果胶酶活性检测试剂盒 可见分光光度法

果胶酶活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂一：若溶液中有不溶解物质，可以 50℃水浴溶解。

2、标准品：10mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943mL 蒸馏水，配成 50μmol/mL 的标准液。

产品说明：

果胶酶（pectinase）是分解果胶的酶类，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于高等植物果实和微生物中，是水果加工中最重要的酶。

果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与 DNS 试剂反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质，测定 540nm 处吸光值变化可计算得果胶酶活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

2、菌类：按照细菌数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细菌（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、 将 50μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 6、5、4、3、2、1 μmol/mL 的标准溶液备用。

3、 取 125μL 样本沸水浴 10min 备用。

4、 样本测定（在1.5mL离心管中）：

三、果胶酶活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的△A 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA 带入方程得到 x（μmol/mL）。

2、 果胶酶活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算

酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。

果胶酶活性（U/mg prot）=x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T= 2x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每克样本每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。

果胶酶活性（U/g 质量）= x×V 提取÷W÷T=2x÷W

（3）按照细菌数量计算

酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每 104个细菌每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。

果胶酶活性（U/10⁴ cell）= x×V 提取÷T÷细菌数量（万个）=2x÷细菌数量（万个）

（4）按液体体积计算

酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每 mL 样本每小时分解果胶产生 1μmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。

果胶酶活性（U/mL）= x×V 样÷V 样÷T= 2x

V 提取：提取液体积，1mL； V 样：加入的样本体积，0.125mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间：0.5h。

注意事项：

1、 A 大于 1.5 时，建议将样本用提取液稀释后再进行测定。

2、 植物果实组织建议将样本稀释 10 倍或 20 倍后再测定。

实验实例：

0.1g 猕猴桃加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上稀释 10 倍后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA= A 测定管-A 对照管=1.465-1.45=0.015，依据标准曲线 y=0.2575x-0.2214，计算得 x=0.918μmol/mL，按样本质量计算酶活得：

果胶酶活性（U/g 质量）=2x÷W×10（稀释倍数）= 183.6 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！