血管内皮生长因子（VEGF）是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子（PGF）。通常VEGF即VEGF-A，VEGF-A可促进新生血管形成和使血管通透性增加，VEGF-B在非新生血管形成的肿瘤中起作用，VEGF-C和VEGF-D在癌组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用，VEGF-E也是一种潜在的新生血管形成因子，PGF促进新生血管形成，使血管通透性增加，在实验性脉络膜新生血管中PGF的表达明显增高。血管内皮生长因子 C (VEGFC) 和VEGFD构成血管生成因子的一个亚家族。VEGFC基因定位于4q34，可编码一个由419个氨基酸组成的前体蛋白质。这一前体蛋白质依次有4个区域：N端信号多肽、N端前多肽、VEGF同源区和C端前多肽。VEGFC的VEGF同源区与VEGFA-165有30%同源。VEGFC在许多正常组织都有表达, 包括心肌、骨骼肌、肺、肾脏。VEGFC是第一个被发现的淋巴管生成因子，它可以诱导淋巴内皮细胞增殖、迁移，并形成淋巴窦，可能与肿瘤的淋巴转移有关。VEGFC蛋白可能在胚胎发生过程中在静脉和淋巴血管系统的血管生成中起作用，在各种人类癌症中过度表达，包括乳腺癌和前列腺癌。作为两种受体 VEGFR-3 (Flt4 )和VEGFR-2的配体，VEGF-C/VEGFR-3轴通过不同的信号通路，调节不同的细胞功能，如侵袭、增殖和化疗耐药，在癌症进展中发挥关键作用。因此，靶向 VEGF-C/VEGFR-3 轴对于某些类型的肿瘤可能具有治疗意义。产品信息：【P9018】Recombinant Human VEGFC

一、ELISA原理介绍ELISA即酶联免疫吸附实验，其基本原理是将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被检抗原或者抗体的存在与否或者量的多少。ELISA技术作为免疫标记技术（包含免疫荧光技术，免疫放射技术，免疫酶技术和免疫胶体金技术）中的一种，已广泛应用于科研和临床实验中，具有快速、定性或者定量甚至定位的特点。ELISA可用于测定抗原，也可以测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检验方法。常用的几种方法有双抗体夹心法，间接法测抗体，竞争法，双抗原夹心法测抗体，捕获法测抗体。双抗体夹心法，其基本原理是将一定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗原的待测样品，通过加入酶标记特异性抗体后用TMB底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。该方法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。间接法，将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色,微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。竞争法，其基本原理是将合适浓度的包被抗体包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，加入标准品（样本）和生物素标记的抗原物质进行竞争结合，经合适的温度和一定时间的孵育，洗涤后，加入HRP标记的链霉亲和素进行反应，TMB显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈负相关。双抗原夹心法，将合适浓度的包被抗原包被于微孔板中，加入无关蛋白载体封闭未结合位点，然后加入含有抗体的待测样品和标准品。孵育后，用洗涤缓冲液除去未结合的偶联物。然后加入生物素化的检测抗原，与包被抗原偶联抗体抗原复合物结合。洗去未结合的偶联物后，加入酶标链霉亲和素。第三次洗涤后，加入TMB底物观察HRP酶促反应。TMB经HRP催化生成蓝色产物，加入酸性停止液后变为黄色。在酶标仪上读取450nm处的od吸光度。