Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒

产品简介：

磷脂酰丝氨酸（PS）是一种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS 只分布在细胞膜脂质双层内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜 PS 由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使 PS 暴露在细胞膜外表面。Annexin V是一种分子量为 35~36kD 的 Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 Annexin V 被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将 Annexin V 进行 FITC 标记，以标记了的 Annexin V 作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此采用Annexin V 与 PI 双染的方法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

试剂盒组份：

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所需实验器材和试剂：

1. 胰酶（不含 EDTA）
2. PBS
3. 微量移液器
4. 低速离心机
5. 流式细胞仪操作说明：
1. 样品染色
(1)．悬浮细胞：300g，4℃离心 5min 收集细胞。
贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后，300g，4℃离心 5min 收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。
(2). 用预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次均需 300g，4℃离心 5min，收集 1~5×105 个细胞。
(3). 吸弃 PBS，加入 100μl 1×Binding Buffer（双蒸水稀释）重悬细胞。
(4). 加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI Staining Solution，轻轻混匀。
(5). 室温避光孵育 10-15min。
(6). 加入 400μl1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品1 小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。‍‍
2. 样品分析
A.流式细胞仪分析：
FITC 激发波长为 488nm， 发射波长 525nm；PI-DNA 复合物的 激发波长为 535nm， 发射波长为 615nm。用 CellQuest 等软件进行分析，绘制散点图，FITC 为横坐标，PI 为纵坐标。典型实验中的细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的自发荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色及红色荧光双重染色。‍‍

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图 2. 流式细胞仪检测早期凋亡细胞。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，右下象限为早期凋亡细胞，右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞。

B.荧光显微镜分析：

(1). 悬浮细胞：滴一滴用 AnnexinV-FITC/PI 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

贴壁细胞：可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

(2). 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。早期凋亡细胞仅有绿色荧光信号，晚期凋亡细胞有绿色及红色荧光双重染色。

图 3. 荧光显微镜检测凋亡细胞，绿色荧光为 Annexin V-FITC 染色细胞，红色荧光为PI 染色细胞，被绿色和红色荧光双染的是晚期凋亡或坏死细胞。

注意事项：

1. 此试剂盒仅供研究使用。

2. 微量试剂需离心数秒将试剂收集至管底后再开盖取用。

3. Propidium Iodide（PI）有毒，操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

4. Annexin V-FITC中含有毒性成分叠氮化钠（NaN3）, 操作时要带手套，使用时避免与皮肤，眼睛和黏膜接触。

5. 本试剂盒用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁵个。

6. 染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

7. 对于贴壁细胞，由于胰酶消化会造成细胞膜的损伤，从而导致较高的假阳性；用细胞刮会造成细胞粘连成团，从而影响检测。

8. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

运输与保存方法

冰袋运输，如需在短时间内多次重复使用，可4℃避光保存，一年有效。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！