为加强公司经营管理，规范经营流程，结合现阶段市场需求，北京汇智和源生物技术有限公司决定自2022年4月1日起，调整部分空白基质产品价格，特此通知，具体价格请详询。感谢各位的理解与支持。汇智和源将持续为广大消费者提供高质量的产品服务体验。                     北京汇智和源生物技术有限公司                             2022年3月31日

遗传毒性试验产品八折促销，强势来袭活动时间：3.21-4.20促销产品：鼠伤寒沙门氏菌TA97a鼠伤寒沙门氏菌TA98鼠伤寒沙门氏菌TA100鼠伤寒沙门氏菌WP2uvrA（pKM101）鼠伤寒沙门氏菌TA1535诱导混合SD大鼠肝S9

人cd3+t淋巴细胞阳性分选原理及注意事项一、细胞分选方法概述细胞学研究中一个很重要的课题就是细胞的分离纯化，尤其是需要对某种特定的细胞进行功能研究，如对细胞培养上清液通过elisa分析检测细胞因子、细胞共培养检测细胞功能等，都需要得到高纯度的目的细胞。因此，高效地分离所需要的目的细胞是进行细胞功能研究的先决条件。细胞分选（cell sorting）是指根据细胞所具有的特性把某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术，它是对某一特定细胞进行生化分析和功能分析的前提和基础。常用的细胞分选方法主要有两大类：一类是基于细胞物理性质的密度梯度离心法（density gradient centrifugation），另一类是基于免疫识别特性的方法，包括荧光激活细胞分选方法（fluorescence-activated cell sorting，facs）和磁性激活细胞分选法（magnetic-activated cell separation，macs）。密度梯度离心法是基于不同的细胞群之间存在沉降系数差异的原理建立起来的，在一定的离心力的作用下，不同种类的细胞会以各自不同的速度沉降，在密度梯度不同的区域上会形成区带。这种方法简单易行，但此种方法分离所得到的细胞纯度较低，且细胞表面的标志不明确，特异性较差，目前使用较少。流式细胞术（flow cytometry，fcm）是20世纪60年代后期发展起来的一种利用流式细胞仪（flow cytometer）进行快速定量分析细胞亚群的物理化学特性，根据这些物理化学特性精确分选细胞的新技术，fcm主要包括流式分析和流式分选两部分。facs最初于1972年提出，是指荧光驱动的细胞分选新技术，即利用分选型流式细胞仪分选标记有荧光素偶联抗体的细胞样品，通过荧光系统区分目的细胞和非目的细胞。流式细胞仪通过接受激光照射后液流内细胞的散射光信号和荧光信号反映细胞的物理化学特性，如细胞的大小、颗粒度以及抗原分子的表达情况等，目前已被广泛应用于生命科学及其相关领域的基础研究。流式细胞分选被认为是细胞分选的“金标准”，它分选所得的细胞纯度高、回收率高、且操作环境为全封闭型，不易被污染。但是，该方法所需设备比较昂贵，耗时，且需要高水平的技术支持以及专业的操作人员；且该方法在一段时间内只能分选一个细胞样品，若试验需要从不同的样品中分选目的细胞时这种方法不可行；同时，由于facs对细胞刺激较大，因此对分选出的细胞活性有较大影响。   磁性细胞分选（macs）是20世纪70年代发展起来的，是用结合有抗体的免疫磁珠与样品细胞进行孵育，表达有相应抗原的细胞就会特异性的结合在包被有抗体的免疫磁性微粒上，当体系缓慢的经过磁场时，带有磁珠的细胞就会滞留在磁铁上，而非目的细胞由于未结合磁珠仍存在与混合细胞悬液中，从而达到分离纯化细胞的目的。