磷酸化蛋白富集试剂盒

产品概述

磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析（IMAC）的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。 本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。 经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE 和protein arrays等下游应用。

保存温度

2-8℃

注意事项

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。

2.蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

一年

检测方法

磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF,

WB,IP,EMSA等

适用样本

动物细胞/组织

产品应用

磷酸化蛋白质谱,2-D,IEF,

WB,IP,EMSA等

仪器准备

1.离心机

2.振荡器

3.匀浆机/匀浆器

4.涡旋混匀器

5.移液器

6.冰箱

7.冰盒

试剂准备

1.PBS缓冲液

2.蛋白定量试剂盒

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

使用注意事项

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。 2.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。 3.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。 4.蛋白样品中不可含EDTA。 5.蛋白样品不可以含有DTT，β-ME。 6.上样蛋白样品pH值必须低于6，蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。 7.洗涤细胞和组织是不能用PBS等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris等或生理盐水。 8.可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。 9.每个新柱的载量约为1mg磷酸化蛋白，使用过的柱子经过再生反复使用的，载量会有下降。 10.用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个50ml离心管离心即可。 11.最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。

使用方法

一、蛋白样品的准备：

以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值低于6。

可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。

细胞裂解：

1. 提取液制备：

每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2. 取5-10×106个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4. 每5×106个细胞中加入500ul冷的蛋白裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-40分钟。

5. 在4℃，14000×g条件下离心15分钟。

6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

组织裂解：

1. 提取液制备：

每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2. 取100mg组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

3. 将匀浆液在4℃条件下振荡15-30分钟。

4. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，14000×g条件下离心15分钟。

5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

植物蛋白提取：

1、 裂解液制备：

每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2、 取200mg植物组织样本，去除粗筋脉络等后剪碎，置于研钵中用液氮研磨。（没有液氮也可直接用裂解液置冰上研磨即可）

3、 研磨后加入500ul提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡30分钟-1小时。

4、 在4℃，14000×g条件下离心10-15分钟。

5、 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

细菌蛋白提取：

1、 裂解液制备：

每500ul冷的裂解液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和2ul磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

2、 在4℃， 12000×g条件下将菌液离心5min，弃上清，尽量吸干剩余液体，收集菌体。

3、 用生理盐水洗菌体2次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。

4、 按每20-50mg湿重菌体样本加入500ul裂解液，吹打混匀，4℃条件下振荡30-45分钟。

5、 在150w-300w，10s超声/10s间隔条件下冰浴超声至菌液变清。

6、 在4℃， 12000×g条件下将菌液离心15分钟，将上清移入冷的干净离心管。

7、 即得到细菌总蛋白样品。

二、柱平衡：

加入500ul洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。

三、上样：

将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。

四、洗柱：

加入300ul洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。

五、洗脱：

加入500ul磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。

六、柱保存和柱再生：

载量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1ml 0.1M EDTA溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

再生使用时，加入0.1M 氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料1小时，即可对蛋白柱进行再生。然后用0.1M乙酸溶液洗柱即可。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！