可溶性淀粉合成酶(SSS)活性检测试剂盒 紫外分光光度法

可溶性淀粉合成酶（SSS）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：25T/24S、50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂四：临用前加入 5 mL 试剂一溶解。

2、 试剂五：临用前加入 8 mL 试剂一溶解。

3、 试剂六：临用前取 1 支加入 208 μL 双蒸水，充分溶解备用，用不完的试剂 4℃保存。

4、 试剂七：可分装后-20℃保存，不可反复冻融。

5、 试剂八：临用前加入溶解好的 4 mL 试剂四。

6、 反应液Ⅰ：临用前在试剂二中加入 7 mL 试剂一，缓慢加热，逐渐升温使其溶解，冷却后加入试剂三混合溶解。

产品说明：

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。SSS 催化 ADPG 与淀粉引物（葡聚糖）反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为 NADPH，NADPH 生成量与前一步反应中 ADP 生成量呈正比，340nm 下测定 NADPH 增加量即可计算 SSS 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液枪、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

称取约 0.1g 组织加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心 10 分钟，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2. 样本测定：在EP管内按顺序加入

混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1和 2min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意：反应液Ⅰ如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

三、SSS 活性计算

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS（U/mg prot）=[ΔA÷（ε×d）×V 测]÷(Cpr×V 样本÷V 反总×V 上清) ÷T=43.2×ΔA÷Cpr此法需要自行测定粗酶液蛋白质浓度。

2、按照样本质量计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS 活性（U/g 质量）=[ΔA÷（ε×d）×V 测]÷(W÷V 提取×V 样本÷V 反总×V 上清) ÷T=43.2×ΔA÷W 

V 测：测量体积，0.78mL；V 反总：反应体积，0.62mL；V 提取：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；ε：NADPH 消光系数，6.22×10-3mL/(nmol˙cm)；d：石英比色皿光径，1cm；V 样本：加入样本的量，0.2mL；V 上清：吸取上清液的量，0.45mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

实验实例：

1、 取约 0.1g 肝脏加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心 10 分钟，取上清置冰上待测。之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA=A2-A1=0.394-0.211=0.183，按样本质量计算酶活得：SSS 活性（U/g 质量）=43.2×ΔA÷W=79.056 U/g 质量。

2、 取约 0.1g 冬青加入 1mL 提取液，冰浴中匀浆。10000g，4℃离心 10 分钟，取上清置冰上待测。之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA=A2-A1=1.31-1.303=0.007，按样本质量计算酶活得：SSS 活性（U/g 质量）=43.2×ΔA÷W=3.024 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！