亚硝酰氢（HNO）检测试剂盒-蓝紫色荧光

产品概述

亚硝酰氢（HNO）检测试剂盒是一种利用荧光探针O73进行亚硝酰氢检测的试剂盒。O73探针可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，在亚硝酰氢存在的条件下，O73探针被氧化生成荧光物质，绿色荧光强度与细胞内亚硝酰氢水平成正比，检测绿色荧光强度就可以知道细胞内亚硝酰氢的水平。 在激发波长366 nm，发射波长406 nm附近，使用荧光酶标仪、荧光分光光度计、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O73荧光强度，从而测定细胞内亚硝酰氢水平。 O73荧光探针对亚硝酰氢（HNO）有较高的选择性，但是也会与活性羟基反应。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。 亚硝酰氢（HNO）是活性氧家族的一员，在一系列生理病理过程中起着重要的作用，包括调节细胞内氧化还原信号传递过程，增强心肌的收缩能力，抑制血小板聚集等。亚硝酰氢(HNO)是一氧化氮(NO)的单电子还原及质子化形式。近年来,随着人们对HNO不断深入的了解，越来越多的研究结果表明，HNO具有独特的生物活性和药理学应用，HNO具有潜在的治疗心力衰竭的作用，具有抗炎作用，还可以抑制醛脱氢酶的活性，治疗酒精中毒，减轻缺血再灌注损伤等。因此，开发能检测生物体中HNO的高效方法具有重要意义。检测HNO的传统分析方法由于存在预处理的复杂和对生物样品侵入性损伤等缺点，使得这些方法不适用于检测活体系中的HNO。荧光探针因具有响应快，选择性高，生物兼容性好等优点，被广泛用于生物分子的检测。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 还可以为您提供各种细胞样本、组织、冰冻切片样本的活性氧、活性氮等各种颜色的检测试剂盒产品。 可以提供各种细胞分析试剂盒。包括细胞凋亡、活性、增殖、毒性、活性氧、周期、细胞代谢、氧化应激、膜流动性、膜电位、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、胞外酸化、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种细胞检测试剂盒产品。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.避免反复冻融。

2.可以根据需要分装后冻存。

3.探针为DMSO溶液，在2-8℃时是固体状态，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

有效期

6个月

检测方法

1.流式细胞仪2.荧光显微镜3.激光共聚焦

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品特点

1.使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测或激光共聚焦显微镜直接拍照分析；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

仪器准备

1.激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.荧光检测专用黑色96孔板

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

5.O73染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

6.使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

7.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

8.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最jia条件。以下方法仅供参考。

9.酚红对O73荧光探针的检测有干扰，需避免。

10.染色后立即进行分析。

11.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O73探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。

12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

使用方法

探针染色工作液配制：

根据样本数量，用HBSS将O73荧光染料100-500倍稀释，配制成染色工作液。

细胞探针标记

2.1 对于贴壁细胞，可以进行原位标记

1）培养皿/培养板准备细胞样本。

2）待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育20分钟～40分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。

4）荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最da激发/发射波长为366 / 406 nm。

2.2 对于悬浮细胞

1）离心，吸除上清。

2）利用37℃预热的探针工作液100-200 μl重悬细胞，于生长状态下孵育20分钟～40分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。

4）流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最da激发/发射波长为366 / 406 nm。

检测：

1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。

4. 使用366 nm激发波长，406 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

5. 荧光强度强，亚硝酰氢含量高。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！