还需要对核酸酶进行清除，并进行检测，确保产品符合生产标准要求。北京义翘神州开发高品质的[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级备案核酸酶（[/font][font=Calibri]Cat#: GMP-SSNP01[/font][font=宋体]），用于去除慢病毒扩增过程中的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]污染。同时，我们还提供高性能配套的核酸酶残留检测试剂盒（[/font][font=Calibri]Cat#: KIT-SSNP01[/font][font=宋体]），可用于检测和定量分析样品中的核酸酶残留量，具有灵敏度高、特异性好、通用性等优点。义翘神州的高质量核酸去除及检测产品为[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因转导解决核酸残留的困扰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级条件下生产的全能核酸酶[/font][font=Calibri]Super Nuclease[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Cat#: GMP-SSNP01[/font][font=宋体]），无动物源性，可高效降解单链、双链、线性、环状、超螺旋等任何形式的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]。超高活性，应用场景广泛且使用量低不易残留，质量、性能、供货能力可靠，并已完成在[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]的药物主文件申报备案（[/font][font=Calibri]DMF Number#:35978[/font][font=宋体]），满足药物申报的规范。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、细胞库检测[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在进行慢病毒包装过程中，需对共转染前的宿主[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞进行微生物安全风险检测。[/font][font=Calibri]HEK293 [/font][font=宋体]细胞的微生物安全风险可能涉及细菌、真菌、支原体、外来病毒等污染。微生物安全问题需要高度关注，因为在生产过程中很容易发生微生物污染，最终导致细胞产品无法净化。义翘神州细胞库检测实验室为生物安全二级实验室，已在北京市备案，且通过[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]认证。该实验室按照[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GLP[/font][font=宋体]质量体系运行，[/font][font=Calibri]B+A[/font][font=宋体]环境，满足无菌检测、分枝杆菌检测环境要求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、慢病毒包装质粒生产[/b][/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒载体是由三个包装质粒和一个表达质粒（也称穿梭质粒）瞬间共转染[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]细胞，通过克隆筛选获得稳定组装表达高滴度慢病毒载体的细胞株，经发酵纯化后获得一定质量要求的慢病毒。慢病毒载体可以将[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达[/font][font=Calibri]CAR[/font][font=宋体]基因的目的。义翘神州能够提供快速、高通量、高品质以及个性化的慢病毒包装质粒制备服务，满足实验室研究人员的小量慢病毒质粒制备需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]例如：质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]制备服务[/font][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州升级改造后的慢病毒质粒制备平台，采用[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级别的生产线，对过程和最终产品的严格管控，确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μ[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别，[/font][font=Calibri]mg[/font][font=宋体]级别至[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别不同规模的科研级质粒生产服务，满足不同的需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[/font][url=https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging][b][font=Calibri]CAR-T[/font][font=宋体]细胞制备[/font][font=Calibri]-[/font][/b][/url][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging][b]慢病毒包装[/b][/url]详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/research/car-t-therapy/lentivirus-packaging[/font][/font][font=宋体] [/font]

  • 核酸站,核酸舱,移动方舱,核酸工作站,核酸检测亭都是核酸亭不同的名字

    核酸站,核酸舱,移动方舱,核酸工作站,核酸检测亭都是核酸亭不同的名字

    [size=18px]创安盛交通生产核酸亭,核酸站,核酸舱,移动方舱,核酸工作站,[b][url=http://www.gongjiaozhanting.com]核酸检测亭[/url][/b],核酸检测站,核酸采样亭,核酸采样站厂家定制。欢迎来到创安盛www.gongjiaozhanting.com来电咨询，让您更好的了解产品。马卡龙般的清新配色、饱满圆润的憨厚外形、舒适安全的封闭舱体,小小的核酸采样亭，不仅为医务人员提供更好的工作环境，也给前来检测的居民带来更多便利。采样亭在疫情之后，还能转换成其他公服设施，继续为城市服务。近日从西城区了解到，新一代核酸采样亭“西城盒子”正式亮相，该批次共有62座“西城盒子”将陆续投放西城区街头。采样亭别出心裁 “城市家具”品质再提升在金融街购物中心一旁的凉爽树荫下，一座浅绿色的“大盒子”静静伫立。开关启动，遮阳板通过电动液压杆缓缓翻开，形成遮阳挡雨的棚架，遮阳板下的操作台，可以摆放多种用具。[img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043079113_5880_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043232695_6623_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043382232_7794_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043507204_2781_5806756_3.jpg!w690x517.jpg[/img][img=,690,625]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/08/202208252043512515_6258_5806756_3.jpg!w690x625.jpg[/img]采样点通过窗口形式提供服务，采样人员每完成一次采样后随即进行消毒。在排队等候区，工作人员指引市民完成核酸码登记，没有核酸码的市民可用身份证进行现场登记。在公园，人民医院新设的便民核酸采样亭前，一些外卖小哥正在等候采样。“以前是要到医院里才能采样，现在在公园里辟出区域进行核酸采样，就不用和就医人员一起了，方便了不少。”外卖小哥说，以往总要等上个十多分钟，现在只要三五分钟就能完成采样。“我们医院也保留了核酸采样窗口，主要服务就医患者，在公园新设的采样点，也是为了方便复工复产人员、外卖骑手和有需求的居民。[/size]

