细菌膜蛋白质微量提取试剂盒

细菌膜蛋白质微量提取试剂盒

产品及特点 本试剂盒是基于超速离心的快速提取细菌膜蛋白的试剂盒。其原理是裂解细 胞后，通过超速离心分离出细胞膜和附着的蛋白质。跟传统的密度梯度离心法和去 污剂法相比，本方法具有下列特点：

1. 一步式分离细胞膜和膜蛋白，密度梯度离心法简单快捷。

2. 膜蛋白纯度高，能够去除各种胞浆蛋白的污染，也能去除松散附着在细胞膜上 的蛋白，所得膜蛋白主要是整合蛋白。

3. 膜蛋白完整性好，主要是由于实际中有抑制蛋白酶成分。

4. 回收效率高，一般能得到相当于总蛋白量 6%的膜蛋白。

5. 可用于 E. coli，S. typhimurium，K. aerogens，P. aeruginosa，C. crescentus 等细菌。

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存，但 DNase I 需要低温运输，-20℃保存。有效期一年。
自备试剂 膜蛋白溶解液（取决于后续实验。如果后续实验为 SDS-PAGE，则用 1×SDS-PAGE 上样液作为溶解液；如果用于 2D 电泳，则使用 1×等电点电泳上样液作为溶解液）。
使用方法 准备：第一次使用本试剂盒时需要将所有 DNase I 干粉倒入溶液 B 中，轻柔颠倒使 DNase 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一个月内完，否则Nase 将逐渐失去活性。此外，最好在实验前 1 小时将溶液 B 冰浴预冷。
用法一：小量制备（主要用于上样量比较小的 SDS-PAGE 电泳等实验）
1、 收集 20-40 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500g 室温离心 10 分钟后弃上清。
2、 加入 2 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。
3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
4、 加入 0.5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 20-40 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌
裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。
6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料离心管中（如 Beckman Optima 台式超速离心机离心管），弃沉淀（未破裂细胞）。
7、 在上清（细菌裂解液）中加入 5 mL 预冷的溶液 C，轻柔颠倒混匀后冰浴放置30-60 分钟。其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次。
8、 用 Bechman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 0.2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。
10、用 Beckman Optima 台式超速离心机 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。
11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×SDS-PAGE 上样液中，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度将在 1mg/mL 左右。

用法二：大量制备（主要用于上样量比较大的 2D 电泳等实验）
1、 收集 200-400 mL 过夜培养的细菌饱和培养液（OD420 在 1.5 左右即可），2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
2、 加入 20 mL 溶液 A，轻柔吹打，将细菌重悬于溶液 A 中。
3、 2500 g 室温离心 10 分钟后弃上清。
4、 加入 5 mL 溶液 B（必须已经提前加入了 DNase I 干粉），轻柔吹打使细菌重悬。注：如果细菌起始量没有 200-400 mL，溶液 A 的用量可以等比例降低。重悬在溶液 A 中的细菌可以放-80℃长期保存。
5、 用超声或 French Press 方法裂解细胞。如果用 French Press 方法，则需要处理至少两次，每次的压力为 9.65×10E7（=14000 psi）。注意：不论用哪种裂解方法，都必须在显微镜下检查细菌是否已经裂解，否则还需要重复细菌
裂解过程，直到 80%以上的细菌都裂解为止。
6、 2500g 室温离心 8 分钟后小心转移上清到干净的玻璃烧杯中，弃沉淀（未破裂细胞）。
7、 在上清（细菌裂解液）中加入 50 mL 预冷的溶液 C，轻轻在冰浴中搅拌混匀30-60 分钟。注：可以在大烧杯中装冰，然后将装有样品的小烧杯放入，在放入干净的搅拌子，以最低速度搅拌。
8、 用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
9、 小心移弃上清，在沉淀中加入 2 mL 溶液 A，充分吹打混匀。
10、用 Beckman Type 55.2 Ti 转头 115，000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致。
11、小心移弃上清，所得沉淀放-20℃长期保存或溶解在 1 mL 自备的，跟后续实验兼容的缓冲液（如 1×等电点电泳上样液，可从本公司购买），所得膜蛋白的浓度在 1mg/mL 左右。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！