捕获法，以检测某种抗原的IGM抗体为例，其基本原理是先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中IgM类抗体可被固相抗体捕获，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记抗体 ，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。二、FineTest® ELISA产品优势1.原料自产试剂盒开发生产中蛋白抗体原料的质量对试剂盒品质影响至关重要。FineTest®拥有自己的蛋白和抗体研发生产平台，原料大部分可以实现自产，质量完全可控。另外FineTest®拥有自己的细胞库，血液组织样品库，可以提供更丰富和全面的数据验证，便于客户自行选择满足实验需要的产品。品种广泛的蛋白抗体原料也是我们能根据市场（客户）需求快速调整或者定制试剂盒产品的基础。2.多维度质控FineTest®对试剂盒各组件生产严格质控环节。FineTest®拥有1000平以上的万分之一级别GMP车间，最大程度保证生产环境的洁净度，提高产品的可靠性。通过使用高精密机器生产，和严格的质控抽检，保证批次差小于5%，同时进行广泛的试剂盒性能测试，以满足客户对特异性，准确度和灵敏度的要求。另外，通过在ELISA试剂盒开发过程中生成高纯度的内控校正蛋白，用于不同批次试剂盒标准品的校正，进而保证不同批次间试剂盒检测数据的一致性。所有批次的试剂盒均经过内控校正蛋白校对，不会出现任何结果偏差。3.试剂优化降低检测干扰影响免疫测定的特异性的因素主要包含抗体原料的交叉反应和样本基质环境的干扰效应。交叉反应是指，无关物质被抗体对识别而导致结果出现假阳性。干扰效应是指，样本基质中的其他物质可改变抗原-抗体间结合，而阻止目标分析物被检测出来。这些干扰成分种类众多，一类是干扰性抗体，如众所周知的人抗鼠抗体（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗动物抗体、嗜异性抗体（Id）或类风湿因子（rheumatoid factors，RF）；一类是样品中的内源性物质引起，如高脂和高盐浓度、高粘度可以导致目标分析物被封闭、产生交叉反应；另外高度丰富的血清内源性蛋白，如白蛋白、补体因子、溶血酶、α-1抗胰蛋白酶或纤维蛋白原等都会干扰免疫分析。试剂盒经合适的优化和测试，这些问题都可被缓解。假阳性结果可能由样本的基质效应引发的，这些基质效应只有经过多次验证和质控测试才能被确认。这就是为什么一个成功的ELISA试剂盒不能仅仅只通过信号产生与否来评判，而应看信号是否由目标分析物而产生的。这种情况大多数可通过线性稀释实验来进行验证。为保证试剂盒特异性，我们主要有这3方面的努力，从原料上精选单克隆抗体和多克隆抗体对；从反应溶液体系上优化包被缓冲液、样本稀释液和抗体稀释液来抵抗基质效应；从测定物本身特性优化，天然抗原和重组蛋白抗原与捕获抗体结合力的强弱由于结合后蛋白构象的改变而不同进而会影响检测值的区别。菲恩生物检测试剂相比传统试剂1.背景低；2.样本检测CV值小；3.性价比高；4.更低检测限度。4. 更高灵敏度: 可检测fg/mL级别的蛋白最小能检测值是区别于空白值所能观测到的最低的统计值。它是通过标准曲线空白点多个复孔的2倍标准差与平均值之和，并按照标准曲线值计算而来。灵敏度越高，可用的动力学范围（标准曲线范围）越宽。ELISA试剂盒经过Accquant信号放大系统优化可保证高信号强度，低背景和最优的检测灵敏度，最低可达fg/mL级别。例如：Human HS-IL-6(High sensitive Interleukin 6) Accquant ELISA Kit用途 ：用于体外定量检测人血清，血浆，细胞培养上清或其它生物样品中的IL-6检测范围： 0.078-5pg/ml灵敏度 ：0.046pg/ml实验方法：双抗体夹心法检测时长：4 小时(不含平衡和样品准备时间)单孔样品最大用量 ：血清 50ul，血浆 50ul，细胞培养上清 50ul特异性：特异性和 IL-6 结合，与其它类似物无明显交叉反应储存条件 ：未启封试剂盒 2-8°C(严禁冻存)，6 个月组件：结果：5.