  • 病毒是如何产生的?

    [color=#cc0000][b]到目前为止,人来还没真正研究清楚病毒是如何形成的,当前主要有三种学说,解释病毒的进化。[/b][/color][color=#cc0000][b]一、病毒起源于自主复制的RNA分子 [/b][/color][color=#cc0000][b]核糖核酸（RNA）具有自主复制的信息和能力,并研究发现RNA分子具有酶的催化能力,这促使RNA为病毒的起源学说变得更具说服力。RNA分子至少具备下列可以进行复制和进化三种相关功能:1、核糖核酸酶的活性 2、能自我拼接去掉内部的核酸序列（核酸） 3、有实验表明,以RNA作引物可以合成依赖于模板的多聚胞嘧啶核酸。 [/b][/color][color=#cc0000][b]二、病毒起源于宿主细胞中的DNA或RNA成分的学说 这个学说可以解释所有病毒的起源:DNA病毒起源于质粒或转移因子,反转录病毒起源于反转座子,RNA病毒起源于自主复制的mRNA。 该学说的核发心内容是:病毒是正常的细胞成分获得了自主复制的能力,进化而来的。[/b][/color][color=#cc0000][b]三、退化性起源学说 该学说认为病毒是细胞内寄生物的退化形式。在细胞内,这类寄生物可以在不影响其生存的情况下逐渐丢失部分生物学功能。它们所必需保留的功能是具有可进行自主复制的DNA复制原点（顺式元件）、可以对复制进行调控的反式调控蛋白,以及能与宿主生物合成及复制系统相互作用的顺式和反式功能。最终,就可产生一种专性细胞内寄生的DNA分子或质粒。[/b][/color]

  • 【资料】生物化学习题2

    二、 填空题（每小题2分，20分）1、 人体内最主要的含铁蛋白质是-----------------，正常人血液中含量最多的蛋白质是----------------。2、 磷酸戊糖代谢的主要生理意义是产生---------------和-------------------。3、 肽类激素作用的主要第二信使分子是------------------，它是由---------------酶催化而生成的。4、 DNA复制的方向是--------------------，蛋白质生物合成的方向是------------------。5、 各种tRNA分子的3末端均有一个共同的结构，是-------------------，这个臂的作用是----------------------。6、 人工合成的最主要的嘌呤类似物有------------------，嘧啶类似物-----------------，它们在临床上可用作抗癌药。7、 某一酶促反应的底物浓度相当于1／2Km,则此反应的初速度为-----------Vm。8、 写出下列英文缩写在生物化学中的中文含义，dNTP------------------------------，CAMP--------------。9、 在蛋白质生物合成过程中，携带转运氨基酸的核酸是 -----------------------，决定氨基酸排列顺序的是---------------------------------。10、脂肪酸β氧化的产物是-----------------------，细胞内进行此代谢反应的主要部位是---------------。四、名词解释（每题3分，15分） 1、限制性内切核酸酶 2、遗传信息传递中心法则 3、变构酶 4、蛋白质的亚基 5、密码子五、问答题（每题10分，20分）1、 简要解释糖尿病患者下述表现的生化机理。（1） 高血糖和糖尿（2） 酮症（3） 糖耐量曲线异常2、 简要说明缺乏叶酸和VitB12产生巨红细胞贫血的生化原因。

