633-Phalloidin染色试剂盒（红色荧光）

产品概述

细胞骨架染色试剂盒采用丝状肌动蛋白F-actin荧光染色法染色细胞骨架，可以用于各种动物、植物的细胞骨架染色。 本试剂盒采用荧光探针633标记的鬼笔环肽（Phalloidin）标记骨架蛋白F-actin。FLUOR 633为红色荧光探针，也为客户提供绿色和蓝色荧光的C11-Phalloidin和C13-Phalloidin标记试剂盒。可以满足您完整的F-Actin微丝蛋白荧光染色方案，为您提供极大的选择空间和便利。 细胞骨架(cytoskeleton）是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。细胞骨架肌动蛋白是球形的、大约42kd的蛋白，在几乎所有的真核细胞都存在。这是一个非常保守的蛋白，在各物种差异不超过20%。肌动蛋白是两种细胞内丝状结构的构成单体：微丝（三种主要的细胞骨架成分之一），以及细肌丝（是肌肉细胞收缩复合物的一部分）。肌动蛋白参与很多重要的细胞功能，包括肌肉收缩，细胞移动，细胞分裂和胞质分裂、小泡和细胞器的运动、细胞信号，以及细胞连接和细胞形态的保持和建立。 显示细胞骨架的常用方法有两种：骨架蛋白染色法和免疫荧光染色法。骨架蛋白染色法具有简单易行的特点，但不能区分骨架蛋白的组成，有些类型的纤维太细,在光学显微镜下无法分辨，常用于骨架形态及完整性研究；免疫荧光染色法可特异显示骨架蛋白，是用一种微丝解聚抑制剂,它与肌动蛋白纤丝有强亲和作用,使肌动蛋白纤丝稳定,抑制解聚,且只与F-actin结合.因此,利用荧光标记可以清晰显示细胞中微丝的形态,利用荧光显微镜对荧光标记的细胞骨架进行观察,可以得到清晰的实验结果.具有更普遍的应用意义。 没有荧光观察条件，需要常规骨架蛋白染色试剂盒。 鬼笔环肽（Phalloidin）是一种来源于毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）的环状七肽毒素，以高亲和力（Kd= 20 nM）选择性结合于丝状肌动蛋白F-actin，而不会与单体肌动蛋白G-actin结合，通常用来标记组织切片，细胞培养物或无细胞体系中的F-actin，从而对F-actin进行定性和定量分析。另外，鬼笔环肽衍生物也以相近的亲和力结合于大小纤维，无论是动植物来源的肌肉细胞或非肌肉细胞，按照每一个肌动蛋白亚基约与一个鬼笔环肽分子的计量比结合。且非特异性结合几乎可忽略，染色区域和非染色区域辨识度非常明显。因此，鬼笔环肽衍生物特别适合替代肌动蛋白（Actin）抗体进行相关研究。另外鬼笔环肽衍生物很小，直径约12-15?，分子量＜2000 Daltons，未标记肌动蛋白（Actin）的许多生理特性都得以维持，比如，同肌动蛋白结合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能发生反应；鬼笔环肽标记的纤维丝仍可穿透固相肌球蛋白基质；以及甘油抽提的肌纤维标记后仍可收缩等。鬼笔环肽（Phalloidin）的结合阻止丝状肌动蛋白（微丝）的解离，稳定微丝结构，从而破坏微丝的聚合-去聚合的动态平衡。此特性使得肌动蛋白聚合发生的临界浓度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一种聚合促进剂。此外，鬼笔环肽还可抑制F-actin的ATP水解活性。 用荧光标记的鬼笔环肽染色可以清晰地显示细胞中微丝的分布。将鬼笔环肽注射到细胞中同样能阻止细胞运动，可见微丝的功能依赖于肌动蛋白的组装和去组装的动态平衡。鬼笔环肽这种性质使得它们成为一种探索F-Actin分布的的良好工具，可以通过用带有各种荧光探针的鬼笔环肽结合Actin丝状物在荧光显微镜下观察来实现。鬼笔环肽的荧光衍生物已经被证明在活体或固定细胞内定位Actin丝状物和在体外观察actin丝状物的实验中起重要作用。 FLUOR 633-Phalloidin染色反应特异性强，对比性高，具有比Actin抗体更好的染色效果，适合用作F-actin的定性和定量检测。另外，经本品结合后的F-actin仍能维持actin自身具有的许多生物学特性。且本品的结合没有物种差异性，适用性广泛。FLUOR 633-Phalloidin可以广泛用于固定、通透性细胞，但也可以进入活细胞中。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.染料长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。

