荧光及可视化LAMP试剂盒

荧光及可视化LAMP试剂盒

产品及特点 本产品是根据本公司的双染料 LAMP 专利技术开发的荧光和可见光双模式LAMP 扩增及检测试剂盒，它既可以用于荧光 LAMP 扩增及检测，也可以用于可视化 LAMP 扩增及检测，适用于各种针对核酸的快速定性检测。本产品具有下列特点：
1. 一般 60 分钟内出结果（取决于靶分子浓度），比 PCR 快约 1 小时。
2. 对 20 μL 的反应体系，最大样品加样量达到 14 μL。
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。

4. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。

5. 特异性比 PCR 高，因为 LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
6. 灵敏性可达 10 拷贝/反应以下（随引物而不同），故假阴性率更低。
7. 本产品跟北京的多种免提取试剂盒（如免提病毒保存液）兼容。
8. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
9. 本产品只适用于 LAMP 检测，不适用于进行 RT-LAMP 检测。

10. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的荧光及可视化 LAMP 扩增。

规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。
自备试剂 LAMP 模板及 LAMP 引物、PCR 级石蜡油（仅对使用金属浴或水浴者）。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在 60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和 70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容，可以选购本公司的各种免提取试剂盒。

2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 DNA 提取操作，得到 N+2 个 DNA 样品。
二、配制并测试自备的20×LAMP引物混合液
3. 用超纯水将自备的 6 种（或 4 种）LAMP 引物干粉稀释到母液浓度（100μM），然后按下表配制 100μL 的 20×LAMP 引物混合液，此混合液足够100 次 20 μL 体系的 LAMP 扩增。如果需要配制的 20×LAMP 引物混合液体积异于 100 μL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置 2 年。
注意：总体积为100 μL。如果自备的LAMP引物不含Loop引物，则按上表配制时Loop用超纯水替代，使得总体积为100 μL。
4. 测试引物的非特异扩增：在加模板和不加模板（至少 1000 拷贝/反应）的LAMP 系统中测试引物效果，引物选择标准可以自己掌握，最好选择无模板反应的 Ct 值比有模板反应的 Ct 值大 60 以上（每个循环 1 分钟）的引物对。根据结果设定判断阴性和阳性结果的阈值（本产品只用于定性）。如果没有 qPCR 仪器，只能用肉眼检测，则无需设定阈值，届时靠跟阳性
对照和阴性对照管的颜色来判断。
三、LAMP 扩增（20 μL 体系）
5. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+5 个 LAMP 扩增，增加扩增阳性对照、无模板对照和无引物对照各 1 个。在 N+5 个 0.2mL的 PCR 管中加入下列成分：
6. 混匀后进行扩增，可以根据实验室条件选择下列两种方式进行扩增和检测。
7. 如使用金属浴、水浴或普通无热盖 PCR 仪，则每管加 30μL 石蜡油，再65℃保温 120 分钟。如不加石蜡油，保温期间水分蒸发，会有非特异扩增。

8. 如果使用荧光定量 PCR 仪：聚合温度设为 65℃，1 次循环 1 分钟，120个循环，每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
三、结果分析及解读
9. 阈值设定：在前 10 分钟荧光值会升高再稳定，故只能取第 10 到 15 分钟的荧光值作阈值。此现象估计是常温下可见光染料和荧光染料结合并对后者有淬灭作用，加热到 65℃后两种染料分开，淬灭逐渐解除，荧光逐渐升高，10 分钟后稳定。没加可见光染料的反应无此现象。
10. 所有阳性对照有阳性结果（Ct 在 60 以内或反应液呈蓝色），所有阴性对照有阴性结果（Ct 大于 60 或反应液呈淡蓝色），否则提取实验或扩增实验无效。需要寻找原因或跟厂家联系，暂时不需要分析样品的结果。
11. 如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。如果肉眼观察，样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增有靶分子，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增无靶分子。）
12. 如果是用荧光 PCR 仪，样品 Ct 将小于阈值则为阳性，大于阈值则为阴性。
13. 当实时荧光检测和可视化检测同时使用时，如果不一致，以实时荧光 LAMP的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果 20-30 分钟，也就是说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其颜色变化在第 50-60分钟时才能观察到。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！