一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装

一站式miRNA尿素-PAGE电泳套装

产品及特点 尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Urea PAGE)是目前分离 200 nt 以下的小片段RNA，尤其是 20 nt 左右的 microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是单独配制各种溶液十分繁琐，为此基因开发了本产品。它具有下列特点:
1. 一站式，含有电泳所需要的所有试剂，即开即用，十分方便，免去了实验人员称取有毒物品。
2. 灵活，可以根据需要配制各种浓度的 Urea-PAGE，以便对长度各异的RNA 进行电泳。
3. 电泳后可直接用于 UV 观察、银染、胶回收、Northern 杂交等实验。

4. 使用新型缓冲液，可以防止甘油的干扰。

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存，miRNAon、miRNA Marker 需要低温运输，-20℃保存，保存期一年。

自备试剂 miRNA 样品、RNase-free 水。

使用方法

1. 准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁工作平台直接将固相 RNase 清除剂原液或 10 倍的新鲜稀释液喷于台面，5 分钟后
用普通吸水纸擦净，最后用沾有固相 RNase 清除剂 1000 倍新鲜稀释液的吸水纸擦净，晾干。
2. 准备工作：用固相 RNase 清除剂清洁玻璃和塑料器皿将器皿浸泡在固相 RNase 清除剂的 10 或 100 倍的新鲜稀释液中，静置处理 5 分钟后取出，再用固相 RNase 清除剂 1000 倍或 10000 倍新鲜稀释液浸泡二次以上，倒立晾干后备用。
3. 配制 1×TBE 电泳液: 将适量的 10×TEB 电泳液用 RNase-free 水稀释
4. 配制 10%过硫酸铵溶液: 精确称取约 100 mg 过硫酸铵到一干净的 1.5mL 离心管中，按每 1 mg 过硫酸铵加 10 uL RNase-free 水的比例加入RNase-free 水，摇晃溶解待用。10%过硫酸铵溶液有效期不要超过一周。
5. 估计所需要的凝胶溶液的体积，一般配制一块 13 cm×15 cm× 0.8 mm的胶需要 15 mL 凝胶溶液，配制一块 36 cm×45 cm×0.8 mm 的胶需要 120 mL 凝胶溶液。
6. 配制 40%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液：将 3g 甲叉双丙烯酰胺加入到装有 60g 丙烯酰胺干粉的瓶中，再加入 130 mL RNase-free 水，充分摇晃混匀即得 40%的 Acrylamide/Bis 溶液。
7. 根据所需要的凝胶溶液的体积，在一的干净的三角瓶中按下表加入各成分（此处以配制 100mL Acrylamide/Bis 终浓度为 15%的凝胶为例）:
8. 搅拌并加热到 40-50℃左右，直到尿素完全溶解。
9. 冷却到室温后，将三角瓶接上真空系统抽真空处理 10-15 分钟以充分去除溶液中的氧气（氧气会降低聚合反应效率）。若条件有限，此步可省略。
10. 边摇晃溶液变加入 50 uL TEMED 和 500 uL 10%过硫酸铵。注意：如果选择其他工作浓度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要随之改变。但如果配置的凝胶溶液的体积变化，此二成分的用量要按比例改变。
11. 再充分摇晃约 30 秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置 30-60 分钟等待胶凝固。
12. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的 1×电泳缓冲液。如果不马上使用，需要有湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。
13. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。
14. 在上样前，预电泳 20-30 分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样空，同时还可以使凝胶的温度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 变性状态。
15. 将 miRNA 样品与等体积的 miRNAon 混合，将 miRNA Marker 5uL 与5uL 的 miRNAon 混合，70℃保温 2-3 分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。
16. 关电泳仪后开始上样。miRNA Marker 与 miRNAon 的混合液（共 10uL）需要全部上样。
17. 重开电泳仪，对 13 cm×15 cm 的胶，以 20-30mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对 36 cm×45 cm 的胶，则以 50-60mA 的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。
18. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每100 mL 1×TBE 中加 20 uL 10mg/mL 的 EB 溶液）、基因低毒核酸染料 DNAgreen（每 100 mL 1×TBE 中加 10 uL DNAgreen 原液）。UV 下观察并拍照。本产品提供的 miRNA Marker 有 5 条带，从上到下的长度分别为：50nt、40nt、30nt、20nt 和 15nt。
19. miRNA 回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理。
20. Northern 杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV 下确定所需要的 miRNA条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。
21. 放射自显影：如果 miRNA 样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟 X 光片向对置进行放射自显影。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！