  • 核酸采样工作站，核酸采样舱，核酸采样小屋，提高了核酸采样工作的安全性与舒适性

    核酸采样工作站，核酸采样舱，核酸采样小屋，提高了核酸采样工作的安全性与舒适性

    五季智能核酸采样亭的消毒简单方便。室内采用紫外线杀毒，可以在工作前对采样亭进行自助消毒，并确保无菌和卫生。采样人员在核酸采样亭内与外部人员不产生直接接触，医废和垃圾会进行消杀并进行统一回收处理，不会对周边环境造成影响。采样人员通过特制的手套来采集样本，并透过玻璃进行观察。样品采集后，采样人员将样本直接放样本存储区内，大大减少了面对面接触，避免了触摸和呼吸造成的感染。[align=center][img=单人核酸采样工作站,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281424200807_3234_5635765_3.jpg!w690x460.jpg[/img][/align]具体点位选择以室外空旷、手机信号强、通风良好、面积较大为参考标准，可设置在社区卫生服务站、学校操场、体育场、楼宇园区广场、社区空地等。核酸采样场所应划分为等候区、扫码区和采样区，有效分散待检人员密度。每采样点设1-2个工位，每天1-2班，可根据采样人数需求及时增减。与传统核酸采样不同，医护人员在核酸采样亭内与居民无接触即可完成信息登记和采样操作。[align=center][img=移动核酸采样工作站,690,566]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281424511064_5867_5635765_3.jpg!w690x566.jpg[/img][/align]如遇正在开展采样的核酸采样亭，建议市民与排队做核酸的人员保持两米以上距离，以避免人员聚集所带来的危险。目前市面上出售的岗亭以单人操作和双人操作两种规格为主，主要配备的设施包括空调、对讲机、紫外消毒设备、离心风机、过滤器等，每台核酸检测亭都配有空调一台。尽管核酸采样亭已在多地铺设，但目前相关的配置规范和标准仍较少，仅有个别地市如无锡市出台了相关管理规范，对采样亭的选址、设施配套、人员配备等作出明确。核酸检测采样亭配置规范需要根据行业标准去制定，比如负压要求、空调设备要求、采样隔离要求等。杭州、广州、无锡等地比上海更早开始布局建设，相关标准也在参考前人经验。核酸采样亭的快速布局落地,势必给全民的工作生活带来极大的方便,助力全国的精准防疫。五季智能核酸采样亭厂家——欢迎咨询17201681858[align=center][img=便民核酸采样小屋,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/05/202205281425565485_2290_5635765_3.jpg!w690x690.jpg[/img][/align]

  • 核酸微小提过程

    核酸纯化柱（微/小提）http://www.biocomma.cn/images/2mlxiaoti.jpg核酸纯化小提柱产品组成外管医疗级PP，2ml，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，收集离心试剂。内管医疗级PP，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，底部鲁尔接口设计，方便试剂流出。筛板特殊纤维材料，在高速离心过程中，支撑硅胶膜，保证硅胶膜的完整性，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，厚度仅为0.3mm，孔径50um，致孔，孔隙率只有不到百分之二十，相比市场上同类产品，比面积小，静电小，DNA吸附极大降低。硅胶膜孔径1um，高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA，低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP，固定筛板与硅胶膜。核酸纯化微提柱http://www.biocomma.cn/images/2mlweiti.jpg产品组成外管医疗级PP，2ml，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，用来收集离心液。内管医疗级PP，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，底部鲁尔接口设计，方便离心液收集。装配位(这里指装配硅胶膜、筛板和压圈处)1直径为7.4mm，与市场上核酸小量提取同等规格。装配位2，直径为5.4mm，此处为微量核酸提取装配位，面积为小量提取装配位的一半。筛板特殊纤维材料，在高速离心过程中，支撑硅胶膜，保证硅胶膜的完整性，耐受酸碱和大部分的有机溶剂，厚度仅为0.3-0.5mm，孔径50um，孔隙率只有不到百分之二十，相比市场上同类产品，比面积小，静电小，DNA吸附极低。硅胶膜孔径1um，高盐低pH值选择性吸附DNA、RNA，低盐高pH值释放DNA、RNA压圈医疗级PP，固定筛板与硅胶膜。CommaPrep™核酸微提/小提柱可用在核酸提取过程（见图1）中过柱结合、洗涤、洗脱步骤中http://www.biocomma.cn/images/nucleic-2.jpg 图1 核酸提取过程核酸吸附量：核酸纯化小提柱：0-20ug核酸纯化微提柱：0-10ug规格：2ml离心管+吸附柱 适用范围：核酸提取原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改 变溶液环境使DN A溶解到纯水或TE中。DNA提取：核酸提取柱用于基因组DNA抽提，不需要使用平衡液。抽提缓冲液，或者结合液中需要胍盐（如硫氰酸胍等） 辅助DNA吸附到膜上。RNA提取：裂解液建议使用含有硫氰酸胍（异硫氰酸胍）可以抑制RNA酶活性，保证RNA酶完整性；可以配合Trizol使用，样品经Trizo裂解后，氯仿分相去除蛋白等杂质，取上层过柱，然后70%乙醇洗涤，即可得到纯净的RNA。【注意事项】 1.上柱前溶液的PH值应小于7；2.洗涤液中的乙醇浓度不得低于50%，一般55%--80%之间。3.最后洗脱，可以用去离子水或者TE（10 mmol/LTris-Cl，1 mmol/L EDTA (pH8.0)）。如果长期保存DNA，建议使用TE。定购信息Cat#品名离心柱规格提取量包装DNAK1001CommaPrep™质粒小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1004CommaPrep™琼脂糖凝胶回收纯化柱2ml0-10μg100套/包DNAK1007CommaPrep™ 核酸纯化柱（微小提）2ml0-10μg100套/包DNAK1008CommaPrep™基因组小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1009CommaPrep™RNA小提纯化柱2ml0-20μg100套/包DNAK1002CommaPrep™质粒中提纯化柱15ml0-100μg20套/包DNAK1003CommaPrep™质粒大提纯化柱50ml0-500μg10套/包定制

