β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:本产品试剂有所变动,请注意并严格按照该说明书操作。
规格:50T/24S
产品组成:使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致
![image 2022060512104454381](https://shxybio.net/upload/ueditor/image/20220605/2022060512104454381.png)
溶液的配制:
1、试剂一:临用前取 1 瓶加入 2.67mL 蒸馏水,充分溶解;用不完的试剂-20℃分装保存 4 周,避免反复冻融。
2、标准品:5μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能够催化β-半乳糖苷化合物中β-半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。
β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL 活性。
![image 2022060512110236844](https://shxybio.net/upload/ueditor/image/20220605/2022060512110236844.png)
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、超声破碎仪、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30min 以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2、标准溶液的稀释:用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表:
![image 2022060512115101974](https://shxybio.net/upload/ueditor/image/20220605/2022060512115101974.png)
充分混匀,于400nm 处测定吸光值A,分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管。计算ΔA测定=A测定管-A对照管,ΔA标准=A标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管。标准曲线和空白管只需测1-2次。
三、β-GAL活性计算
1、标准曲线的建立:
根据标准管的吸光度(x,ΔA标准)和浓度(y,nmol/mL)建立标准曲线,将ΔA(x,ΔA测定)带入标准曲线中,计算样本生成的产物量y(nmol/mL)。
2、β-GAL活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg 组织蛋白每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr
(2)按样本质量计算:
单位的定义:每g 组织每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/g 质量)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20×y÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.04×y
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度需要另外测定;V 反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,0.5h。
注意事项:
提取液中含有使蛋白变性的成分,故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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