酰基转移酶(AAT)活性检测试剂盒 可见分光光度法

酰基转移酶（AAT）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

规格：10T/9S、25T/24S、50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

产品说明：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织样本：称取约 0.1g 样本加提取液 1mL，冰上充分研磨，15000g 4℃离心 20min，上清液待测。血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。

2、 试剂一在37℃水浴保温20min以上。

3、 样本测定：

将上述试剂按顺序加入 1mL 玻璃比色皿中，加试剂四的同时开始计时，在 412nm 波长下记录 10s 时的初始吸

光度 A1 和 130s 后的吸光值 A2，计算 ΔA 空=A2 空-A1 空；ΔA 测=A2 测-A1 测，ΔA=ΔA 测-ΔA 空。

三、AAT活性计算

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：37℃中每mL反应体系下每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。

AAT (U/mg prot) =ΔA÷0.001÷(Cpr×V样) ÷T=5000×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本质量计算

单位的定义：37℃中每mL反应体系下每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。

AAT (U/g 质量) =ΔA÷0.001÷(V样÷V样总×W) ÷T=5000×ΔA÷W

3、按血清浓度计算

单位的定义：37℃中每mL反应体系下每mL血清每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1个酶活单位。

AAT (U/mL 血清) =ΔA÷0.001÷V样÷T=5000×ΔA

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；W：样本质量，g；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，2min。

注意事项：

1、 上清液蛋白质含量需要另外测定。

2、 当吸光值大于1时，建议稀释后测量。

3、 如果ΔA测偏低，可以延长反应时间，如测定10s和310s的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。

实验实例：

1、 取0.1g肾脏加入1mL提取液进行样本处理，取上清后稀释4倍后按测定步骤操作，测得ΔA空=A2空-A1空=0.105-

0.101=0.004、ΔA测=A2测-A1测=0.665-0.479=0.186、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.186-0.004=0.182，按样本质量计算酶

活得：

AAT (U/g 质量) =5000×ΔA÷W×4（稀释倍数）=36400 U/g 质量。

2、 取兔血清直接按照测定步骤操作，测得ΔA空=A2空-A1空=0.105-0.101=0.004、ΔA测=A2测-A1测0.622-

0.521=0.101、ΔA=ΔA测-ΔA空=0.101-0.004=0.097，按血清体积计算酶活得：

AAT (U/mL 血清) =5000×ΔA=5000×0.097=485 U/mL 血清。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！