一氧化氮检测试剂盒（NO检测试剂盒）（红色荧光）

产品概述

一氧化氮检测试剂盒是一种利用新型荧光探针O38进行细胞内一氧化氮定性检测的试剂盒。本试剂盒中的O38 NO探针为红色荧光的一氧化氮探针，具有510 nm / 610 nm的最大激发/发射波长。 O38 NO探针在细胞中一氧化氮存在的条件下，被氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与细胞内一氧化氮水平成正比，检测O38产物的荧光强度就可以知道细胞内一氧化氮的水平。 在激发波长510 nm，发射波长610 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O38产物的荧光强度，从而测定细胞内一氧化氮水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的一氧化氮的定性检测。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2•-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH•(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。 O系列NO探针具有多种颜色可以选择，除了本试剂盒的红色荧光探针，还可以提供蓝色、绿色、深红色荧光的NO检测试剂盒。 可以为您提供各种细胞样本、切片样本、组织样本的活性氧、活性氮检测试剂盒产品。 可以为您提供总活性氧、总活性氮和各种亚型的活性氧/活性氮的检测试剂盒产品。 可以为您提供各种绿色、红色、蓝色、深红色的活性氧/活性氮检测试剂盒产品。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.避免反复冻融。

2.可以根据需要分装后冻存。

3.探针为DMSO溶液，在2-8℃时是固体状态，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

有效期

6个月

检测方法

1.流式细胞仪2.荧光显微镜3.激光共聚焦

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品特点

1.使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测或激光共聚焦显微镜直接拍照分析；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

仪器准备

1.激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.黑色96孔板

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。2.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

3.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

4.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

5.原位检测必须使用荧光检测专用的黑色透明底96孔细胞培养板。

6.以下操作步骤仅供参考，请根据实际样本情况调整或参考文献。? 7.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

8.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。

9.酚红对O38荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。

10.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O38探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。

使用方法

探针染色工作液配制：

根据样本数量，用HBSS将O38荧光染料1000-2000倍稀释，配制成探针染色工作液。

探针标记

原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。

1. 培养板/培养皿准备细胞样本。

2. 待细胞生长到合适丰度，去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。

3. 加入适量体积37℃预热的含O38探针工作液。

4. 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟～60分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

5. 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O38探针。

6. 加入200 μL HBSS缓冲液。

7. 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。最大激发/发射波长为510 nm / 610 nm。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1. 离心，吸除上清培养基。

2. 用PBS洗细胞一次。

3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O38探针工作液中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升。

4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-45分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

5. 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O38探针。

6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。

7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。

最大激发/发射波长为510 nm / 610 nm。

一氧化氮检测：

1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。

4. 使用510 nm激发波长，610 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

5. 荧光强度强，一氧化氮含量高。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！