rProtein A/G琼脂糖填料

rProtein A/G 琼脂糖填料

rProtein A/G Beads 4FF

产品规格: 5ml / 25ml / 100ml

产品介绍：

  rProtein A/G 琼脂糖填料 (rProtein A/G Beads 4FF) 是由高质量的 Recombination Protein A/G 高密度定向偶联到高度 交联的琼脂糖凝胶微球表面，该产品具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，一步纯化即可从血清样品中分离 出纯度大于 90%的抗体，操作简便高效。 

  本产品主要用于免疫沉淀(IP)以及免疫共沉淀(Co-IP)研究，也可用于抗体固定及其它相关研究。用户可根据目标抗体的 种属来源及亚型选择微球的类别，Protein A，Protein G 和 Protein A/G 与不同抗体的亲和性比较参见表 2。 

  rProtein A/G 琼脂糖填料性能参数：

操作流程：

缓冲液准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22μm 或 0.45μm 滤膜过滤。

平衡/洗液：0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0

洗脱液：0.1M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1M Tris-HCl，pH8.5

交联液：0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2

交联剂：DMP (dimetylpimelimidate dihydrochloride) (20 mM DMP 需要现用现配)

终止液：50 mM Tris, pH 7.5

一、免疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP):

1. 蛋白样品的准备：

(1) 贴壁细胞：取 10 cm 细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS 洗涤 2 次，然后加入 500 µl 至 2 ml细胞裂解液裂解细胞（如 RIPA 裂解液）；

(2) 悬浮细胞：离心收集细胞后，PBS 洗涤 1 次，然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解；

(3) 动植物组织样本：参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解；

注：a. 具体的裂解方法，应参考不同裂解液的详细使用说明；b. 不同量的细胞，应选用适当裂解液的用量进行裂解（如果裂解获得的蛋白样品浓度过高，可以用裂解液或 PBS 适当稀释，如果蛋白样品浓度过低，在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量），通常裂解液最终总蛋白浓度选择在 0.5-1ug/ul 范围内较合适；c. 可选：细胞或组织处理时加入广谱核酸酶 Benzonase，能够降解所有形式的 DNA 和 RNA(单链、双链、线形和环状)，而无蛋白水解活性。此步操作可以降低背景，保障实验的可重复性。

2. 去除非特应性结合（可选）：

(1) 取 0.2-1 ml 细胞或组织裂解液，蛋白量约为 0.2-1 mg，加入约 1 µg 和免疫沉淀时使用的 IgG 种属相同的普通 IgG 和 20 µl 充分重悬的 Protein A/G Agarose Resin 4FF，4℃缓慢摇动 30 min~2 h。

(2) 2500 rpm（约 1000g）离心 5min，取上清用于后续的免疫沉淀。

注：所谓种属相同的 IgG 是指与后续免疫沉淀用一抗宿主相同的正常 IgG。此步骤可以预先去除样本与 Protein A/G Agarose Resin 4FF 的非特异性结合，降低背景。

3. 免疫沉淀：

(1) 抗体吸附

① 取适量 Protein A/G Agarose Resin 4FF 加入到 2ml 离心管中，500rpm 离心 1min，吸弃上清。

② 加入 0.5ml 结合缓冲液重悬树脂，500rpm 离心 1min，吸弃上清。继续重复 2 次此操作。

③ 向上述已平衡树脂中加入抗体溶液，重悬树脂，室温下轻轻翻转离心管或置于翻转混合仪混匀 30min 后，500rpm 离心 1min，收集上清液，备用，待检测。

④ 向上述树脂中加入 0.5ml 的洗杂缓冲液，重悬树脂对其进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，500rpm 离心1min，吸弃上清。再重复 2 次。

(2) 抗体交联（可选）

注：如需将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略此步骤。

① 向清洗过的树脂中加入 1ml 交联 Buffer，500rpm 离心 1min，吸弃上清。

② 再向其中加入 1ml 20mM DMP(Dimetyl pimelimidate dihydrochloride)的交联 Buffer，该试剂需现配现用，重悬树脂，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转，促使 Buffer 和树脂充分接触，30min 后，500rpm 离心 1min，吸弃上清。

③ 再向其中加入 1ml 终止液，重悬树脂，终止交联反应，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转15min，500rpm 离心 1min，吸弃上清。

④ 加入 0.5ml 洗杂缓冲液，重悬树脂，进行清洗，500rpm 离心 1min，吸弃上清。再重复 2 次。

(3) 沉淀反应

① 抗原吸附：向上述树脂-抗体溶液中加入含抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与树脂-抗体复合物分散均匀，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应 1h 或者在 4℃下反应过夜。

② 洗杂：将上述完成抗原吸附的产物 500rpm 离心 1min，收集上清液置于冰上待检测。向离心管中加入 1ml 洗杂缓冲液，用移液器轻轻吹打使树脂-抗体-抗原复合物分散均匀，500 rpm 离心 1min，弃上清。重复 2 次，最后加入 1ml 洗杂液，将树脂-抗体-抗原复合物转移至新的离心管中，500 rpm 离心 1min，吸弃上清。

4. 样品洗脱

注：根据后续检测的不同提供两种洗脱方法。

(1) 变性洗脱：该方法适于 SDS-PAGE 检测。向上述离心管中加入 25µl 1×SDS-PAGE loading buffer 混匀，95℃加热 5min。500rpm 离心 1min，收集上清进行后续 WB 分析。

(2) 非变性洗脱：该法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后续功能分析。具体做法：向上述沉淀反应得到的树脂-抗体-抗原复合物中加入 5 倍体积的洗脱 Buffer，用移液器轻轻吹打数次，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 10min，500rpm 离心 1min，吸取上清，收集洗脱组分，即为目标抗原，将其收集至新的离心管中，立即加入 1/10 体积的中和液，将洗脱组分 PH 调至 7.0-8.0，备用。

二、免疫共沉淀 （Co-IP）

1. 抗原抗体的结合：

将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温孵育 30-60min，或者 4℃孵育过夜。

注：① 该步骤孵育时间取决于抗原与抗体的结合效率以及抗原的稳定性，需根据具体情况进行优化；② 抗体的加入量需参考后续加入树脂的量，抗体加入量过多会导致抗原-抗体混合物与树脂的结合。推荐抗体加入量为树脂最大载量的 80%为宜。

2. 树脂准备：

(1) 取适量 Protein A/G Agarose Resin 4FF 加入到 2ml 离心管中，500rpm 离心 1min，吸弃上清。

(2) 加入 0.5ml 结合 Buffer 重悬树脂，500rpm 离心 1min，吸弃上清。继续重复 2 次此操作。

3. 抗原-抗体混合物的吸附：将步骤 1 中抗原-抗体混合物加入到已处理的树脂中，混匀，室温下手动颠倒混匀或置于翻转混合仪轻轻翻转 30min，使其充分接触并吸附，500rpm 离心 1min，收集上清留待检测。

4. 洗杂：向上述离心管中加入 0.5ml 洗杂缓冲液，重悬树脂，去除非特异性结合，500rpm 离心 1min，吸弃上清。再重复 2 次此操作。

5. 抗原洗脱（根据后续检测的目的提供两种抗原洗脱方法，同免疫沉淀法洗脱）

注意事项：

1. 请勿冷冻保存本产品。

2. Protein A/G 琼脂糖珠使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。

3. 所有操作过程中，样本需要在 4℃或冰上操作。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！