E.coli转化液

‍产品及特点‍ E.coli 转化液是本公司独家推出的不需要 E.coli 感受态细胞的转化液， 它能将质粒直接转化进入常态的 E.coli 细胞中，使用户不需为感受态细胞的购买、 制备、保存和运输等繁琐的事情操心，大大地缩短了转化的时间，提高使用者的工 作效率。本产品的特点如下：

1. 产品稳定，保质期至少三年。不需要干冰运输、不需要-80℃冰箱保存。

2. 一次转化可以多次涂盘（即涂盘 1/10 后，保存冰箱，如果需要可以再涂盘）。

3. 既可使用甘油菌，也可使用菌落进行转化。

4. 标准操作需 1 小时多，转化效率一般可达 10E7 cfu/ug，跟化学感受态细胞的 转化效率相当。

5. 极速操作只需要 10 分钟，效率比标准操作低 100 倍，可用于质粒转化保种。

6. 可用各种常见的 E.coli 菌种。

7. 可转化各种类型(长度、抗性、拷贝数)的质粒，也可转化各种连接反应液，但不 推荐用于文库构建。

8. 性价比高，由于不需要干冰运输和-80℃保存，所以邮寄和保存成本大大降低。 本规格足够至少 50 次转化（含对照样转化），每次转化的综合成本不到 15 元。

‍规格及成分‍

运输及保存 低温运输，-20℃保存。有效期三年。

自备试剂 灭菌的50%甘油(第一次使用时需要)、LB液体和固体培养基、相关抗菌素、E.coli宿主菌、质粒DNA或连接液。
使用方法 直接用甘油菌转化（推荐方法）
一、 甘油菌的制备
注意：不建议使用实验室的已有的、无生产记录的甘油菌。本试剂盒赠送E.coli
DH5a菌液一管，用户如果需要其他宿主菌，则需从本公司另行购买。北京基因有上百种E.coli菌种供选购。
1. 将本试剂盒的E.coli DH5a菌液或自备的其他宿主菌在LB固体培养基上划线。
2. 37℃过夜培养得单菌落。
3. 下班前将单菌落接种在3mL自备的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
4. 早上取接种过夜培养的细菌500uL到50mL LB液体培养基中（接种体积为终体积的1%），37℃准确培养六小时。
5. 六小时培养结束时加入等体积（50mL）的自备无菌50%甘油，充分摇匀得甘油菌。最好在加入50%甘油之前测量并记录OD600。
6. 在无菌条件下将甘油菌分装到无菌的1.5mL塑料离心管中，每管500uL，共约200管（足够约200次转化实验），放-20℃或-80℃保存待用，可保存3年左右。如果需要制备比200管更多或更少，则自行调整菌液和50%甘油的体积。甘油
菌在保存过程中不能反复冻融。
二、甘油菌的转化的（标准操作）
7. 将E.coli转化液放常温融化，充分摇晃均匀，冰上预冷待用。
8. 从-80℃冰箱中直接取N+2管上步制备的甘油菌（每管500uL），冰上融化。N是样品数，另外两只分别用于阴性对照和阳性对照。
9. 13,000g常温离心1分钟后，小心移弃上清，不要移弃管底的细菌沉淀。
10. 加入500uL的自备LB液体培养基轻柔重悬细菌。可以再在无菌条件下加入
10uL促转化剂（赠品），本产品可增加转化效率2倍左右。
11. 37℃水浴或金属浴30分钟。由于空气传热太慢，故不建议使用孵箱。孵育结束后的OD600在1.2左右最佳（如果是NanoDrop检测，应该在0.12左右）。

12. 常温13,000g离心1分钟后小心移弃液体培养基。
13. 再短暂常温离心，用移液枪小心将残留的液体培养基(约50 uL)吸出。
14. 加入100 uL 预冷的E.coli转化液，轻柔将细菌重悬。
15. 加入不超过总体积10%(即10uL)的质粒DNA溶液（10-100ng）或连接反应液。此转化液+细菌+质粒混合液下面简称转化混合液。
16. 在-20℃或-80℃冰箱放置直到冻凝成固体（一般需要5-20分钟，下同）。
17. 放常温融化后，再在-20℃或-80℃冰箱放置直到冻凝成固体。
18. 放常温融化后，将100uL的转化混合液全部或部分加入到500uL自备的LB液体培养基中。一般使用1/10，必要时可全部使用。剩下的转化混合液可以放-20℃或-80℃冰箱长期保存供下次恢复培养和涂盘。最后再加入10uL 50×LB添加
剂（赠品），它可以使转化效率提高2倍。
19. 37℃水浴或金属浴保温60分钟以让抗性基因表达。
20. 菌液在常温13,000g离心1分钟，去除适量上清使其剩下的培养基体积在50-100uL之间，重悬细菌后涂盘在含适当抗菌素的LB固体培养基上。
21. 将培养皿放37℃孵箱倒置培养16-24小时，对转化子进行筛选。
三、甘油菌的转化（极速操作，只适用于质粒转化保种）
22. 取出E.coli转化液放常温融化，充分摇晃均匀并放冰上待用。
23. 从-80℃冰箱中直接取甘油菌（每管500uL），冰上融化后标注样品号，对照等。
24. 融化后13,000g常温离心1分钟后，小心移弃上清。
25. 再短暂常温离心，用移液枪小心将残留的液体培养基(约50 uL)吸出。
26. 加入100uL 预冷的E.coli转化液，轻柔将细菌重悬。
27. 在样品管中加入不超过10uL的待转化的质粒。
28. 在-20℃或-80℃冰箱放置直到冻凝成固体（一般需要5-20分钟）。
29. 常温融化后，转移10uL转化液混合液到在含相关抗菌素的培养皿上，再加入50uL自备的LB液体培养基，直接涂盘。不加50uL LB液体培养基很难涂盘

30. 37℃孵箱倒置培养16-24小时。
直接用菌落转化
四、菌落的制备
31. 将本产品提供的E.coli DH5a菌液在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养得单菌落，这些菌落在一月内可以直接用于菌落的标准转化和极速转化（见五和六）。
本试剂盒含E.coli DH5a菌液一管，用户如果需要其他宿主菌，则需另行购买。
五、菌落转化的标准操作
32. 挑选20个单菌落（涂盘时间不超过1个月）到500uL LB液体培养基中轻柔混匀。
33. 接甘油菌转化的标准操作流程的第11步进行后续操作。
六、菌落转化的极速操作（比菌落标准操作效率低100倍，只适用于质粒转化保种）
34. 挑选20个单菌落（涂盘时间不超过1个月）到100uL预冷的转化液中轻柔重悬。
35. 接甘油菌转化的标准操作流程的第27步进行后续操作。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！