试剂盒稳定性FineTest®自主开发的稳定系统可以让试剂盒在40度的环境下存放一周，活性不低于95%。大部分试剂盒可以在4度存放两年活性依然能保持85-95%。基本不影响试剂盒工作和结果的准确性。这同时也方便了运输，以及让客户拥有了分多次使用试剂盒的机会。6. 更高的客户满意度99.5%客户对我们的产品满意无任何售后反馈，0.5%售后通过提供技术支持得到专业的响应和解决。技术支持团队和开发团队、包装运输人员、销售代表同一栋大楼办公，在售后服务过程中可得到必要的资源支持，无障碍快速解决客户问题。我们的技术支持能够解决任何产品性能问题，从提供更详细的技术指导到重发更换产品。如果产品性能问题仍然存在，我们的技术团队确保通过内部审查，以纠正和改进未来的产品性能。为了方便客户了解和使用我们的产品，FineTest®在官网上也增加专门的技术支持板块，包括精准显色、数据处理、样本制备等检测常见问题及解决方案，内容同时以文本和视频方式呈现。如果客户实验室不具备自行检测条件，我们还提供代测服务。FineTest®试剂盒产品从2016年至今，被国内外多所大学、研究机构和药学平台使用并发表文献达2600余篇，总影响因子8000余分，最高影响因子46.351分，每年引用FineTest®产品的文献数量、影响因子都在快速增长，文献发表于Cell Research、Cell、Advanced Materials、Annals of the Rheumatic Diseases、Materials Today、Cellular & Molecular Immunology、Journal of Medical Virology等最前沿科学期刊；公司凭借优异的产品和完善的服务体系受到广大国内外用户的青睐和认可。

核糖体又叫核糖核蛋白体，主要由核糖体RNA(rRNA)及数十种不同的核糖体蛋白（r-protein）组成。核糖体蛋白和rRNA组成核糖体两个大小不同的亚基。小亚基先和mRNA结合，再结合大亚基组成完整的核糖体，两个亚基互相配合共同将mRNA转化为多肽链。核糖体的结构和其他细胞器有显著差异，包括没有膜包被、由两个亚基组成、因为功能需要可以附着于内质网或游离于细胞质，因此，核糖体也被认为是细胞内大分子而非细胞器。原核生物只有一种核糖体，哺乳动物细胞有两种核糖体，细胞质核糖体和定位于线粒体中的核糖体称为线粒体核糖体（mitoribosomes）。药物化学家利用细菌和真核核糖体的差异来制造抗生素如氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素等蛋白质合成抑制剂类抗生素，特异性地破坏细菌感染。由于它们的结构不同，细菌70S核糖体易受这些抗生素的影响，而真核80S核糖体则不然。尽管线粒体具有与细菌相似的核糖体，但线粒体也不受这些抗生素的影响，因为它们被双膜包围，不容易将这些抗生素带入细胞器。根据是否与膜结合，核糖体可以分为游离核糖体和膜结合核糖体。游离核糖体：可在细胞质中的任何位置移动，但被排除在细胞核和其它细胞器之外。由游离核糖体生成的蛋白质被释放到细胞质中并在细胞内使用。由于细胞质含有高浓度的谷胱甘肽，它是一种还原性的环境，因此，细胞质中的游离核糖体不能产生由氧化的半胱氨酸残基形成的含有二硫键的蛋白质。膜结合核糖体：当核糖体开始合成某些细胞器所需的蛋白质时，核糖体可以与膜结合。在真核细胞中，这种结合发生在粗糙内质网（ER）上。核糖体将新产生的多肽链直接插入ER中，这些多肽链然后通过分泌途径被转运至其目的地。膜结合核糖体产生的蛋白质通常在质膜内使用，或通过胞吐作用从细胞中排出。核糖体是蛋白质合成的唯一场所。核糖体的生物发生和蛋白质合成是细胞生长和增殖的基本限速步骤。包含核糖体结构部分的核糖体蛋白（RP）对于核糖体组装和功能是必不可少的。多个RP除了具有典型的核糖体功能外，还具有核糖体外功能，包括在应激反应中激活p53依赖或p53非依赖性途径，导致细胞周期停滞和凋亡。核糖体生物发生，翻译和单个RP功能的缺陷（包括RP中的突变）已与多种称为核糖体病的人类先天性疾病相关。