横切机

2024年4月16日，超薄切片机新品发布会暨电镜前处理设备分享会在领拓仪器培训室和实验室圆满完成。此次活动也是徕卡超薄切片机新品UC Enuitv在国内首次亮相。会议主要分为技术交流与现场实际操作两大部分，上午由徕卡的高级应用工程师包沈源博士进行徕卡超薄切片机新品介绍和徕卡TIC 3X三离子束切割仪与TXP精研一体机产品的应用介绍分享及现场答疑。包沈源博士详细讲解了超薄切片机新品UC Enuity的优势与特点，举例介绍金属、易碎样品、聚合物等样品的超薄切割技术，以及电镜样品前处理全套解决方案，并为现场参会人员解疑答惑。现场互动 下午大家来到领拓仪器的实验室现场直观感受设备，由徕卡的应用工程师王励娟对徕卡超薄切片机新品进行应用讲解。领拓实验室现有20多种国际尖端制样检测设备。参会人员对实验室设备很感兴趣，领拓技术团队就现场参会人员的问题作了详细的解答，并为客户提供完美的应用解决方案，获得了一致好评。 台式扫描电镜CUBE-Ⅱ 三离子束切割仪EM TIC 3X 精研一体机 EM TXP 手自一体磨抛机EcoMet 30 参观实验室 超薄切片由于透射电子显微镜的电子束穿透能力有限，因此需要把待观察的标本切成厚度为100 nm左右的薄片，这种薄片称之为超薄切片。超薄切片机就是用于对样品进行超薄切片的一种制样设备，其可以将切片厚度控制在纳米级，以便电子束能够穿透，用于透射电镜观察。应用范围：生命科学领域：各种动植物组织样品，细胞，细菌等样品的超薄切片。材料科学领域：各种玻璃化温度在常温范围的高分子材料的超薄切片。全新一代超薄切片机 Leica UC Enuity引领技术，超越期待Leica UC Enuity不仅是一款性能卓越的设备，更是一项意义重大的技术革新。进一步提升的控制精度结合自动化模块，使您能够轻松获得高效优质的超薄切片，助您在实验前处理工作中事半功倍。自动化赋能，轻松掌握切片技术Leica UC Enuity 全新上线自动校准和自动修块功能，大大降低常规切片和连续超薄切片技术门槛，让您轻松掌握切片技术，为常规电镜表征和体电子显微学研究赋能。精准靶向，高效利用每一张切片Leica UC Enuity创新性地基于荧光或μCT数据，精准定位样品内部目标区域，为电子显微学实验提供高质量切片，助您深入挖掘样品的分析潜力，提升实验的科学价值。Leica UC Enuity不仅为您带来全新的切片体验，还通过多重防护和人体工程学设计，确保您的工作舒适、稳定和安全。它的高精度和可靠性将为您的实验工作带来便利和保障，让您尽情探索科学的无限可能性！样品前处理设备三离子束切割仪Leica EM TIC 3X可制备横切面和抛光表面，用于扫描电子显微镜 (SEM)、微观结构分析 (EDS、WDS、Auger、EBSD) 和 AFM 科研工作。一次可处理样品多达 3 个， 并可在同一个载物台上进行横切和抛光。工作流程解决方案可安全、高效地将样品传输至后续的制备仪器或分析系统。精研一体机Leica EM TXPLeica EM TXP是一款独特的可对目标区域进行准确定位的表面处理工具，特别适合于SEM，TEM及LM观察之前对样品进行切割、抛光等系列处理。它尤其适合于制备高难度样品，如需要对目标精细定位或需对肉眼难以观察的微小目标进行定点处理。有了 Leica EM TXP，这些工作就可轻松完成。领拓仪器是徕卡LNT的华南、西南授权代理商，领拓仪器为透射电镜/扫描电镜/工业材料样品提供全套样品制备服务。

通过激光刻蚀去除所需位点外围的大部分材料，再通过FIB切割和抛光得到横截面，两种技术相结合最终实现了超大尺寸样品处理所需的速度和精度。而这种组合方式的最新阶段是采用激光刻蚀和PFIB刻蚀实现协同处理，进一步提高分析通量、效率和灵活性。激光集成到FIB室中 VS 独立的激光刻蚀和PFIB协同处理 效率提高至少2,000倍 激光刻蚀提供的最大铣削速率比镓源FIB快约100,000倍，比PFIB快约2,000倍，同时仍保持针对特定位点的足够铣削精度。将激光刻蚀（初始切削材料）与PFIB（最终切割和抛光）相结合可以将制备大尺寸横截面所需的总时间减少95%，在某些情况下甚至更多。如图1显示了镓源FIB、PFIB和激光刻蚀的光斑大小与材料去除率之间的关系。相邻表格提供了这3种技术在最大铣削和最终抛光束流条件下材料去除率的数值比较。如图1：（左）所示，镓源FIB、PFIB和激光刻蚀占据不同的区域，其特点是光斑尺寸（光束直径）和材料去除率之间的制衡。一般来说，较高的束流或束流强度会更快地去除材料，但精度较低。