2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

有效期

6个月

检测方法

荧光显微镜/激光共聚焦

适用样本

动物细胞

产品应用

荧光显微镜/激光共聚焦

仪器准备

1.荧光显微镜/激光共聚焦

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

1.PBS缓冲液

2.固定液4%多聚甲醛

3.透化液0.05-0.1% Triton X-100（溶于PBS）

4.100 nM DAPI溶液

5.盖玻片周围密封液（如透明指甲油）

6.纯水

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.载玻片和盖玻片

4.一次性手套

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。

2.标本应新鲜，且未受其他化学物品污染。

3.应根据组织、细胞类型不同调整通透时间。

4.动物细胞样本细胞通透剂处理的时间很关键，如果处理时间太短，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂，造成细胞空洞。通透时间应控制在10-35分钟。需要根据预实验的染色结果确定最佳通透时间。一般预实验起始通透时间植物样本为10分钟，动物细胞样本5分钟。

5.染色液染色时间根据根据预实验结果可以进行调整，颜色过浅可延长染色时间，颜色过深可缩短染色时间。

6.洗片时动作要轻柔，避免将细胞从玻片上洗掉。

7.染色后用水充分洗涤，自然晾干即可，不能用常规的酒精梯度脱水方法。

8.不同样本的操作方法稍有差异，请根据具体样本操作。

9.下面以细胞爬片/涂片样本的染色为例，滴加相应的试剂到玻片上，加样量以覆盖样本即可。如果是植物切片等，也可以在离心管、试管等里面进行洗涤、通透、染色等操作，最后置载玻片上观察即可。

使用方法

1. 染色工作液配制：

根据样本数量，用染料稀释液将FLUOR 633-Phalloidin荧光染料10倍稀释。

再用相应的无血清培养基或其他缓冲液（如HBSS、PBS等）将荧光染料进行10倍稀释，配制成染色工作液。

2. 将制作好的细胞爬片/细胞涂片用37℃预热的1×PBS（pH 7.4）清洗2次。

3. 细胞固定：滴加溶于PBS的4%甲醛溶液进行细胞固定，室温固定5分钟，立即用PBS洗涤3-5次。

4. 室温条件下，透化细胞：滴加0.05-0.1% Triton X-100/PBS溶液透化处理样本，处理3-5分钟。

5. 室温条件下，用PBS洗细胞3-5次，自然晾干。

6. 室温条件下，染色：用适量细胞骨架染色液工作液，覆盖住玻片上的细胞，室温避光孵育40分钟-更长时间，最长可以过夜染色，一般40分钟-1小时即可。

7. 用PBS洗细胞3次，每次5分钟。自然晾干。

8. 使用适量浓度为100 nM 的DAPI溶液对细胞核进行复染，约30秒即可。

9. 用PBS洗细胞。

10. 用激光共聚焦显微镜观察。FLUOR 633-Phalloidin激发/发射波长633/650nm和DAPI激发/发射波长359-364/454-461nm。

染色结果：

细胞骨架纤维呈红色。细胞核呈蓝色（如果DAPI复染）。

细胞核和细胞质表面分布许多排列不规则的纤维束，走向清晰。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！