一站式DNA非变性PAGE电泳套装

一站式DNA非变性PAGE电泳套装

产品及特点 非变性 PAGE 电泳是研究 SSCP-PCR（single-strand conformationpolymorphism-PCR、单链 PCR 片段构象多态性）和凝胶滞阻（Gel Shift）的重要研究手段，因为在非变性 PAGE 中，DNA 的迁移率除跟长短相关外，还跟其构象和结合的蛋白质相关。本产品就是专门用于非变性 PAGE 的试剂，它具有下列特点:
1. 一站式，用户只需要准备去离子水和样品，十分方便。
2. 安全，免去了实验人员接触粉末状的剧毒物品丙烯酰胺。

3. PAGE 电泳后可直接用于银染等后续试验。

规格及成分

注：TEMED 和过硫酸铵（干粉）放一个热封袋，DNA 非变性 PAGE 上样液 放另一个热封袋，低温单独存放。

运输及保存 常温运输，收到货后各成分的保存条件见上表，有效期一年。
自备试剂 去离子水、核酸银染试剂盒
使用方法 用于 SSCP-PCR 分析的非变性 PAGE 电泳（其他应用请相应修改参数）
一、PAGE 浓度的选择：最好使用浓度为 5-12%的丙烯酰胺胶，因为SSCP-PCR 的扩增长度一般在 150-200bp 之间，而 5%的 PAGE 的有效分辨范围为 80-500bp、8%的 PAGE 的有效分辨范围为 60-400bp、12%的 PAGE 的有效分辨范围为 40-200bp。
二、体积的选择：SSCP-PCR 检测需要长约 30-40cm 的测序胶板，可以结合梳子的厚度，计算所需 PAGE 胶的体积。
操作：
1. 配制 PAGE 胶（下面以配制 100 mL PAGE 胶为例计算用量，配制更大体积的胶则需以此用量为基础按比例增加）
A：新鲜配制 10%的 APS（过硫酸铵）：按每 0.1 克过硫酸铵干粉加 1mL去离子水的比例将水加到装有硫酸铵干粉的 1.5 mL EP 管中，摇晃到粉末全部溶解。配制好的 10%的 APS 溶液可以在 4℃存放一周。
B：新鲜配制 30%的丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液（29:1 的 AB 溶液，下同）：在本产品提供的装有 60g 丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺干粉的250mL 棕色塑料瓶中加入 146 mL 自备的去离子水，充分摇晃直到溶解（约需 10-20 分钟），即得到 30%的 AB（29:1）溶液。此溶液最好在一个月内用完，4℃保存。
C：配 SSCP PAGE 胶：在一个 250mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去离子水、30% AB 溶液和 10×TBE 缓冲液。丙烯酰胺单体溶液具有神经毒性，一定要戴手套操作。

C：摇晃混匀。最好能抽真空 10-15 分钟以去除溶液中的氧气（氧气能抑制丙烯酰胺聚合反应），无条件也可以不脱氧。
D：加入 500uL 10%APS 和 100uL TEMED，迅速摇匀后倒胶。
E: 在胶的液面距离达到顶部时停止灌胶，插入梳子。
F: 室温聚合 30-60 分钟（低温抑制聚合反应，故最好室温）。
G: 待胶凝固后拔出梳子，用 1×TEB 液冲洗加样孔。
H: 放 4℃冰箱预冷 30 分钟-12 小时。为了防止 PAGE 胶收缩，最好在其顶部加少量 1×TBE 缓冲液。使用预冷的 PAGE 胶有利于单链 DNA 在电泳时保持其构型，这些构型靠 DNA 序列间的链内互补形成，对温度很敏感。
2. 将预冷的凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够 1×TEB 电泳液。
3. 取 3-5 uL SSCP-PCR 样品，加入等体积 2×非变性 PAGE 上样液，85℃处理 5 分钟后冰浴。用前短暂离心后取 2 uL 上样。上样量跟检测方法的灵敏度相关，上述上样量是针对核酸银染检测法。
4. 连接电源线，打开电源开关。如果 PAGE 中不含甘油，则使用 25W 的功率，电泳 5-7 小时（对 3-40cm 长的 PAGE 胶而言）。如果使用含甘油的PAGE，则使用 8W 的功率，电泳 16-18 小时。由于温度变化过大会改变DNA 构型，所以电泳时最好能保持恒温。对不含甘油的 PAGE，最好恒温在 4℃、对含甘油的 PAGE，最好恒温在 25℃。

5. 终止电泳，取出凝胶进行后续的银染处理。不建议使用灵敏度低于银染的方法，因为 SSCP 异构体的数量都比较少，一般方法没法检测到。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！