核糖体标志物是核糖体蛋白，如RPS3-RPS6,RPL7A等，推荐抗体如下：货号名称FNab07443anti- RPL7A antibodyFNab07475anti- RPS3 antibodyFNab07476anti- RPS3 antibodyFNab07477anti- RPS3 antibodyFNab07481anti- RPS5 antibodyFNab07482anti- RPS6 antibodyFNab07293anti- RPL4 antibodyFNab07422anti- RPL23 antibodyFNab07417anti- RPL18A antibodyFNab07418anti- RPL18A antibodyFNab07410anti- RPL11 antibodyFNab07408anti- RPL10 antibody推荐蛋白如下：货号名称P9188Recombinant Human RPL7AP1079Recombinant Human RPS3P4945Recombinant Human RPS3P5225Recombinant Human RPS5P9105Recombinant Human RPS5P2408Recombinant Human RPS4P5466Recombinant Human RPL26P2492Recombinant Human RPL23P2767Recombinant Human RPL11P5517Recombinant Human RPL11

西瓜、 冰淇淋 ，要说拜拜了！拿起课本 喝杯牛奶小可爱们出发了这个季节用心学习美丽的未来在等我！菲 恩 生 物开 学 季(活动时间：2023.9.1-10.31)01购ELISA试剂盒（96T）送好礼02抗体专场03蛋白专场武汉菲恩生物科技有限公司(Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.)面向国际市场专业研发、生产和销售ELISA试剂盒、抗体、重组蛋白及相关试剂。公司坐落于中国光谷生物城，建有现代化的研发中心和标准的GMP生产车间，已整体通过ISO 9001:2015质量管理体系认证，获得高新技术企业、3551人才、瞪羚企业、科技小巨人等多项荣誉；公司建有实验动物房、配备先进的实验仪器，以保证产品的品质和实验研究的准确可靠性。  公司由海内外博士、教授组成的研发和管理团队，拥有成熟的分子生物学技术、免疫学技术、蛋白表达纯化技术、抗体筛选及制备等生物学技术。现已研发生产ELISA试剂盒热门产品3000多种，包含10多种稀有种属试剂盒；鼠单抗，兔多抗一万余种经过验证的抗体，同时每年新增研发抗体近千种；多种标记二抗：HRP、AP、Biotin、FITC、Alexa Fluor 488、Cy3、荧光素等；蛋白表达平台为国内外用户提供蛋白产品5000多种，拥有原核、真核两大表达系统。公司拥有一套严格的质控标准，所有生产出的产品均做过大量人和动物实验标本的检测。  公司产品在免疫学、信号转导、代谢、神经科学等领域内都有最前沿科学文献发表，被国内外多所大学、研究机构和药学平台使用并发表文献达2600多篇。公司凭借优异的产品和完善的服务体系受到国内外广大用户的青睐和认可；公司愿成为您的科研好帮手，专业生产商。

蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号传递机制，它通过将磷酸基团添加到蛋白质分子上，从而改变蛋白质的结构和功能。蛋白激酶：将磷酸基团加到蛋白特定氨基酸上，使蛋白磷酸化蛋白磷酸酶：负责磷酸化蛋白的去磷酸化磷酸化主要是针对磷酸化位点制备的，可以特异性识别磷酸化氨基酸位点，检测蛋白磷酸化水平，对磷酸化蛋白进行定性、定量分析。磷酸化抗体可以用来检测该蛋白在细胞受到刺激时的磷酸化水平的变化情况，侧重于了解该蛋白的一种活性状态，哺乳动物细胞中约30%的蛋白质在一个或多个位点被磷酸化，不适当的蛋白质磷酸化是许多人类疾病的原因。一个蛋白可以有多个氨基酸位点发生磷酸化，那么有哪些氨基酸容易发生磷酸化呢？