胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)活性检测试剂盒 紫外分光光度法

胞浆异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）活性检测试剂盒说明书

紫外分光光度法

规格：50T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1．试剂一：用时加入 50 mL 提取液溶解；

2．试剂二：用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用；

3．试剂三：用时每支加 275 μL 双蒸水充分溶解备用；

4．工作液配制：将试剂一、试剂二、试剂三按 85：1：1 的比例混合，现用现配。

产品说明：

ICDHc（EC 1.1.1.42）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸，同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源，在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应，在 340nm 下测定 NADPH 浓度的增加，即可反映 ICDHc 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌、细胞或组织样本的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取

液，超声波破碎细菌或细胞（功率 20%，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰

上待测。

组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样本：直接检测。

二、测定步骤

1. 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2. 按下表步骤加样：

将上述试剂按顺序加入 1mL 石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1；迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃水浴中，准确反应 2 分钟；迅速取出比色皿并擦干，记录 2 分 20秒时的吸光度 A2。计算 ΔA=A2-A1。

三、ICDHc 活力单位的计算

1、血清（浆）ICDHc 活力的计算

单位的定义：每 mL 血清（浆）在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mL）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷V 样本÷T=1608×ΔA

2、组织中 ICDHc 活力的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=1608×ΔA÷W

3、细菌或培养细胞中 ICDHc 活力的计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc（U/10⁴ Cell）=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样本×500)÷T=3.2×ΔA

V 反总：反应总体积，0.001L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/moL/cm；d：石英比色皿光径，1cm；V样本：加入样本体积，0.05mL；V 提取：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min；500：细菌或细胞密度，500 万/mL。

注意事项：

1、若 A2-A1 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，使 A2-A1 小于 0.5，可提高检测灵敏度。若初始值 A1 大于 0.5 可尝试将酶液用提取液稀释。

2、实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活；工作液 37℃水浴放置。

3、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃，取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

4、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

实验实例：

1. 取 0.1g 稗草，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 8000g 4℃离心 10min，取上清，之后按照测定步骤操作，

测得计算 ΔA=A2-A1=0.240-0.224=0.016，按样本质量计算酶活得：

ICDHc（U/g 质量）=1608×ΔA÷W=257.28 U/g 质量。

2. 取 0.1g 小鼠肺部组织，加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，然后 8000g 4℃离心 10min，取上清稀释 5 倍，之后按照测定步骤操作，测得计算 ΔA=A2-A1=0.253-0.141=0.112，按样本质量计算酶活得：

ICDHc（U/g 质量）=1608×ΔA÷W×5=9004.8 U/g 质量。

3. 取小鼠血清样本直接检测，测得计算 ΔA=A2-A1=0.225-0.2=0.025，按血清计算得：

ICDHc（U/mL）=1608×ΔA=40.2 U/mL。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！