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原理及特点 PCR 标记的原理是用带标记的 dNTP 进行 PCR，最后得到的 PCR 产物 将带有标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理的基础上开 发，它具有下列特点：
1. 一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2. 足够 10 次 50 uL 体系的常规 PCR（用于制备标记反应的模板和设置对 照反应）和 5 次 50 uL 体系的标记反应。
3. 一次标记可以得到ug级的双链DNA探针或约700ng 的单链DNA探针， 足够多次杂交实验用。
4. 既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
5. A 型需自备含标记核苷酸的 dNTP， B 和 C 型分别含生物素和地高辛标 记的底物。可用的自备标记底物包括 fluorescein-dUTP、 hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。
6. 掺入率一般为 4-5%，有效降低了空间阻碍，检测效果最佳。
7. 标记探针可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位杂交、菌落和斑 点印迹杂交等分析。
8. 本产品足够 5 次非标记 PCR 和 5 次标记 PCR（均指 50uL 体系）。
规格及成分
运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 DNA 模板和模板专一性引物。
使用方法 一：准备工作
1. 按常规的方法设计 PCR 引物，使探针长度在 400-800bp 之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 由于标记的 dNTP 比较珍贵，所以不推荐以基因组 DNA 或其他复杂 DNA为模板直接进行 PCR 标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记 PCR 产物，再以之为模板制备标记的 PCR 产物。
3. 对 A 型标记试剂盒，四种 10mM 的 dNTP 是分开提供，用于制备 50uL非标记 dNTP（2mM each，用于非标记 PCR，用于制备标记 PCR 的模板。配制方法是四种 10mM 的 dNTP 各加 10uL，再加水 10uL 即可）和 25uL 标记 dNTP（2mM each，其中标记核苷酸和对应的非标记核苷酸的比例需要自行优化，假如是 biotin 或 DIG 标记的是 dUTP，则其对
应的非标记核苷酸是 dTTP，两者的最佳比例一般为 1：3；如果是BrdUTP，则两者的最佳比例为 1：1。配制方法是三种 10mM 的 dNTP各加 5uL，再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为2mM，再补水到 25uL）。
二：非标记 PCR 产物的制备
4. 设置50uL非标记PCR：2×标记专用PCR Mix 25 uL，dNTP Mix（2mMeach）5uL，自备的探针引物（10pmol/uL）各 1uL，1 ug 基因组 DNA或 1ng 质粒 DNA，补超纯水到 50 uL。
5. 按已经优化的 PCR 参数进行常规 PCR。
6. 胶回 PCR 产物并定量，胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记 PCR。
三：标记 PCR 反应（最好做一个不加标记的对照用于定量）
注意：由于双链 PCR 探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记 PCR。
7. 按第 5 步的 PCR 参数进行标记 PCR，但需要进行下列修改：一是循环数 增加到 35-55 个循环。由于模板为纯化后的 PCR 产物，探针对扩增长度 完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好）， 所以可以增加循环数；二是延伸时间增加 15 秒，因为标记 dUTP 参入到 DNA 的速度比常规的 dTTP 慢；三是降低复性温度 5-7℃，因为标记核 苷酸参入到 DNA 后，新模板的 Tm 值将降低。
8. 标记探针的定量：取标记反应液和对照反应液 1-5 uL，在琼脂糖凝胶上 跟浓度已知的 DNA marker 一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记产 物中额外带有生物素，地高辛等、其泳动速度将慢于非标记 PCR 产物（但 同位素标记不能用此法）。下图是一个典型的双链 PCR 产物电泳结果图：
9. 剩余的 PCR 标记产物可以不经过纯化，直接加入（对单链 PCR 探针） 杂或加热变性并急冷后加入（对双链 PCR 探针）到杂交液中使用。也可 放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