下图展示了磷酸化类型以及常见磷酸化位点：蛋白质磷酸化类型蛋白质磷酸化位点O-磷酸化丝氨酸（Serine；Ser；S）苏氨酸（Threonine；Thr；T）酪氨酸(Tyrosine；Tyr；Y）N-磷酸化组氨酸(Histidine; His; H)精氨酸（Arginine；Arg；R）赖氨酸（Lysine; Lys: K)S-磷酸化天冬氨酸(Aspartic acid；Asp；D)谷氨酸(Glutamic acid；Glu；E)酰基磷酸化半胱氨酸(Cysteine；Cys；C)O-磷酸化类型最常见，在酸性条件非常稳定，因此在细胞生物学和磷酸化蛋白质组学中研究广泛。N-磷酸化不稳定导致其检测具有挑战性。S-磷酸化和酰基磷酸化的研究报道很少。那么如何确定一个蛋白存在哪些磷酸化位点呢？下面以uniprot 网站为例给大家介绍下查找方法：1.通过https://www.uniprot.org/链接进入uniprot 官网，主界面如下：2.以人源TAU蛋白为例，在search栏输入TAU,进入如下界面，找到human TAU：3.点击P10636进入后，点击左侧PTM/Processing查看蛋白修饰情况以及修饰的氨基酸位点：磷酸化蛋白WB检测样本制备有哪些注意事项呢？1.快、狠、准。蛋白磷酸化是一个快反应，制样过程要迅速，样品要新鲜，全程冰上操作。所有用到的试剂，器具要提前预冷。制备的样本需要尽快变性并放在-80°保存，避免反复冻融导致磷酸基团降解。2.裂解液中一定要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则条带出来会很浅。细胞裂解会释放大量内源性蛋白磷酸酶，会催化磷酸化蛋白去磷酸化。还要注意检测蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸位点磷酸化还要加1μmol/L的原钒酸钠。磷酸化蛋白WB检测内参如何选择？磷酸化蛋白检测需要设置2个内参，一个是普通内参比如actin或GAPDH, 保证上样量一致；另一个是磷酸化蛋白对应的总蛋白，比如检测AKT磷酸化，同时还要跑一个AKT总蛋白的抗体，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值变化了才能说明书磷酸化水平发生改变了。WB实验需要提高上样量吗?磷酸化蛋白表达丰度低，大概只有总蛋白10%甚至更低，所以每孔需要足够蛋白量，必要时对细胞进行特定刺激提高磷酸化蛋白表达水平。如下图展示，FNab10910 anti- Phospho-p53 (Ser15) antibody ，UV刺激后细胞的磷酸化蛋白表达水平升高。磷酸化蛋白检测用什么封闭液以及一抗孵育条件？转膜后，建议用5%BSA封闭1小时，非实验级别奶粉可能含有磷酸酶等杂质，不适用于磷酸化蛋白检测。封闭时间过长也会导致抗原标为掩盖。一抗孵育建议4℃过夜，不仅让抗体有充足时间结合，低温环境使蛋白不容易从膜上脱落。

白细胞介素17A，也称为CTLA-8，是一种15-20kDa糖基化细胞因子，在抗微生物和慢性炎症中发挥重要作用。六种IL-17细胞因子(IL-17A-F)由不同的基因编码，但采用保守的胱氨酸结折叠。成熟的人IL-17A与小鼠和大鼠IL-17A具有60%的氨基酸序列同一性。IL-17A由Th17细胞、γ/δT细胞、iNKT细胞、NK细胞、LTi细胞、中性粒细胞和肠道潘氏细胞分泌。它与IL-17F形成二硫键连接的同二聚体和二硫键连接的异二聚体。IL-17A通过与IL-17RC或IL-17RD复合的跨膜IL-17RA发挥作用。IL-17RA和IL-17RC都是对异二聚体IL-17A/F的反应所必需的。IL-17A促进保护性粘膜和表皮炎症以应对微生物感染。它诱导趋化因子产生、中性粒细胞流入和抗菌肽的产生。IL-17A/F同样会诱导中性粒细胞迁移，但IL-17F不会。IL-17A还可增强类风湿性滑膜成纤维细胞产生的炎症介质，并促进TNF-α诱导的休克。相反，它可以通过限制慢性炎症来防止结肠炎的进展。IL-17A促进自身反应性生发中心的形成，并加剧自身免疫实验模型的发生和发展。IL-17A已被证明具有致瘤或抗肿瘤作用。