【柏恒科技小课堂】线性梯度、二维梯度PCR仪，你了解多少？

众所周知，传统梯度PCR仪

一次只能优化一个最佳温度，

还要一个个调试

退火、变性、延伸等最佳温度......

别怕，柏恒科技PCR仪

就可以帮你解决这个棘手的难题！

一次优化两个步骤的温度

一步完成优化程序

......

那么，现在就来听小柏解说

是什么功能，能解决这个难题～

一、什么是线性梯度温度和二维梯度温度？

首先我们要先了解线性梯度温度和二维梯度温度的意义及应用。

1、什么是线性梯度温度？

 PCR反应能否成功，退火温度是关键。线性梯度指在PCR扩增反应中每一行的温度呈线性的方式显示，直白点就是从一个固定的温度点，递增或递减的形式形成一条直线。根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的线性梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。

2、什么是二维梯度温度？

二维梯度PCR是一种改良的PCR技术，它采用两种温度梯度对PCR反应进行优化，能够提高PCR反应的特异性和产物纯度。它基于不同温度下，引物与模板结合能力的变化，通过将引物浓度、温度等因素逐渐升高或降低，使反应中优化温度梯度，以达到PCR反应体系在最适宜的温度条件下进行特异性扩增的过程。这种方法可以避免由于引物结合不足或非特异性产生的杂交产物，优化反应温度等温度参数，使反应产物更加纯净和特异。相比于传统PCR，它在二维空间，即空间和时间上设置了不同的反应温度。有96种温度组合，进而探索和筛选出最优PCR扩增反应温度条件。


二、应用在哪里？在PCR扩增反应中
 

线性梯度的应用

主要用于研究未知DNA退火温度的扩增。适用于司法科学、医学、食品工业、分子生物学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR仪用。

二维梯度的应用

一般情况下，传统梯度PCR仪仅考虑了退火温度的可变性，对变性温度进行默认设置95℃，延伸温度默认为72℃。但是，对于基因扩增的扩增效率如何，同样需要考虑变性温度的变化。

譬如，某一DNA片段在93℃，条带最亮；或者某一DNA片段在93.6℃，条带最亮；此时就需要对变性温度进行探索，应用二维梯度可以一步完成优化。

三、线性梯度温度和二维梯度温度的操作
 

线性梯度

（1） 在退火温度步骤里点击高级设置，切换梯度方式为“线性”；

（2） 设置温度、梯度增量；

（3） 设置温度增量及其开启点；

（4） 设置时间增量及其开启点；

（5） 设置变温速率。


 

二维梯度

在实际应用中，研究学者会依据基因片段大小、引物Tm值高低和自身实验需要，预设变性温度和退火温度的范围。实验过程中，二维梯度PCR仪会自动完成梯度温度的设置与调整，为PCR扩增创造最适宜的温度反应条件。

 

RePure-C智能二维梯度PCR仪二维梯度步骤设置：

（1）温控程序内添加反应步骤。

（2）设置梯度温度：纵向梯度范围0.1-30℃，横向梯度范围0.1～42℃。

注意：变性步骤里需设置纵向梯度，退火步骤里需设置横向梯度。

（3）根据实验需求可以设定温度增量和时间增量及开启点、变温速率。

四、线性梯度温度和二维梯度温度的优势
 

线性梯度

（1） 快速摸索最佳退火温度

线性梯度能同时进行多个不同退火温度的PCR反应，进而探索得出最佳退火温度。

（2） 缩短实验时间

仅一次实验就能确定特定体系相应的最优退火温度。从而可在短时间内对PCR实验进行优化，大大提高PCR科研效率。

（3）提高实验效率,降低成本

缩短了实验时间，减少了样品的使用，进而提高实验   效率,降低成本。

二维梯度

（1） 提高PCR反应的特异性

在二维梯度温度下，引物与模板结合能力的变化，可以使反应具有更高的特异性并减少非特异性杂交产物的产生。

（2） 提高PCR反应的产物纯度

通过对反应中各分子靶点进行优化，以使放大的DNA产物得到放大。

（3） 检测基因点突变

根据已知的突变位点设计适当的引物，通过PCR扩增得到目标基因的片段，然后对扩增产物进行测序，检测突变位点。

（4） 检测种群间的遗传多样性

通过二维梯度PCR扩增，产物进行测序，发现突变位点，比对种群间的遗传物质多样性。

（5） 操作简单

二维梯度PCR仅仅需要配置一个反应体系即可。

（6） 提高阳性检测准确性

二维梯度PCR一次性就可得到96种温度组合，大大减免了样品简单的交叉污染，降低了假阳性出现的几率，进而提高了真阳性的检测准确性。

（7） 缩短实验时间

由于二维梯度PCR可以根据温度的不同，优化出最佳反应温度，缩短了多次探索变性温度或者退火温度的时间。

 

综上所述，与线性梯度相比，二维梯度不仅可以一次性进行探索96种温度组合，从而更快速，更准确的得出最适的变性和退火的温度组合，确保了PCR实验在最适温度条件下进行扩增反应，从而提高了引物与模板的特异结合，进而提高了扩增效率。并且可以检测点突变和遗传多样性，未来在预防、诊断和治疗某些疾病中提供了更多帮助。

线性梯度功能，柏恒科技RP全系列梯度PCR仪都具有此功能。

二维梯度功能，柏恒科技是国内首创，至今已有多种型号，如RePure-C、RePure-D、RePure-D(P)。