3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活性检测试剂盒 紫外分光光度法

3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格: 25T/24S、50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂三：液体置于试剂瓶内 EP 管中。根据用量按照试剂三:蒸馏水为 3:100 的体积比例充分混匀，现用现配。

2、 工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，根据需要取一定的量 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

GAPDH（EC1.2.1.12）催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3-二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3-二磷酸甘油酸和NADH 生成 3-磷酸甘油醛、无机磷和 NAD+，340nm 处测定 NADH 的减少量可反映 GAPDH 活性的高低。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 操作表（在 1mL 石英比色皿中分别加入下列试剂）：

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.001L；V样：反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度请自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：5min；500：细菌或细胞总数，500 万；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

注意事项：

1、 当 A1 小于 0.8 或 ΔA 大于 0.7 时，建议将样本稀释后再进行测定。

2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.01。

实验实例：

1．取 0.1g 兔肾脏加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=0.815-0.158=0.657，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.656，按样本质量计算酶活得：GAPDH 酶活（U/g 质量）=1072×ΔA÷W=7032.32 U/g 质量。

2．取 0.1g 三叶草加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 20min，取上清置冰上，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA 测定管=A1 测定-A2 测定=1.026-1.017=0.009，ΔA 空白管=A1 空白-A2 空白=0.865-0.864=0.001，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.008，按样本质量计算酶活得：GAPDH 酶活（U/g 质量）= 1072×ΔA÷W=85.76 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！