活性氧检测试剂盒（绿色荧光）（ROS）

产品概述

活性氧检测试剂盒是一种利用新型荧光探针O06进行细胞活性氧检测的试剂盒。本试剂盒中的O06 ROS探针为绿色荧光的活性氧探针，具有488 nm / 520 nm的最大激发/发射波长。 O06 ROS探针在细胞中活性氧存在的条件下，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测O06产物的荧光强度就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长488 nm，发射波长520 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测O06产物的荧光强度，从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的总活性氧的检测。 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物过氧亚硝基阴离子（ONOO-，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

保存温度

-20℃ 避光

注意事项

1.探针长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。

2.探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3.可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

4.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

6个月

检测方法

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪，荧光显微镜等

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品特点

1.使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；

2.背景低，灵敏度高；

3.线性范围宽，使用方便。

仪器准备

1.荧光分光光度计或荧光酶标仪，

流式细胞仪、激光共聚焦、荧光显微镜等

2.离心机

3.移液器

4.冰箱

5.冰盒

试剂准备

PBS缓冲液或者HBSS

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

4.荧光检测专用黑色96孔板

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.BBoxiProbe® O06荧光探针在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

3.本荧光探针在冬季气温较低时在室内时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

4.使用前，先将本品取出回温至室温（20℃以上），并对其进行简短离心使溶液集中于管底。

5.荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

6.探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。

7.尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

8.探针标记的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。

9.标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定zui佳条件。以下染色操作条件仅供参考。请根据实际样本情况调整或参考文献。

10.酚红对O06荧光探针的检测有轻微干扰，需尽可能避免。

11.以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O06探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。

12.必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

使用方法

探针染色工作液配制：

根据样本数量，用HBSS将O06荧光染料1000-2000倍稀释，配制成探针染色工作液。

探针标记

原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。

1、 培养板/培养皿准备细胞样本。

2、 待细胞生长到合适丰度，去除细胞培养基，用PBS洗细胞一次。

3、 加入适量体积37℃预热的含O06探针工作液。

4、 在37℃细胞培养箱内于生长状态下避光孵育20分钟～40分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。

5、 移除染色液，用PBS（pH7.4）洗涤细胞3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。

6、 加入200 μL HBSS缓冲液。

7、 荧光酶标仪、荧光显微镜（含合适滤片）检测。最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理

1. 离心，吸除上清培养基。

2. 用PBS洗细胞一次。

3. 细胞收集后重悬浮于稀释好的37℃预热的O06探针工作液中，细胞浓度为1*106-2*107/毫升。

4. 于生长状态下37℃细胞培养箱内避光孵育20-30分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

5. 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。以充分去除未进入细胞内的O06探针。

6. 用HBSS/PBS/无血清细胞培养基重悬细胞。

7. 用荧光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪检测。

最大激发/发射波长为488 nm / 516 nm。

活性氧检测：

1. 对于原位标记探针的样品可以用荧光酶标仪检测，或者用激光共聚焦显微镜、荧光显微镜，直接拍照分析（需要有相关的荧光强度分析软件）。

2. 或收集细胞后标记探针然后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

3. 对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接拍照分析也可以（需要有相关的荧光强度分析软件）。

4. 使用488 nm激发波长，520 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。

探针O06的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测。

5. 荧光强度强，活性氧含量高。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！