实时荧光定量PCR试剂盒

实时荧光定量 PCR 试剂盒

2× SYBR Green qPCR Master Mix

产品规格：50T  200T

保存条件：-20℃长期保存，有效期 24 个月。经常使用，可置于 4?C 保存至少 6 个月。

产品简介：

本产品采用 Sybrgreen 嵌合荧光法进行荧光定量的专用试剂。制品中含有荧光定量反应的最适浓度Sybrgreen，是一种 2×浓度的预混试剂，进行实验时，PCR 反应液的配制十分方便简单。制品中使用了antiTaq 抗体的 Hot Start 法用 DNA 聚合酶，与荧光定量反应适合 Buffer 组合，可以有效抑制非特异性的PCR 扩增，大大提高 PCR 的扩增效率，可以进行高灵敏度的荧光定量扩增反应。另外，本产品中添加了 Tli RNaseH (耐热性 RNaseH)，以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，可以很好地抑制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 适合于快速荧光定量扩增反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。
产品组分：

由以下组分预混而成：EsTaq，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，Sybrgreen。
ROX Reference Dye 是用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。例如使用 Applied ystems 的Real Time PCR 扩增仪进行实验就需要校正。
需要使用 ROX Reference Dye 校正的仪器 Applied ystems 7300 Real-Time PCR System Applied ystems StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) 
需要使用 ROX Reference Dye II 校正的仪器 Applied ystems 7500 和 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) 
不需要校正的仪器 Thermal Cycler Dice™ Real Time System III Thermal Cycler Dice Real Time System Lite Smart Cycler II System(Cepheid) LightCycler/LightCycler 480 System (Roche Diagnostics) CFX96 Real-Time PCR Detection System
使用注意：
1．使用前，请上下轻轻颠倒混匀，避免产生气泡，防止因混合不均匀造成的反应效果不佳。但请勿涡旋振荡混匀。
2．Sybrgreen Premix EsTaq 在-20℃存放可能会产生白色或淡黄色的沉淀，可用手握缓慢溶解，于室温短时间避光放置，轻柔上下颠倒混匀直至沉淀全部消失。沉淀会导致溶液成分不均匀，使用前务必充分混匀2 / 4试剂。
3．配制反应液时，试剂请于冰上放置。反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。
4. 本制品中含有荧光染料 Sybrgreen，配制 PCR 反应液时应避免强光照射。
所需试剂：
本产品为 2×预混荧光定量 PCR 反应体系，使用时只需加入模板、引物和水，使其工作浓度为 1×,即可进行反应。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可 限度地减少人为误差、节约 PCR 实验操作时间、降低污染几率。
操作示例：
本操作以 Applied ystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System 和 StepOnePlus Real-Time PCR System 的操作方法为例，其他仪器请严格按照不同操作手册进行实验。 
1、按下表配制 PCR 反应体系：

通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。
ROX Reference Dye II(50x)比 ROX Reference Dye(50x)浓度低，使用 7500 /7500 Fast Real-Time PCR System 时，请使用 ROX Reference Dye II(50x)。 使用 ABI PRISM 7300 Real-Time PCR System 和StepOnePlus 时，请使用 ROX Reference Dye(50×)。
20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量要在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时需要进行梯度稀释，以确定合适的 DNA 模板添加量。
如果欲使用本产品进行 Two-Step RT-PCR 反应的 步 PCR 扩增反应， 步的 RT 反应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
2、进行 荧光定量 PCR 反应
< Applied ystems 7300/7500 和 StepOnePlus Real-Time PCR System >两步法 PCR 扩增标准程序： 
Stage 1：预变性 循环数：1 
95℃ 30 秒 
Stage 2：PCR 反应 循环数：40 
95℃ 5 秒 
60℃ 30～34 秒* 3 / 4
Dissociation stage * 
使用 StepOnePlus 时请设定 在 30 秒。
使用 7300 时请设定在 31 秒。 
使用 7500 时请设定在 34 秒。 
两步法 PCR 扩增标准程序：
Stage 1： 预变性 循环数: 1 
95℃ 30 秒
Stage 2： PCR 反应 循环数: 40 
95℃ 3 秒
60℃ 30 秒
Stage 3： Melt Curve 
注意：
1） 本产品是利用 anti-Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的化学修饰型 Hot Start 用DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、30 秒。
2） 如果以上两步法程序得不到良好的实验结果时，请再进行 PCR 条件的优化。由于使用 Tm 值较低的引物等原因，两步法 PCR 反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法 PCR 扩增反应。
3、标准曲线制作和结果分析
反应结束后确认荧光定量 PCR 的扩增曲线和融解曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。
实验条件优化：
如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和 PCR 反应条件的优化。另外，根据反应情况选择特异性不同的 qPCRmix， 可提高 PCR 反应性能。 实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，才可以在较大浓度范围内进行很好的定量。
A、反应特异性高的实验体系应具备以下条件：
No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。
不产生目的片段以外的扩增。
B、扩增效率高的实验体系应具备以下条件：
扩增产物起峰更早（Ct 值小）。
PCR 扩增效率高（接近理论值 100％）。
C、降 低 primer  浓 度有助于提高特异性；提高 Primer 浓度有助于提高扩增效率。
D、要提高反应特异性，可以提高退火温度。要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为 3 Step PCR 反应。
E、预变性条件通常设定为 95℃ 30 秒，使用此条件对于难变性的环状质粒 DNA 和基因组 DNA 模板 基4 / 4
本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件，可以延长至 1～2 分钟。但是时 间过长酶容易失活，不推荐使用 2 分钟以上的变性条件。
引物设计：
进行荧光定量 PCR 反应时，设计反应性能良好的 PCR 引物非常重要。根据以下原则，可以设计 PCR 扩增效率高，反应特异性强的良好引物。
PCR 扩增产物长度： 80～150 bp 较为合适（可以延长至 300 bp）。
设计引物要求如下：
A、 引物长度： 17～25 mers 
B、 GC 含量： 40～60%（45～55%理想）
C、 Tm 值：Forward Primer 和 Reverse Primer 的 Tm 值不能相差太大。
Tm 值的计算使用专用软件。 OLIGO： 63～68℃ Primer3：60～65℃
D、 引物序列：A、G、C、T 整体分布尽量均匀。
不要有部分的 GC rich 或 AT rich（特别是 3’端）。
避开 T/C（Polypyrimidine）或 A/G（Polypurine）的连续结构。
E、3’末端序列：避免 GC rich 或 AT rich。
3’端碱基 为 G 或 C。
尽量避免 3’末端碱基为 T。
E、 互补序列：避开引物内部或两条引物之间有 3 个碱基以上的互补序列。
两条引物间的 3’末端避开有 2 个碱基以上的互补序列

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！