  • 【06年】聚合酶链式反应（PCR）实验方法

    聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。 PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer 4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 　 引物1（10pM） 2 μl 　引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）　 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化　PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1． 反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2． dNTP ：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3． Taq DNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4． 引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：⑴ 引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。⑵ 引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。⑶ 人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。⑷ 引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。⑸ 引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。5． 模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6． PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

  • 【实战宝典】为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意哪些？

    问题描述：为了保证分离核酸的完整性和纯度，在实验过程中应注意哪些？解答：[align=left][font=宋体][color=black]尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；减少化学因素（酶、[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]PH[/color][/font][font=宋体][color=black]）对核酸的降解，提取核酸过程中所用枪头、容器等与核酸直接接触的实验用具应保证无酶，避免核酸被酶解。为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]pH[/color][/font][font=宋体][color=black]为[/color][/font][font='Times New Roman','serif'][color=black]4.0-10.0[/color][/font][font=宋体][color=black]的条件下进行；减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。[/color][/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

  • 【分享】PCR和RT-PCR基础大全（一）

    【分享】PCR和RT-PCR基础大全（一）

    第一章 PCR和RT-PCR基础PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012301341_270843_1856701_3.jpgRT-PCR基础 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10[/s

  • 再谈如何增加PCR 的保真性

    高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特 定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成 i能力强,因为他不纠正合成中出现的突变 b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA

  • 【实战宝典】不同核酸应如何溶解与保存？

    问题描述：不同核酸应如何溶解与保存？解答：[align=left][font=宋体]纯化后的核酸，其中[/font][font='Times New Roman','serif'] RNA [/font][font=宋体]以水溶解为主，[/font][font='Times New Roman','serif']DNA [/font][font=宋体]则多以弱碱性的[/font][font='Times New Roman','serif'] Tris [/font][font=宋体]或者[/font][font='Times New Roman','serif'] TE [/font][font=宋体]溶解。经典的[/font][font='Times New Roman','serif'] DNA [/font][font=宋体]溶解方法多提倡使用[/font][font='Times New Roman','serif'] TE [/font][font=宋体]溶解，其中原因是有人认为[/font][font='Times New Roman','serif'] EDTA [/font][font=宋体]可以减少[/font][font='Times New Roman','serif'] DNA [/font][font=宋体]被可能残留下来的[/font][font='Times New Roman','serif']DNase [/font][font=宋体]降解的风险；如果操作过程控制得当，[/font][font='Times New Roman','serif']DNase [/font][font=宋体]的残留几乎是可以忽略的，可以直接使用[/font][font='Times New Roman','serif'] Tris [/font][font=宋体]或者水[/font][font='Times New Roman','serif'] (pH [/font][font=宋体]接近[/font][font='Times New Roman','serif'] 7) [/font][font=宋体]溶解[/font][font='Times New Roman','serif'] DNA[/font][font=宋体]。[/font][/align][align=left][font=宋体]基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般我们选择[/font][font='Times New Roman','serif']-20℃[/font][font=宋体]或[/font][font='Times New Roman','serif']-70℃[/font][font=宋体]保存。如果温度不合适，保存中核酸会发生降解或者消失。首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的[/font][font='Times New Roman','serif'] pH [/font][font=宋体]值不合适导致的水解[/font][font='Times New Roman','serif'](RNA [/font][font=宋体]在弱酸性更稳定，而[/font][font='Times New Roman','serif'] DNA [/font][font=宋体]在弱碱性更合适。[/font][font='Times New Roman','serif'])[/font][/align]以上内容来自仪器信息网《PCR实战宝典》

Instrument.com.cn Copyright©1999- 2023 ，All Rights Reserved版权所有，未经书面授权，页面内容不得以任何形式进行复制