表格(右)比较了材料在三种技术下最大束流和典型抛光条件下的束流(或激光的离子束等效电流)和材料去除率关系。此外，还显示了镓源FIB与激光刻蚀、PFIB与激光刻蚀的去除率之比。将激光集成到FIB室中后，系统一次只能使用一个功能，而其他功能处于空闲状态。TESCANT提供一种最新方式来实施集成显微镜技术，通过独立的激光刻蚀（microPrep PRO、3D-Micromac AG）和PFIB(TESCAN Solaris X)系统提供并行处理。两个系统都不会因为另一个系统的运行而空闲。激光刻蚀系统可以为多个联用工具准备样品，无论联用是多个FIB 还是各种其他故障分析仪器，最终结果都是增加了分析通量和产率，并降低了每次分析的成本。激光刻蚀系统提供约10微米的铣削精度(束斑尺寸)和约3微米的光束定位精度（以厘米为移动范围），使其快速准确地去除立方毫米的材料。基于电路设计的CAD数据或各种FA工具的2D图像叠加的相关对准技术有助于在两个系统中以高精度找到感兴趣区。● 独立系统中的协同处理优点 ●1, 超短激光脉冲最大限度地减少了激光引起热影响区，从而减少了必须通过PFIB中的最终抛光去除的材料量。2. 单独在激光刻蚀系统中切削材料可避免PFIB仓内污染的风险，其中污染物会干扰仪器本身和分析结果。3. 样品同时可以在各种气体环境中通过激光进行处理，并且可以使用解决方案来允许系统之间的转移，而不会暴露在周围环境中。4. 激光刻蚀工具上的平台提供具有六个自由度的精确自动化运动，使其能够在需要时铣削复杂的图案。5. 在激光刻蚀过程中倾斜样品的能力对于补偿由光束能量的高斯强度分布引起的锥度特别有益。尽管它可以使用FIB抛光消除，但在激光刻蚀操作期间避免它可以大大减少FIB抛光所需的时间。6. 消除锥度对于半导体样品中准确对齐堆叠重复结构的横截面（例如TSV、锡焊球等）工艺至关重要。PFIB系统针对高深度大尺寸铣削进行了优化，它提供高达3µA的束流，每秒可去除多达1,400µm3的材料。用于最终抛光的较低离子束电流(300nA)仍可去除高达141µm3/s，即使在具有挑战性的样品上也能提供原始横截面。最具挑战性的样品是那些需要不同切削速率的硬质和软质复合材料的样品。容易产生独特的垂直形貌，描述性地称为“窗帘”。从而引起的窗帘伪影可能会掩盖后续成像中的关键细节。在切削操作过程中，我们可以通过小角度反复摇摆样品减少窗帘伪影。角度的轻微变化使离子束能够更好地进入材料下方较硬的屏蔽区域，并平滑铣削过程。对于束流/铣削速率较高的FIB，窗帘效应可能是一个挑战，就像大通量工作流程中高速铣削所需的那些一样。对于该问题，PFIB系统配置的摆动台提供了一种自动摆动模式，可以予以解决在某些材料中，包括碳化硅、聚酰亚胺、玻璃等，产生的另一种伪影-呈阶梯式。阶梯一旦出现，就会自我强化，很难移除。我们用一种创新的解决方案(True x-section，用户指导程序)来消除了阶梯效应，比大面积FIB沉积速度快得多：允许操作人员在要切片的区域放置一个小的保护硬面罩。案例图2至图6显示了使用激光刻蚀和PFIB来曝光电路元件以进行成像和分析的示例。每个示例都包括每次操作所花费的时间以及相对于单独使用PFIB制备样品所节省的总时间。图2：先进芯片集成中间的图像显示了一个超大的横截面，宽几百微米，深几百微米，穿过集成电路和连接到插入器的焊锡球和触点。左边和右边的图像显示了该截面的细节，左边是IC的放大倍数更高的图像，右边是锡球和接触垫之间的空隙。横切过程在激光刻蚀仪器中耗时10分钟，在PFIB中耗时90分钟，与单独使用PFIB相比节省了70%的时间。图3：锥度校正（右）显示了在高带宽存储器(HBM)器件中硅穿孔(TSV)堆栈的数百微米深和宽的横截面，它说明了系统切割贯通每个TSV中心的精确垂直横截面的能力。在激光刻蚀过程中倾斜样品以补偿锥角对于减少最终PFIB铣削操作要去除的材料量至关重要，从而减少横截面所需的总时间。横截面在激光刻蚀仪器中耗时10分钟，在PFIB中耗时120分钟，与单独的PFIB相比，节省了80%的时间。图4：FIB层析成像的激光刻蚀准备FIB的层析成像通过FIB逐层切片的方式，从捕获的一系列图像中重建了样本体积的3D模型。准备工作首先使用激光刻蚀从一个立方体/矩形体的三面去除材料，如“俯视图”(左)所示。在此视图中，最终将与FIB连续剖切的面位于立方体形状的底部。在“正视图”（中间）中，样品已旋转90°以显示横截面。插图（右）放大了横截面的一个区域以显示其切削质量。