α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测试剂盒 可见分光光度法

α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、试剂一：临用前取 1 瓶加入 2.67 mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；

2、标准品：5 μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。

产品说明：

α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α-半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。

α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、超声破碎仪、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 1000 万细菌或细胞加入 1mL

提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。

2、组织的处理：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将标准液用蒸馏水稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL标准溶液待测。

3、 标准液稀释可参考下表：

三、α-GAL活性计算

1、标准曲线的建立：

根据标准管的吸光度（y，ΔA标准）和浓度（x，nmol/mL）建立标准曲线，将ΔA（y，ΔA测定）带入标准曲线中，计算样本生成的产物量x（nmol/mL）。

2、α-GAL活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr

（2）按样本质量计算

单位的定义：每g 组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/g 质量)=(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W

（3）按细菌或细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

α-GAL活力(U/10⁴ cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需要另外测定；V反总：反应体系总体积，0.5mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；1000：细胞或细菌总数，1000万；T：反应时间，0.5h。

注意事项：

提取液中含有使蛋白变性的成分，故按蛋白浓度计算时需要重新提取蛋白进行测定。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！