脾脏单个核细胞分离方法及注意事项

脾脏（spleen）位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，是体内最大的淋巴器官，也是血流通路中的过滤器官。脾脏内定居着大量的淋巴细胞和其它免疫细胞，是机体发生特异性免疫应答的场所。

1    原理

单个核细胞的体积、形态和比重与其它细胞不同，在沉降过程中不同比重的细胞会处于不同的分布位置。因此，可利用各种血细胞和单个核细胞比重之间的差异将各种血细胞与单个核细胞分离开来。

2    方法

1）无菌条件下取出脾脏，在培养皿中加入适量的分离液，将脾脏放入细胞筛中，置于分离液中进行研磨（具体方法见示意图1）。

图1 脾脏研磨方法示意图

2）将悬有脾脏细胞的分离液立即转移入无菌离心管中，在上层覆盖适量的RPMI 1640培养基，且需保持液面分界清晰。

3） 800g，室温，离心 20min-30min（注：设置较慢的加速度和减速度，如果有十档，设为第三档）。

4） 离心结束后，吸弃RPMI 1640培养基，小心吸取脾脏单个核细胞层（即白膜层）并转移至15mL离心管中。离心结束后，管内液面从上至下依次为RPMI 1640培养基层、脾脏单个核细胞层、分离液层和红细胞层（见图2）。

图2 细胞悬液离心前后的分层状态图

5）向离心管中加入10mL 的RPMI 1640培养基洗涤细胞，250g，室温离心 10min ，弃上清。重复该步骤 1~2 次，即可用于后续试验。

3    注意事项

1）不同种属动物单个核细胞的比重有一定差异，请选择合适的分离液进行脾脏单个核细胞的分离。

2）分离液易挥发，在脾脏研磨过程中请尽量缩短时间，将研磨时间控制在5min以内。

3）研磨过程中请尽量控制研磨力度，保证细胞筛悬空，避免在培养皿底部直接研磨而造成细胞大量死亡。

4）若研磨后细胞悬液呈暗红色，需将其进行适量稀释后再进行后续操作。

5）为保证细胞的活力，整个操作过程请轻柔，避免对细胞造成机械性的损伤。

6）为保持细胞状态良好，请尽量缩短整个试验的周期。

4    脾脏单个核细胞分离试剂盒

IPHASE/汇智和源针对不同种属动物脾脏单个核细胞分离的特点，开发了对应的单个核细胞分离试剂盒，包括人，猴，犬，大鼠，小鼠，兔，猪等。该试剂盒包含单个核细胞分离液和洗涤液两个组分，各成分对细胞无毒性，不会影响细胞的原始状态；同时，该试剂盒操作简单便捷，可大大缩短细胞分离时间，分离所得细胞纯度高、状态好、得率高。

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