macs法是一种相对高效简便的细胞分选方法，所需设备简单，只需一块专用磁铁即可进行分选，操作较为简单，对操作人员的技术要求也不高，一般实验室都可进行磁性分选。磁性分选只是让细胞处于一个低磁场中，基本可以忽略对细胞的影响，分离得到的细胞具有较高的复苏率及细胞活性，对于下游应用影响较小，在保持细胞活性方面优于流式分选。磁性分选因其高灵敏度、高纯度、易操作、对目的细胞刺激较小等特性成为了细胞分选的首选方法，具有潜在的应用前景。二、免疫磁性细胞分选2.1 原理磁性细胞分选是基于免疫学中抗原抗体之间特异性结合的原理进行的。以磁性微粒作为载体，对其进行抗体或亲和配体包被，形成免疫磁性复合微粒，当其与混合细胞孵育后，磁性微粒表面抗体会与细胞表面的抗原决定簇发生抗原抗体的特异性反应，使得细胞被磁性复合微粒标记。在外加磁场的作用下，抗体与磁珠相连的细胞会因磁珠的磁性而滞留在磁场中，而不表达此抗原的细胞因不能与磁珠表面的特异性抗体结合而没有磁性，不能够在磁场中滞留，从而使目的细胞与非目的细胞分开，得到较高纯度的目的细胞。 图1 免疫磁性细胞分选原理示意图2.2 免疫磁性细胞分选系统的分类根据不同的分类标准，可以将免疫磁性细胞分选系统分为不同种类。2.2.1 依据所标记细胞的不同分类根据分选过程中所标记细胞类型的不同将免疫磁性细胞分选系统分为阳性分选、阴性分选和复合分选。阳性分选（iphase人cd3+t细胞阳性分选试剂盒），即将目的细胞亚群直接从细胞悬液中分离出来。通过磁珠包被目的细胞的特异性抗体与混合细胞悬液孵育，在抗原抗体发生特异性结合后，通过磁分离方式，将目的细胞分离出来。阴性分选，即从多细胞悬液中分离去除非目的细胞而得到目的细胞的一种方法。此方法的优点在于整个分选过程中目的细胞都未与磁珠（iphase sa磁珠）结合。由于抗原抗体的结合可能会引起细胞膜表面的信号传递，因此，此法具有较大的优势。但同时此方法也有不足之处，当靶细胞的细胞数所占细胞比例较小时，分选过程中存在的非特异性吸附会直接导致目的细胞的损失，此外，非目的细胞未被充分去除等，都会使得细胞的分选效率和分选纯度较低。复合分选是指联合使用两种以上的分选策略进行分选，这种方法主要用于细胞亚群的分选或者想要分离得到高纯度的稀有细胞。2.2.2 依据分选方法的不同分类    根据分选方法的不同可以将免疫磁性细胞分选分为直接分选法和间接分选法。直接分选法是指将抗体或者亲和配体直接包被在磁性颗粒上，形成免疫磁性复合微粒，将其与多细胞悬液混合孵育之后，目的细胞会特异性的结合在免疫磁珠上，在外加磁场作用下，带有磁珠的目的细胞会滞留在磁场中，而非目的细胞则会被去除。间接分选法分选细胞引入了二抗，即将目的细胞首先与对应的一抗孵育，激活细胞，之后清洗出去未结合的一抗，然后加入预先包被有二抗的磁性颗粒与活化后的细胞孵育，一抗与二抗之间的相互作用会导致磁粒结合在目的细胞上，同样在磁场作用下滞留目的细胞，达到分选的目的。2.2 免疫磁性细胞分选系统的组成免疫磁性细胞分选系统主要有磁性微粒、待标记抗体、磁性分离器（磁力架）、缓冲体系等组成。其中，磁性微粒的选择是分选成败的关键。磁性微粒是指具有磁性或超顺磁性的粒子、磁性胶质体、磁性脂质体等。较为常见的磁性物质为fe3o4或γ-fe2o3磁性微粒；也有二氧化铬和铁素体的磁性微粒。