β-淀粉酶活性检测试剂盒 可见分光光度法

β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒说明书（DNS 显色法）

可见分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用；

2、 试剂二：临用前取 1 支试剂三加入到 1 瓶试剂二中，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉剂至溶解，用不完的试剂 2-8℃保存 4 周；

3、 标准品：10 mg 无水葡萄糖。临用前加入 1 mL 蒸馏水配制成 10 mg/mL 的标准溶液，2-8℃保存两周。

产品说明：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 样本，加入 0.8mL 蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取 15min，每 5min 振荡 1 次，使其充分提取；6000g，常温离心 10min，取上清液加蒸馏水定容至 10mL，摇匀，即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α+β）淀粉酶总活力的测定。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2. 标准液的稀释：将10mg/mL葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。

3. 标准液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需 250μL 标准溶液。

4. 取2支EP管分别加入250μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液，沸水浴5min，分别作为α-淀粉酶对照管和总淀粉酶对照管使用。

5. 按操作表依次加入各试剂：

三、酶活性计算

1. 标准曲线的绘制：

以标准液的浓度（mg/mL）为x轴，对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔAα代入方程得到x₁（mg/mL），ΔA总代入方程得到x₂（mg/mL）。

2. α-淀粉酶活性：

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x₁×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x₁÷W 

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x₁×V样÷（V样×Cpr）÷T=0.2×x1÷Cpr

3. 总淀粉酶活性计算：

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×x₂×V样÷(W×V样÷V样总) ÷T=10×x₂÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷（V样×Cpr）÷T=x2÷Cpr

4. β-淀粉酶活性计算：

（1）按照样本质量计算

单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性（U/g 质量）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=（10×x₂÷W）-（2×x₁÷W）=（10×x₂-2×x₁）÷W

（2）按照蛋白质含量计算

单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性（U/mg prot）=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=（x₂÷Cpr）-（0.2×x₁÷Cpr）

5：总淀粉酶稀释倍数，（4mL+1mL）/1mL=5；V样：加入反应体系中样本体积，0.25mL；V样总：提取液总体积，10mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。

注意事项：

测定的吸光值大于1时，可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小，可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！