细胞耗氧率检测试剂盒（R01荧光探针法）

产品概述

细胞氧气消耗检测试剂盒（Oxygen Consumption Assay Kit / Oxygen Consumption Rate Assay Kit / OCR Assay Kit）是利用合成的特异性氧气荧光探针R01来检测细胞外耗氧情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行耗氧量测定。 耗氧量分析是研究代谢的有用工具。耗氧量测量结果是细胞代谢功能，更具体而言是线粒体功能的关键性指示。通过这类指标来探究活细胞代谢，可为细胞功能以及代谢变化在疾病进展中的作用提供深入洞察。 线粒体功能对细胞代谢、存活和能量产生至关重要。线粒体呼吸受损与病理状态（如癌症、缺血性再灌注损伤和神经退行性疾病）有关。线粒体毒性也是安全相关的抗药性和药物戒断症状的常见原因。 R01耗氧量分析可以实时测量全细胞或分离线粒体的耗氧量，是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞呼吸以及评估治疗对线粒体功能毒性作用的一种可靠方法。 它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行有氧代谢的简单动力学测定。随着呼吸作用的进行，溶解氧被消耗，样品中的氧气浓度降低，导致R01 分析的信号增加，从而实现对耗氧量的测定。

保存温度

2-8℃ 避光

注意事项

1.探针-20℃密封避光保存；

2.避免反复冻融。

3.注意防止氧化；

4.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

6个月

检测方法

荧光酶标仪

适用样本

细胞，分离的线粒体等

产品特点

1.广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞，还能测定悬浮细胞、微生物和特定的 3D 培养物；

2.简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；

3.可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；

4.可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；

5.以高通量的形式方便地测量；

6.无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

产品应用

线粒体功能和细胞代谢研究

仪器准备

1.荧光酶标仪

须配备相应的波长过滤器和温度控制器。

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.黑色透明底荧光专用96孔培养板

2.离心管

3.吸头

4.一次性手套

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3.以下操作以96孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O2荧光探针终浓度25倍稀释最jia。

4.R01探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞呼吸速率，建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点，并根据需要减少细胞数量。

5.并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。

6.必须使用荧光培养专用的透明底黑色培养板，减少检测时各孔之间的光互相干扰。

7.用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。

8.添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。

9.尽可能使用多通道移液器添加试剂。

10.如果药物有红色荧光（如阿霉素等）需要换液，不含培养基和待测药物，用HBSS或PBS体系检测，在无血清无酚红环境检测。

11.建议设定FCCP处理的阳性对照样本。

使用方法

关于仪器设置：

? 温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。

? 常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最jia激发波长使用450-460 nm，发射波长使用586-600 nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。

? 具有检测增益参数（PMT，Parameters）的通常设置为中或高。

? 使用bottom read读数和top read读数均可，基于不同的细胞模型，建议在预实验时两种读数模式均尝试下，看哪种的趋势更加明显。

关于氧气封闭液使用：

? 氧气封闭液可以用移液器吸取添加，添加时需要沿着培养板壁慢慢加入，使其顺板壁向下流到培养基表面。

? 也可以直接用滴瓶滴加，倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力，使封闭液足以充注瓶尖。 每个孔滴两滴，使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。

? 使用移液器添加封闭液时，可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离坚端3-4 mm处45°角修剪处理。

? 取下滴管瓶内嘴盖，轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于细胞培养：

? 对于贴壁细胞，在200 μL培养基中的96孔板中接种细胞。在37°C的CO2培养箱中孵育过夜。

? 对于悬浮细胞，在检测当天在100 μL培养基中接种。

? 注意所需的接种密度取决于细胞类型。 我们推荐进行细胞接种密度预实验以确定最jia密度。通常从高细胞密度（通常为60,000）开始，每孔的最jia细胞数一般为：贴壁细胞每孔80,000个细胞，悬浮细胞每孔5-6 x 105（96孔板）。

? 检测待测样品都设置3复孔。

? 注意始终在每个96孔板上留出至少6个孔，以免添加细胞作为空白对照和信号控制孔。

1. 准备细胞模型。

2. 培养好的待检测细胞移除培养基，用PBS洗涤细胞。

3. 加入100 μL新鲜培养基。

4. 加入4 μL R01氧荧光探针，充分混匀。

5. （可选）可以在此处添加待测试化合物（通常为1-10μL）（如果需要的话）。

6. 每孔加入100 μL氧气封闭液。

7. 然后用该细胞板进行荧光细胞外O2消耗变化情况检测。

激发波长455 nm - 468 nm，发射波长603 nm。测定荧光强度，每2分钟或3分钟读取一次。

8. 绘制耗氧率曲线。

9. 计算每个样品的斜率值。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！