使用激光烧蚀制备样品需要10分钟，与PFIB 相比节省了70%的时间。图5: 有机发光二极管面板手机和其他移动设备的显示器含有关键的微结构，在样品制备过程中容易被机械应力损坏。这种精致的样品需要一种特殊的处理方法:在PFIB进行最后切削和抛光之前，在边缘的一个几毫米长的区域被有意地用激光削尖。左上方的第3张图像显示了激光刻蚀切口。下图显示了经过PFIB切削和抛光后长约0.5mm截面(PFIB可以切割和抛光长达1mm的截面)。最右边的顶部图像显示了最终横截面的更高倍放大图。横切面在激光刻蚀中花费了74分钟，在PFIB中花费了165分钟，与单独PFIB相比节省了95%的时间。图6： 微机电系统MEMS设备对样品制备过程中的机械损伤特别敏感。在这个例子中，激光刻蚀被用来打开一个窗口，进入封装的 MEMS 设备进行检查和分析。 节省的时间从70%到95%以上 激光刻蚀功能嵌入FIB系统的系统本质上是低效的，因为一次只能使用一种功能。该技术的最新迭代在独立的激光刻蚀和PFIB中实现并行处理，通过允许同时在两种工具中进行处理来提高通量和产率。这些工具通过相关的图像对齐程序和CAD叠加导航进行集成。在并行配置中，单个激光刻蚀系统可以供给多个FIB和其它FA工具。这种方法具有消除污染FIB系统的风险的优势，其中污染物会干扰成像和分析或损坏系统。我们展示了几个大的、高质量的横截面示例，并计算出与单独使用PFIB制备相比节省的时间，所示示例中节省的时间从70%到95%以上。

质谱成像技术揭示板蓝根中化学成分的空间分布 板蓝根（Isatidis Radix）为十字花科菘蓝属植物菘蓝（Isatis indigotica Fortune）的干燥根，具有清热、解毒、凉血、利咽等功效。作为清热解毒类的代表药物，板蓝根与广泛用于各类感冒的预防和治疗，在严重急性呼吸综合征（SARS）、甲型H1N1流感等疾病的防治中发挥了积极作用。新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发以来，各版《诊疗方案》和“三药三方”中也不乏板蓝根的身影。板蓝根的抗病毒抗炎药效显著，但化学成分复杂，质量评价难度较高，因而一直是国内外研究的热点。 目前研究学者已经从板蓝根中分离得到近400个化合物，综合文献报道主要可归纳为生物碱、含硫化合物、苯丙素、核苷、氨基酸、有机酸、酚、黄酮、蒽醌、萜、醇、醛、酮、腈、酯、糖、甾醇、肽、鞘脂等19大类。研究药用植物化学成分的空间分布，有助于了解其形态学结构和功能。尽管板蓝根的化学成分研究已经十分深入，但其分子空间分布鲜见报道。质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）技术是近年新兴的分子成像技术，通过直接测定样品表面的离子信号获得其空间分布信息，具有非靶向、无需标记和多成分同时检测的优势。与光学图像采集技术结合后，既可观察到高分辨率的形态图像，又可对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析，在生命科学领域显示出巨大的应用前景。本文首次采用高分辨质谱成像技术对板蓝根化学成分的空间分布进行分析。利用大气压基质辅助激光解吸电离-离子阱-飞行时间质谱（atmospheric pressure matrix assisted laser desorption combined with ion trap-time-of-flight mass spectrometry，AP-MALDI-IT-TOF/MS）扫描不同产地药材横切面，鉴定所含化合物，并观察化合物空间分布模式和富集位置，结合偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）算法，对不同样品进行分类。研究思路见图1。 图1 AP-MALDI-IT-TOF/MS成像技术揭示板蓝根中化学成分的空间分布 1. iMScope TRIO 成像质谱显微镜测试条件质谱成像技术在植物、动物、人体组织中的内源性成分和药物代谢组分的可视化检测方面发展迅猛，但在中药分析领域的应用才刚开始起步，且多用于新鲜采集的原植物或中药材。而真正用于市场流通和临床应用的中药材为干品，制备满足MSI测试需要的切片比较困难，故相关研究鲜见报道。在制备板蓝根干品冰冻切片时，其干燥、坚硬、易碎的结构带来了极大的挑战，故对冷冻切片的厚度、温度，切片固定方式，基质种类和添加方式等进行了详细的优化。