两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）

两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）

产品及特点

本产品使用重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(Avian Myeloblastosis Virus ReverseTranscriptase, AMV RT)，从总 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成第一链 cDNA 的试剂盒，含有 cDNA 第一链合成所需的所有试剂。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的活性，能够作用于 GC 含量高，二级结构复杂的 RNA。合成的第一链 cDNA 可广泛应用于第二链合成、杂交、PCR 扩增、Real-time PCR 反应等。

1. 即开即用，足够 50 次 RT 反应（20μL 体系）和 600 次 PCR 反应（30μL 体系）。

2. cDNA 第一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合各种情况。

3. 两管式操作，RT 和 PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。

4. 全长的第一链 cDNA 产量高，最长可合成 8 kb 的 cDNA。

规格及成分

运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂 样品 RNA、模板专一正向和反向引物。

使用方法

一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂） 

1. 可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。 

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA 

2. 按下表配制 RT 反应体系（20 μL 体系）:

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非 mRNA 的干扰。

3. 轻轻混匀后离心 3-5 sec，反应混合物在 65℃温浴 5 min 后冰浴 30 sec，离心 3-5 sec。 

将试管冰浴，再加入如下组分：

轻轻混匀后离心 3-5 sec。

在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应：

cDNA 合成 42℃ 30-60 min；

终止反应 85℃ 5 min（酶失活），处理后，置于冰上放置。

注意：若使用 Oligo dT 引物或序列特异性引物，进行 42℃，30-60 min 反应； 若使用随机引物，应先进行 25℃，10min 反应，然后进行 42℃，30-60 min 反应。

三、PCR（30 μL 体系）

4. 在 PCR 管中加入下列成分：

注意：cDNA 也可以稀释后作 PCR 模板。是否稀释或稀释倍数取决于靶基因的丰度。 

5. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

四、电泳检测 

取 5-10μL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。

注意事项

1. RNA 样品要避免基因组 DNA 污染。用于 cDNA 合成的器具须用 0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液 37℃浸泡 12 h；然后在 120℃高压灭菌 30 min 去除残留的 DEPC。 

2. 用于 RNA 实验的试剂，须使用干热灭菌(180℃，60 min)或者上述 DEPC 处理的器具盛装，使用的无菌水须用 0.1% DEPC 处理后进行高温高压灭菌。建议 RNA 实验使用的器具、试剂和无菌水专用。 

3. 不必从总 RNA 中分离 Poly(A)+ mRNA，但以 Poly(A)+ mRNA 为模板可以提高终产物得率和纯度。 

4. 尽管以 Oligo dT 作引物无需优化，但随机六合引物和 RNA 的比例对于 cDNA 合成产物的平均长度非常关键，提高随机六合引物/RNA 的比值将导致短链 cDNA (500 bp)产量升高而减少，此比值则有利于长链 cDNA 的合成。 

5. 提高反应温度到 50℃有利于解决富含 GC 二级结构的 mRNA 问题。AMV RT 的热稳定性相对于 M-MuLV 较好，在 37-50℃有较高活性。 

6. cDNA 产物应置于-20℃保存。实验操作时应将酶置于冰上，实验结束后于-20℃保存。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！