Annexin V细胞凋亡实验原理及流程

菲恩生物

2024/05/14 16:07

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细胞凋亡，也被称为程序性细胞死亡，是一种有序的、由基因控制的细胞死亡方式。它是生物体正常发育和维持内环境稳定的关键机制之一。

细胞凋亡过程常伴随明显的形态学变化，比如在凋亡早期，细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，它对于磷脂酰丝氨酸（PS）有极强的结合力。在细胞凋亡早期，原本只分布在正常细胞膜脂质双层内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）会翻向外侧，暴露在细胞外环境中。此时，用标记了荧光素（如FITC）的Annexin V作为荧光探针，可以特异地与外翻的PS结合，从而标记出凋亡早期的细胞。PI（Propidium iodide）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期或者坏死细胞的细胞膜，与细胞核结合呈现红色。

将Annexin V-FITC与PI联合使用，可以实现凋亡早期、凋亡晚期或者坏死细胞的区分。在流式细胞仪或荧光显微镜下观察，早期凋亡细胞由于细胞膜完整，PI无法进入，仅显示Annexin V-FITC的绿色荧光；而凋亡晚期或者坏死细胞由于细胞膜通透性增加，PI可以进入并与细胞核结合，同时Annexin V-FITC也能结合外翻的PS，因此这些细胞会同时显示绿色和红色荧光。

细胞凋亡

了解完Annexin V细胞凋亡实验原理后，下面我们一起看一下具体的实验流程。

Annexin V细胞凋亡实验流程

1.获得好的实验结果，需要做好实验前的准备工作，首先得设置好实验方案，具体如下（按照Annexin V-FITC/PI试剂盒用流式细胞仪器检测为例）

Annexin V细胞凋亡实验

2.消化贴壁细胞
对于贴壁细胞，先用适量胰酶(不含EDTA)消化细胞，而悬浮细胞可省去此操作。
需要注意以下几点：
1）由于EDTA是Ca2+螯合剂，EDTA会络合Ca2+，从而影响Annexin V与PS的结合，若使用含EDTA的胰酶有可能会造成假阴性，所以建议用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。
如需使用含EDTA的胰酶消化细胞，有必要在染色之前用PBS或结合缓冲液洗涤细胞多次以去除EDTA，从而避免螯合Annexin V所必需的Ca2+。
2）消化细胞的时间不能太久，处理细胞时要轻柔，若过度消化或机械损伤细胞都会导致细胞膜受损，从而造成假阳性。
3）培养基中也存在已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，因此也收集下来进行检测。
4）检测前细胞密度为80%-90%即可，细胞过密会导致细胞出现大量凋亡，增加了凋亡细胞的比例。

3.重悬细胞
无论是悬浮细胞还是贴壁细胞(消化后)进行细胞重悬，轻柔吹打洗涤，并离收集细胞，制备细胞悬液，进行计数。

4.取细胞悬液(细胞总数为1-5×10 ?cells)加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶 (PI)轻轻混匀，室温避光孵育15min。

5.染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。流式细胞仪检测时，以Annexin V-FITC为例，可使用FITC通道(通常是FL1)检测Annexin V-FITC。PE通道(通常是FL2)检测PI。用流式软件进行分析，以FITC为横坐标，PI为纵坐标，绘制双色散点图。

流式结果图：

流式结果图

凋亡实验中主要分析细胞凋亡早期，流式凋亡结果图各个象限结果代表如下：
左上象限(Annexin V-/PI+)：左上象限为裸核细胞；Annexin V-/PI+象限中细胞数越多，实验结果可信度就越低，因尽量控制本象限细胞比例。
左下象限(Annexin V-/PI-)：左下象限为正常的活细胞；
右上象限(Annexin V+/PI+)：右上象限为晚期凋亡细胞或坏死细胞，细胞膜损伤的细胞DNA可被PI着染产生红色荧光；
右下象限(Annexin V+/PI-)：右下象限为早期凋亡细胞，在细胞凋亡的早期PI无法着染，不会产生红色荧光信号。

1、对照组比处理组凋亡比例高：
a.细胞培养状态不理想；
b.收集细胞后，没有及时染色；
c.过分吹打、震荡，导致细胞膜受损，PS暴露出来。

2、处理组比对照组凋亡比例低：
a.对细胞凋亡诱导刺激强度不足；
b.过度增殖的细胞对凋亡诱导不敏感；
c.贴壁细胞消化时间过长，导致膜表面的PS受损，Annexin V结合位点减少。