过氧亚硝基阴离子检测试剂盒（ONOO–检测试剂盒）（绿色荧光）

产品概述

过氧亚硝基阴离子（ONOO-）检测试剂盒是一种利用荧光探针O56进行过氧亚硝基阴离子检测的试剂盒。O56可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，在过氧亚硝基阴离子存在的条件下，O56探针被氧化生成荧光物质O56F，O56F的绿色荧光强度与细胞内过氧亚硝基阴离子水平成正比，检测O56F绿色荧光强度就可以知道细胞内过氧亚硝基阴离子的水平。 在激发波长488 nm，发射波长530 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测O56F 荧光，从而测定细胞内过氧亚硝基阴离子水平。 O56荧光探针对过氧亚硝基阴离子（ONOO-）有较高的选择性，但是也会与活性羟基有反应。 过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）是活性氧家族的一员，活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。 O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的绿色荧光探针，还可以提供蓝色、红色、深红色荧光的活性氧检测试剂盒。 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.避免反复冻融。

2.可以根据需要分装后冻存。

3.探针为DMSO溶液，在2-8℃时是固体状态，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

有效期

6个月

检测方法

1.流式细胞仪2.荧光显微镜3.激光共聚焦

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品特点

1.使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

仪器准备

1.激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.黑色96孔板

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

5.原位检测必须使用荧光检测专用的黑色透明底96孔细胞培养板。

6.以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整或参考文献。

使用方法

1. 探针染色工作液配制：

根据样本数量，用HBSS将O56荧光染料1000-5000倍稀释，配制成染色工作液。

2. 细胞探针标记

2.1 对于贴壁细胞，可以进行原位标记

1）培养皿/培养板准备细胞样本。

2）待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育10分钟～90分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。

4）荧光显微镜（含合适滤片）或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最da激发/发射波长为488 / 530 nm。

2.2 对于悬浮细胞

1）离心，吸除上清。

2）利用37℃预热的探针工作液100-200 μl重悬细胞，于生长状态下孵育20分钟～60分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

3）离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。

4）流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最da激发/发射波长为488 / 530 nm。

3．检测：

对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，荧光显微镜，激光共聚焦显微镜直接拍照分析，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，或者用激光共聚焦显微镜直接拍照分析亦可。

使用488 nm激发波长，530 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

过氧亚硝基阴离子浓度高则荧光强度强。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！