IL-17相关蛋白推荐货号产品名称Uniprot ID宿主序列分子量 标签 P0797Recombinant Human IL-17AQ16552E.Coli24-15517KDaN-terminalHisTagP1413Recombinant Hamster IL-17AG3I1H2E.Coli26-15817KDaN-terminalHisTagP8881Recombinant Mouse IL-17AQ62386E.Coli26-15835.6KDaN-terminalHis-IF2DITagP6923Recombinant Human IL-17BQ9UHF5E.Coli21-18017.5 kDaN-terminal His TagP6226Recombinant Human IL-17DQ8TAD2E.Coli18-20220.2 kDaN-terminal His TagP5948Recombinant Rat IL-17FQ5BJ95E.Coli28-16114.6 kDaN-terminal His TagP6093Recombinant Mouse IL-17FQ7TNI7E.Coli29-16114.5 kDaN-terminal His Tag

免疫沉淀（IP）是一种可以纯化和富集目标蛋白的沉淀技术，在蛋白质组学研究中可用于识别蛋白质与蛋白质之间的相互作用。免疫沉淀是一种重要的技术，用于研究蛋白质之间的存在、相对丰度、大小、上调或下调、稳定性、翻译后修饰（PTMs）以及相互作用。以下为免疫沉淀实验常见问题及解决方案，希望对大家的实验有帮助。一、背景高1.样本中有不溶蛋白残留，离心后应立即取出上清。2.洗涤不充分，优化洗涤缓冲液，通过向洗涤缓冲液中加入去垢剂（0.5-1%NP-40/Triton X-100/Tween-20）、增加盐离子浓度（如250mM NaCl/1-2mM DTT/β-ME），增加洗涤时间和次数来提高洗杂效率。3.有非特异蛋白和磁珠结合，磁珠用BSA预封闭不充分，确保BSA新鲜，将磁珠和1%BSA 孵育1小时，使用前PBS洗涤3-4次。4.抗体特异性不好，使用亲和纯化，特异性好的抗体。5.抗体用量太多导致非特异结合，尝试使用更少的抗体。6.裂解液中蛋白含量太高，导致洗涤液有很多假阳性蛋白，减少样本用量。7.蛋白和抗体非特异结合，可以在免疫沉淀之前预先将磁珠和样本孵育，清理样本中可以和磁珠结合的成分，一些研究人员也使用同型对照来预清理裂解液。8.样本中目的蛋白降解，样本裂解时严格低温操作，加入过量蛋白酶抑制剂。9.高强度洗脱缓冲液（如SDS-PAGE上样缓冲液）将导致多种非特异蛋白和抗原一起洗脱，温和的缓冲液（如0.1M甘氨酸，pH2.5）可防止此类污染。二、大量抗体被洗脱抗体用量太高，尝试减少抗体用量。三、没有检测到目的蛋白洗脱1.样本中目的蛋白不表达或低水平表达，如果表达水平低，需要增加裂解液用量，但也可能导致非特异结合的增加，所以在免疫沉淀之前需要预先清除裂解液。2.抗体用量不够，检查抗体用量，提高使用量。3.目标蛋白没有从磁珠上洗脱，需要确保使用的洗脱缓冲液正确。4.抗体没有结合磁珠，确保使用的磁珠和抗体亚型匹配，磁珠正确保存，防止变质或干燥。5.裂解液中盐碱度太高，需要改用低盐碱度裂解液。一般可选NP-40,RIPA, western及IP细胞裂解液。四、加样顺序对靶蛋白得率的影响磁珠、抗体、抗原样本混合一起孵育，速度最快，但靶蛋白纯度和得率会很低。间接法是抗体和抗原样本先结合，再加入磁珠孵育，靶蛋白得率最高，直接法是磁珠先和抗体结合，再加入抗原孵育，对于表达丰度高的蛋白，两种方法差别不大，如果表达丰度低，要选择间接法获得更高的靶蛋白得率。五、抗原洗脱方法的选择1.变性洗脱法：如果后续进行WB分析，可用此法十分高效，但洗脱下来的蛋白没有生物活性。2.酸性洗脱法：如果要对洗脱后蛋白进行功能分析，则用酸性洗脱法，0.1M-0.15甘氨酸（pH2.5-3）是最高效的非变性洗脱液。3.竞争洗脱法：如果靶蛋白带有标签，可用高浓度标签或配体进行竞争性洗脱，洗脱后样本具有生物活性，且没有抗原片段污染。六、阳性和阴性对照如何设置阳性对照：就是常说的input,可直接用细胞裂解液或提取好的蛋白进行WB,确定样本中目的蛋白的存在。阴性对照：如用同型对照作为阴性对照，来排除非特异结合的情况。