滤纸酶检测试剂盒 可见分光光度法

滤纸酶（FPA）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：50T/24S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1. 滤纸条：常温防潮保存。

2. 标准品：10mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水溶解，配成 10 mg/mL 葡萄糖溶液备用，2-8℃保存两周。

产品说明：

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖一类酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系。以不溶性纤维素如滤纸为底物测定的纤维素酶称为滤纸酶，研究滤纸酶活力对纤维素酶总体酶活力的研究的有着重要意义。

FPA 水解滤纸产生还原糖，还原糖与 3,5 -二硝基水杨酸反应生成在 540 nm 有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定 540 nm 处吸光值变化可计算得 FPA 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式低温离心机、水浴锅、1 mL 玻璃比色皿、超声破碎仪、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP 管（2 mL）。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）﹕蒸馏水体积(mL)为 1﹕5~10 的比例（建议称取约 0.1 g，加入 1 mL 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃，12000 rpm 离心 10 min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管中，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（104个）﹕蒸馏水体积（mL）为 500~1000﹕1 的比例（建议 500 万细胞或细菌加入 1 mL 蒸馏水），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3 min）；然后 4℃，12000 rpm 离心 10 min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。（若溶液有浑浊则离心后取上清进行测定）

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30 min 以上，调节波长至 540 nm，蒸馏水调零。

2、 将 10 mg/mL 标准液用蒸馏水稀释为 0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 mg/mL 的标准溶液备用。

3、 标准品稀释表

实验中每个标准管需200μL标准溶液。

4、 取 200 μL 样本沸水浴 10 min（盖紧，防止水分散失），放置常温后作为对照管。

5、操作表：(在 2 mL 离心管中操作，其中对照管与测定管用有滤纸的 EP 管，空白管与标准管无需滤纸)

三、FPA 活性计算

1、 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，mg/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，mg/mL）。

2、 FPA 活性的计算：

(1) 按蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 蛋白每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活（U/mg prot）=x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T=0.0333x÷Cpr

(2) 按样本质量计算

酶活定义：每 g 样品每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活（U/g 质量）=x×V 提取÷W÷T=0.0333x÷W

(3) 按照细胞或细菌数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活（U/10⁴ cell）=x×V 提取÷细胞数量（万个）÷T=0.0333x÷细胞数量（万个）

(4) 按液体体积计算

酶活定义：每 mL 样本每分钟分解滤纸产生 1 mg 葡萄糖为 1 个酶活力单位。

FPA 酶活（U/mL）= x×V 样÷V 样÷T=0.0333x

V 提取：提取液（蒸馏水）体积，1 mL；V 样：加入的样本体积，0.2 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间，30 min。

注意事项：

1. 用干净的镊子取出滤纸条，带手套将滤纸条卷成小卷放入 EP 管底部。

2. 当 A 或 ΔA 超过 1.2 时，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

3. 显色结束吸取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。

实验实例：

1、 取 0.1g 平菇伞部加入 1mL 蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃，12000 rpm 离心 10 min，取上清置于冰上待测。之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定=A 测定管-A 对照管=0.668-0.425=0.243，带入标准曲线 y=1.6716x-0.2189，计算 x=0.2763，按样本质量计算酶活得：

FPA 酶活（U/g 质量）=x×V 提取÷W÷T=0.0333x÷W=0.092 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！