动植物膜蛋白微量制备试剂盒

动植物膜蛋白微量制备试剂盒

产品及特点

细胞膜蛋白质参与了很多重要的细胞活动，根据它们与膜结合的位置一般分为两种，一种是附着在细胞膜上，另一类是嵌入到细胞膜中间。附着型膜蛋白疏水性较弱，比较容易提取和纯化;而嵌入型膜蛋白疏水型很强，所以在水溶液里面很难溶解，非常难以提取和纯化。基因根据上述特点，经过精心优化的、开发出本产品，专门用于分离纯化这两种膜蛋白。它具有下列特点:

1.两步法提取，先纯化含膜组分，再分离附着型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。

2.膜蛋白（附着型+嵌入型)产量高，对肝脏组织而言，其线粒体膜蛋白产率为10 ug/mg左右，过氧化物酶体为1 ug/mg左右，内质网为25-30ug/ mgo

3.所得的膜蛋白大部分具有生物活性,可用于活性研究。
4.可用动物、植物培养细胞和实体细胞为材料，也可用预先纯化的含膜组分或细胞器（如线粒体、叶绿体、内质网、过氧化物酶体）为材料（本试剂盒不含纯化细胞器的试剂)。
5.本方法重复性好。

6．本试剂盒足够50次微量提取，分A型和B型两种。A型用于附着型膜蛋白，B型用于嵌合型膜蛋白和附着型膜蛋白。

规格及成分

运输及保存 常温运输及保存，有效期一年。

自备试剂 PBS，电泳上样液。
使用方法

1、对培养细胞:收集1×107个培养细胞（动物细胞、植物细胞)，用20 mL自备的冰浴的PBS洗涤三次,每次洗涤后需要4℃下1000g离心2分钟，然后小心弃上清。对实体组织:由于各种动植物的各种实体组织的属性差别太大，故本手册的纯化膜组分的操作步骤（第1-7步)不一定完全适合，用户需要自行优化以纯化含膜组分或含膜的细胞器（如细胞质膜、内质网、线粒体、叶绿体等)，再将含膜组分或细胞器沉淀直接用于第8步的膜蛋白提取。

2、将洗涤后的细胞沉淀重悬在2 mL溶液A中，冰上静置10分钟。注意:膜蛋白有膜的保护，在纯化过程中对蛋白酶的降解没有胞浆蛋白敏感，一般可以不加蛋白酶抑制剂。但如果纯化的膜蛋白的确有降解的话，可以在溶液A中加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。
3、转移到容积为2 mL的 Dounce玻璃匀浆器上下匀浆20-50 次(具体次数取决于细胞种类，293T细胞一般需要20次左右，而MEF细胞一般需要5O次左右。最好用样品先进行预实验以摸索最佳匀浆次数，最佳匀浆次数时在显微镜下能看见细胞破裂但细胞核完整)。

4、将匀浆液转移到15或50 mL塑料管中，加入相当于匀浆液体积1/10的溶液B,其间可以轻柔颠倒混匀3-5次，留少量样品作为对照1(勾浆液)。

5、4℃ 2500 rpm离心20分钟，沉淀为细胞核，上清为胞浆和膜成分，留少量样品作为对照2(胞浆和膜成分)。

6、将上清液用Beckman Optima台式超速离心机100,000 g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该为100,000g，否则有可能得不到膜成分沉淀。

7、小心转移上清（胞浆部分)并留少量样品作为对照3（胞浆)。
8、将沉淀（含膜组分）重悬于1 mL冰浴的溶液C中后，冰上静置30分钟，留少量样品作为对照4(膜成分)。本成分电泳前，需要先用自备的TCA沉淀（TCA终浓度为10%)，再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在1×上样液中待用。对照1-3号不需要这样的预处理。
9、用Beckman Optima台式超速离心机 100,000g 4℃离心60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
10、如果需要附着型膜蛋白，则取上清（含附着型膜蛋白)弃沉淀（含膜和其中的嵌合型膜蛋白)。上清可以放-20℃长期保存，如果需要电泳，需要先用自备的TCA沉淀（TCA终浓度为10%)，再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在1×上样液中与对照1-4号一起上样电泳。

11、如果需要嵌合型膜蛋白，则取出上清（含附着型膜蛋白）并留少量样品作为附着型膜蛋白样品，然后再用1 mL 冰浴的溶液C重悬沉淀，然后100,00og 4℃离心60分钟，去掉上清(上清含残留的附着型膜蛋白，可以留样作为洗涤后的附着型膜蛋白样品)。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋白。如果需要测定膜蛋白的浓度，则将其溶解在自备的0.5 M NaOH溶液

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！