单线态氧检测试剂盒-细胞
产品概述
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢(H2O2,Hydrogen peroxide)、羟基自由基(•OH,Hydroxyl radical)、单线态氧(1O2,Singlet oxygen)、一氧化氮(NO,Nitric oxide)、超氧阴离子(•O2-,Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ,Peroxyl radical)、过氧羟自由基(HOO• ,hydroperoxyl)及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子(ONOO-,Peroxynitrite anion)、ClO-和羟化物等,参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果,在呼吸链中,在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应,在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧:“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B),同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C),生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D),在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E),超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 单线态氧检测试剂盒是利用单线态氧特异性荧光探针单线态氧探针O22检测单线态氧的试剂盒。单线态氧探针O22是合成的苯蒽类荧光探针,可以自由穿过细胞膜,进入细胞内后,与细胞内单线态氧反应,被氧化生成绿色荧光物质,绿色荧光强度与细胞内单线态氧水平成正比,检测绿色荧光就可以知道细胞内单线态氧的变化情况。 在激发波长488 nm,发射波长526 nm附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测绿色 荧光,从而测定细胞内单线态氧水平。 可以提供O21细胞膜不透性的单线态氧荧光探针,其不能穿过细胞膜,需要借助破膜剂进入细胞后与细胞内的单线态氧反应。O21可以用于液体的单线态氧检测。 还可以为您提供各种细胞样本、冰冻切片样本的活性氧、活性氮等各种颜色的检测试剂盒产品。 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。 可以为您提供各种颜色的BBcellProbe® M系列、N系列、L系列、E系列、G系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品,以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。
保存温度
-20℃ 避光
注意事项
1.避免反复冻融。
2.可以根据需要分装后冻存。
3.探针为DMSO溶液,在2-8℃时是固体状态,冬季气温较低时为凝固状态,极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解,从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴,变成液体状态后离心至管底部再开盖。
有效期
6个月
检测方法
1.流式细胞仪2.荧光显微镜3.激光共聚焦
适用样本
1.悬浮细胞
2.贴壁细胞
产品特点
1.使用方便:可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测;
2.背景低,灵敏度高;
3.线性范围宽,使用方便。
仪器准备
1.激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪,
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
PBS缓冲液或者HBSS
耗材准备
1.离心管
2.吸头
3.一次性手套
4.荧光检测专用黑色96孔板
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。
2.荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
3.探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
5.单线态氧O22在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。
6.O22染色工作液必须现配现用,并且在当天用完。
7.O22对湿度非常敏感,若是O22溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。不可使用含水的吸头。
8.对不同的细胞,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察单线态氧的变化,很多细胞内的单线态氧绝dui水平较低,需要根据实际情况适当延长孵育时间。
9.单线态氧O22探针可以根据需要的用量分装后冻存,避免反复冻融。
10.单线态氧O22不可以一次性全部稀释后长期保存不用,稀释后稳定性变差,有效期缩短。
11.单线态氧含量高则细胞荧光强度强。
12.以下操作步骤仅供参考,请根据实际样本情况调整或参考文献。可以用荧光酶标仪、共聚焦/显微镜等原位检测,也可以收集后染色用流式细胞仪等检测。
使用方法
单线态氧探针O22配制:
根据样本数量计算需要的用量,用探针稀释液5倍稀释单线态氧O22探针后充分混匀,避光保存备用。
单线态氧O22探针标记:
单线态氧O22溶液可在新鲜无血清培养基、HBSS缓冲盐溶液中稀释到所需浓度,终浓度按试剂盒的母液的100-200倍稀释,以此染色液更换细胞培养基;也可直接向无血清细胞孵育液体中加入单线态氧O22探针溶液至所需浓度。
原位标记:仅适用于贴壁培养细胞。
1、 按照1:100-200用无血清培养基稀释单线态氧O22探针。
2、 去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。
3、 加入适当体积稀释好的O22探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于96孔板每孔加入100-200 μl染色液,六孔板的一个孔加入稀释好的O22探针不少于1毫升。
4、 在37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。
5、 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的O22探针。
6、 荧光酶标仪/共聚焦/显微镜检测。
收集后标记:悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1. 按照1:100-200用无血清培养基稀释O22探针。
2. 离心移除培养基,用PBS洗细胞一次。
3. 细胞收集后悬浮于稀释好的O22探针中,细胞浓度为1*106-2*107/毫升,37℃细胞培养箱内避光孵育20-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
4. 用无血清细胞培养基洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的O22探针。
5. 用无血清细胞培养基重悬细胞。
6. 流式细胞仪/显微镜检测。
荧光显微镜观察:
1. 对贴壁生长细胞或活组织,可直接在荧光显微镜下观察;对悬浮生长细胞,取25-50 μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。
2. 荧光显微镜下观察。
激发波长488 nm,发射波长526 nm。
流式细胞仪分析:
1. 对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液;对悬浮生长细胞,直接收集细胞。染色并洗涤后用0.5~1 ml冰冷PBS重悬细胞(5~10万)。
2. 采用488 nm波长激发,测定待测细胞平均荧光强度。
使用488 nm激发波长,526 nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱变化情况。
特别提示:本公司的所有产品仅可用于科研实验,严禁用于临床医疗及其他非科研用途!
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