乙醇酸氧化酶活性检测试剂盒 紫外分光光度法

乙醇酸氧化酶（GO）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入 6 mL 双蒸水溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

产品说明：

乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是乙醇酸循环中的一种酶，也是植物光呼吸代谢中的关键酶，催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，通过测定乙醇酸氧化酶活性，可以了解植物光合和呼吸代谢的基本方法。乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和盐酸苯肼反应生成乙醛酸苯腙，在 324nm 有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、可调式移液枪、1mL石英比色皿、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置冰上待测。细胞或细菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计30min以上，调节波长至324nm，蒸馏水调零。

2. 将试剂一25℃预热15min。

3. 样本测定：1mL石英比色皿中分别加入下列试剂：

三、GO 酶活计算

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO 酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×10⁹÷（V 样×Cpr）÷T=392.16×ΔA÷Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每克组织每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO 酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×W÷V 样总）÷T=392.16×ΔA÷W

3、按细胞数量计算

酶活定义：每万细胞每分钟生成 1nmol 乙醛酸苯肼所需的酶量为一个酶活力单位。

GO 酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V 反总×109÷（V 样×500÷V 样总）÷T=0.784×ΔA

ε：乙醛酸苯腙毫摩尔消光系数：17000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，0.001L；V 样：

反应中样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：

样本质量，g；T：反应时间，3min；500：500 万个细胞；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、 测定之前进行预实验，若吸光值 A1>1，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2、 色素含量较高的样本，可在提取酶时加活性炭吸附。

3、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，其 OD 值变化不超过 0.02。

实验实例：

1. 称取约 0.1g 三叶草组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清进行检测，测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.868-0.773=0.095，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.027-0.013=0.014，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.095-0.014=0.081，按样本质量计算酶活得：

GO 酶活（U/g 质量）=392.16×ΔA÷W=317.6496 U/g 质量。

2. 称取约 0.1g 菠菜组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清稀释 2 倍进行检测，测得 ΔA 测定管=A2 测定-A1 测定=0.873-0.778=0.095，ΔA 空白管=A2 空白-A1 空白=0.027-0.013=0.014，ΔA=ΔA 测定管-ΔA 空白管=0.095-0.014=0.081，按样本质量计算酶活得：

GO 酶活（U/g 质量）=392.16×ΔA÷W×2（稀释倍数）=635.2992 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！