七、二抗如何选择IP捕获抗体WB检测一抗WB检测二抗备注小鼠来源小鼠来源HRP-protein A 或HRP-抗小鼠IgGWB一抗若为mouse lgG1/lgG3亚型，HRP-标记 ProteinA亲和力较低，可适当降低其稀释度（也可先尝试HRP-抗小鼠lgG二抗); WB一抗若为小鼠 lgM/lgA亚型，则避免选择HRP- ProteinA，因其不结合。兔来源HRP-抗兔IgG兔来源小鼠来源HRP-抗小鼠IgG兔来源HRP-protein A或HRP-抗兔IgG轻链特异性抗体HRP-Protein A可以有效降低重链信号以及消减轻链信号的影响，背景干净，适用于检测目的蛋白大小除45-55kDa之外的所有目的蛋白，而目的蛋白大小在45-55kDa之间时，推荐使用HRP-标记抗兔lgG轻链特异性二抗。

一、什么是同型对照抗体?同型对照(Isotype Control)指与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合而产生的背景信号。二、为什么使用同型对照?抗体在结构上都极其相似，大部分是恒定区，只有一小部分可变区不同，决定其与抗原的特异性结合。抗体分子结构的恒定区由保守区构成，在同型的抗体中其序列往往相同。而抗体保守区是决定抗体作用机制的关键，其中的Fc region能参与调控并结合各类细胞上的Fc受体。所以同型对照(Isotype Control)可用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的假阳性干扰。同型对照也是阴性对照，其主要目的是确定一抗的结合是特异性的，而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。三、同型对照用于哪些实验？1.流式细胞实验同型对照一直是流式细胞术中最常用的阴性对照之一。同型对照可模拟FcR或其他蛋白非特异性结合和染色，还可以用于设定流式细胞仪的电压，有效节约实验成本。染色方式为：样本管：一抗+样本，同型对照管：同型对照+样本。在以下情况中，实验人员必须使用同型对照确保流式实验的准确性：● 实验人员流式经验较少● 进行胞内蛋白流式实验，针对细胞内靶标的抗体即使不与抗原结合，也常常会出现被拦在细胞内。● 实验不常见或特异性不高的抗体2.免疫荧光和免疫组化，当同型对照的显色信号弱于特异性抗体，才能说明是抗体和样本中的目标蛋白结合。3.IP（免疫沉淀）实验，下图的control IgG为同型对照，同型对照样本只能检测到抗体的重链条带，没有目的蛋白条带。4.Elisa实验检测某种特异抗体时，可用同型对照排除非特异结合。四、如何选择同型对照？如果使用未标记一抗和标记二抗，那么同型对照需要选择和一抗相同来源，相同亚型的抗体，如果使用直接标记的一抗，那么同型对照还需要和一抗有相同的标记物。采用和一抗实验浓度相同的同型对照，以获得正确的结果分析。如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同－－亚型不同——相同类别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记Mouse IgG2а为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2а，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。菲恩生物同型对照产品如下货号产品名称FNSA-0130 Normal mouse IgG ControlFNSA-0131 Chicken IgY-Isotype ControlFNSA-0133 Goat IgG-Isotype ControlFNSA-0134 Rat IgG-Isotype ControlFNSA-0109 Normal Human IgG ControlFNSA-0106 Normal Rabbit IgG Control

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