Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-eGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒

产品介绍：

  磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而 在细胞凋亡早期，细胞膜 PS 由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使 PS 暴露在细胞膜外表面。Annexin V 是一 种分子量为 35~36kD 的 Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴 露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之 一。

  将 Annexin V 带 eGFP 标签，以此作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜， 但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用 Annexin V 与 PI 双染 的方法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

试剂盒组份：

所需实验器材和试剂：

1. 微量移液器

2. PBS

3. 不含 EDTA 的胰酶消化液

4. 低速离心机

5. 流式细胞仪

注意事项：

1. 此试剂盒仅供研究使用。

2. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

4. Annexin V-eGFP中含有毒性成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

5. 本试剂盒用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×106。

6. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

7. Annixin V检测凋亡细胞的方法适用于悬浮生长的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞，由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较高的假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测，可将胰酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防止进一步的损伤。尽管目前，包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我们不推荐用该方法检测。因为其重复性较差，且需要操作时非常小心。

8. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V- EGFP，最终导致染色失败。

9. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

‍操作说明：‍

1. 细胞样品的准备：

a) 悬浮细胞：

i. 收集细胞至离心管中 1000-2000rpm 离心 5min，小心去除上清。

ii. 用 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离心 5min，小心吸除上清。

iii. 再加入 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离心 5min，小心吸除上清。

b) 贴壁细胞：

i. 吸出细胞培养液至离心管中，PBS 洗涤贴壁细胞一次，加入适量不含 EDTA 的胰酶细胞消化液消化细胞。

ii. 室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

iii. 加入步骤 i 中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，1000-2000rpm 离心 5min，小心吸除上清。

注：加入步骤 i 中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V- EGFP 导致染色失败。

iv. 用 1ml 4℃预冷 PBS 轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm 离心 5min，小心吸除上清。

v. 再加入 1ml 4℃预冷的 PBS 重悬细胞，1000-2000rpm 离心 5min，小心吸除上清。

2. 用去离子水按 1：4 稀释 Binding Buffer（4ml Binding Buffer (4×)+12ml 去离子水）；

3. 用 250ul 结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1×10⁶/ml；

4. 取 100ul 的细胞悬液于 5 ml 流式管中，加入 5ul Annexin V- eGFP，轻轻混匀；

5. 室温(20-25℃)避光孵育 5min；

6. 上机前 5 min 加入 10ul 碘化丙啶溶液，轻轻混匀；

7. 上机前在反应管中补加 400ul PBS 重悬细胞， 避光保存， 随即进行流式细胞仪（FC）检测，Annexin V- eGFP 为绿色荧光，PI 为红色荧光。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！