活细胞/死细胞双染试剂盒（绿色/蓝色荧光）

产品概述

活细胞/死细胞染色试剂盒是采用Calcein-AM / NucBlue D双色荧光染色细胞的方法区别活细胞和死细胞。 BBcellProbe® 活细胞/死细胞染色探针采用公认的鉴别细胞内活力的参数酯酶活性和细胞膜完整性的方法检测活细胞和死细胞。 活细胞的特征是无处不在的细胞内酯酶活性，Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein，聚阴离子染料Calcein很好地保留在活细胞内，几乎无荧光的Calcein-AM转变为绿色荧光的Calcein，在活细胞中发出均匀的强绿色荧光。 与其它同类试剂（如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate）相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。 作为核染色染料的NucBlue D不能穿过质膜完整的活细胞的细胞膜，它可以穿过死细胞膜的受损膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而在死细胞中产生蓝色荧光，NucBlue D荧光最da激发波长348 nm，最da发射波长在469 nm。NucBlue D不会染色质膜完整的活细胞，仅对死细胞染色。 本染色方法适用于荧光显微镜、荧光酶标仪等微孔板荧光扫描设备、流式细胞仪或者其它的荧光设备。 本染色方法适用于大多数真核细胞，包括贴壁细胞和某些组织样本，单不包括细菌和酵母样本。 需要注意的是，Calcein-AM / NucBlue D双染有效染色的前提是相应的细胞模型的活力变化是酯酶活性变化和质膜完整性变化这些物理和生化特性，不影响这些细胞特性的细胞毒性事件可能不能使用此方法进行准确评估。

保存温度

-20℃避光

注意事项

1.长期不用可以-20℃保存。

2.染色液Calcein AM注意防潮；避免反复冻融。

3.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

4.注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。

5.试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。

6.试剂拆封后请尽快使用完！

有效期

1年

检测方法

1.流式细胞仪

2.激光共聚焦

3.荧光显微镜

适用样本

1.悬浮细胞

2.贴壁细胞

产品应用

1.流式细胞仪

2.激光共聚焦

3.荧光显微镜

试剂准备

1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））

2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材准备

1.离心管

2.吸头

3.一次性手套

使用注意事项

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。

3.微量试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

4. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

5.由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

6.Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。

7.试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

使用方法

染色工作液的配制：

根据样品数按下列比例配制染色工作液。

用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。

每1ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入10μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。

每1ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入5-50μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。

荧光显微镜观察：

1. 准备样本细胞。

2. 用PBS洗涤细胞2-3次。

3. 用100-150μl染色工作液A至盖玻片将细胞样品覆盖（或重悬）。

4. 在室温或37℃避光孵育20-45分钟。

5. 用PBS洗涤细胞。

6. 用100-150μl染色工作液B至盖玻片将细胞覆盖（或重悬）。

7. 在室温或37℃避光孵育10-45分钟。

8. 用PBS洗涤细胞。

9. 用荧光显微镜检测结果。

显微镜结果分析 ：

荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色。

用348 nm波长激发，死细胞为蓝色。

流式细胞仪检测：

1. 收集细胞。

2. 用PBS洗涤细胞两次。

3. 制备1 mL细胞悬浮液，浓度为0.1至5×106细胞/ mL。 细胞可以在无血清培养基或其它缓冲液中重悬。

4. 在细胞中加入适量Calcein-AM溶液和适量NucBlue D母液，混匀。

5. 在室温或37℃避光孵育15-30分钟。

6. 尽快用流式细胞仪检测结果。

荧光酶标仪检测：

1. 在微孔板中准备细胞样本孔以及对照孔。

2. 用PBS洗涤细胞2-3次。

3. 加入200μl染色工作液。

4. 在室温或37℃避光孵育15-45分钟。

5. 用PBS洗涤细胞。

6. 加入适量PBS。

7. 用荧光酶标仪/荧光光度计检测结果。CalceinAM的激发和发射波长分别为488 nm和515 nm。NucBlue D的激发和发射波长分别为348 nm和469 nm。

酶标仪结果分析 ：

可以根据不同荧光强度来计算样品中活细胞和死细胞相对数量（以百分比表示），或者活细胞/死细胞的绝dui数量。

% Live Cells =（F(530)sam – F(530)min）÷ （F(530)max – F(530)min）× 100%

% Dead Cells =（F(470)sam – F(470)min）÷（F(470)max – F(470)min）× 100%

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！