板蓝根药材经明胶包裹冷冻后，先用双面碳导电胶贴牢后，再用冰冻切片机切制40 μm的组织切片，分别喷涂2, 5-DHAP溶液和1, 5-DAN溶液作为正、负离子的基质。主要质谱条件如下：激光照射直径：40 μm，像素间隔80 μm，扫描范围：m/z 100-500，m/z 500-1000。 2. 板蓝根中化合物的AP-MALDI-IT-TOF MSI可视化分布根据离子的准确质荷比、同位素丰度比，与对照品和液质一、二级数据比对，并结合文献检索和数据库搜查，初步鉴定了多个化合物类别118个质谱峰（见图2）。成像质谱显微镜将光学显微镜和质谱仪的优势整合，既可观察到形态图像，又可对分子进行鉴定和可视化分布分析，在软件上可简便且高精度地重叠观察光学显微镜图像与质谱分析图像，详细解析感兴趣区域。本文采用AP-MALDI-IT-TOF MSI技术首次揭示了板蓝根中化合物的空间分布， 图3和 图4展示了板蓝根横切面的木栓层、皮层、韧皮部、形成层、木质部及部分化合物在特定空间区域的分布。综合分析，板蓝根中化合物大多富集于营养储存的组织韧皮部，与之相比，水分输送组织木质部中集中分布的成分较少。 图2 板蓝根MALDI-IT-TOF MS成像化合物鉴别结果图3 板蓝根横切面光学图 (a) 和oxindole (b)、3-[2' -(5' -hydroxymethyl) furyl]-1(2H)-isoquinolinone-7-O-β-D-glucoside (c)、coniferin (d)、guanine (e)、histidine (f)、 proline (g)、arginine (h)、cyclo(L-Phe-L-Tyr) (i)等成分正离子质谱成像图 图4 板蓝根横切面光学图 (a) 和 isatindigoside F (b)、clemastanin B (c)、maleic acid (d)、malic acid (e)、citric acid (f)、sucrose (g)、isovitexin (h)、vanillin (i) 等成分负离子质谱成像图 3. PLSR法区分不同产地板蓝根药材将4个产地的各3批板蓝根药材分别划分到4个组。以样品横切面的AP-MALIDI-IT-TOF MSI数据为Y值，组别为X值，在正、负离子模式和m/z 100-500、m/z 500-1000两个扫描范围内，分别建立PLSR回归模型。由图5可见，在4个模型中，样品规格的预测值和实际值均呈现良好的相关关系，说明采用PLSR法可对不同产地的板蓝根进行准确的区分。 图5 MALDI-IT-TOF MS成像结合PLSR回归区分不同产地板蓝根样品 正离子m/z 100-500范围 (A)、负离子m/z 100-500范围 (B)、正离子m/z 500-1000范围(C)、负离子m/z 500-1000范围 (D) 本文相关内容由中国食品药品检定研究院的聂黎行研究员提供，详细研究内容已正式发表于Frontiers in Pharmacology - Ethnopharmacology, 2021, https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685575。 文献题目《Microscopic Mass Spectrometry Imaging Reveals the Distributions of Phytochemicals in the Dried Root of Isatis indigotica》 使用仪器岛津iMScope TRIO 作者Li-Xing Nie1,2, Jing Dong3, Lie-Yan Huang2, Xiu-Yu Qian2, Shuai Kang2,4*, Zhong Dai2 and Shuang-Cheng Ma1,2*1 Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing, China2 National Institutes for Food and Drug Control, National Medical Products Administration, Beijing, China3 Shimadzu China Innovation Center, Beijing, China4 College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, China