应用于细胞分选的磁粒（iphase sa磁珠）具有非常严格的标准，其化学性质必须稳定，分散性好，在细胞悬液中不团聚，去掉外加磁场后没有磁滞现象，且不能吸附非特异性细胞，磁粒储存过程中亲和配体不能掉落，分选过程中可迅速、完全的被磁性分离，并可最大限度地减少细胞的吞噬作用。磁性微粒的粒径大小对于细胞分选具有很关键的作用，因为粒径直接决定了磁粒的物理性质与可操作性。粒径较大的磁粒（>1μm）和粒径较小的磁粒（50~200nm）在细胞分选中都有广泛的应用。在某些情况下，不同的实验要求需要使用不同特性的磁粒。磁粒粒径的大小与其标记细胞的能力有很大关系，粒径大的磁粒可以负载更多的标记细胞接受部位。并且,细胞分选过程中，标记了较大磁粒的细胞，更容易被磁性分离器吸附，对磁性分离器的要求较低，简单、便宜、磁场强度较低的的磁分离器就可以满足要求。标记物或小分子标记物标记的粒径小的磁粒，却需要昂贵高强度的磁性分离器才能成功分选靶细胞。2.3 免疫磁性细胞分选的过程磁性细胞分选过程分为磁性标记及磁性分离两个过程。从复杂样品中分选靶细胞的流程大致分为三个步骤：第一步，磁性标记物与含有靶细胞的细胞悬液混合孵育。孵育过程中，靶细胞与标记物相互作用，通过磁性分离把磁性标记物-靶细胞偶联产物与其它细胞分离。第二步，清洗磁性标记物-靶细胞复合物，去除杂质。在这个过程中，可直接将磁性复合物-靶细胞复合物用来进行细胞培养，也可以裂解细胞，通过色谱分析、电泳或等方法分析细胞内容物。第三步，磁性标记物与靶细胞的分离、移除。将磁性标记物与靶细胞分开，通过磁性分离去除磁性标记物，释放靶细胞，以便后续实验的进行。2.4 免疫磁性细胞分选应用作为细胞生物学研究的前提和基础，细胞分选技术已经得到了广泛的应用。随着细胞分选技术的不断发展，免疫磁性细胞分选技术已越来越受到研究者的的认可，目前已有许多商业化的试剂盒和分选磁珠（iphase sa磁珠）应用于细胞亚群的分选。最常见的为从人的外周血中分离细胞亚群，如b淋巴细胞、t淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、自然杀伤细胞等。2.5 免疫磁性细胞分选效果的评价细胞分选效果的评价指标主要包括分选纯度和分选得率。分选纯度是指被分选出所有细胞中目的细胞所占的百分比。分选得率是指被分选出来的细胞数与原混合细胞悬液中该种目的细胞数的百分比。三、人cd3+t淋巴细胞免疫磁性细胞分选3.1 cd3+t淋巴细胞概述免疫细胞（immune cell）是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等，淋巴细胞是免疫系统的基本成分。淋巴细胞包括t淋巴细胞（cd3+）、b淋巴细胞（cd3-cd19+）、nk细胞（cd3-cd16+cd56+），其中t淋巴细胞是淋巴细胞的主要组成。t淋巴细胞是胸腺依赖淋巴细胞（thymus dependent lymphocyte），简称t细胞。cd3+t淋巴细胞代表全t淋巴细胞，包括辅助/诱导t淋巴细胞（cd3+cd4+）、抑制/细胞毒t淋巴细胞（cd3+cd8+）、cd4+t细胞纯真亚群（cd4+cd45ra+/ cd4+cd45ra+62l+）和记忆亚群（cd4+cd45ra-/ cd4+cd45ro+）、功能亚群（cd28+）、激活亚群（cd38+、hla-dr+）、凋亡亚群（cd95+）等。3.2人cd3+t淋巴细胞分选试剂盒简介iphase/汇智和源顺应市场需求，推出了可用于人cd3+t淋巴细胞分选的试剂盒，助力于生命科学的研究。根据分选样品的不同，分为适用于人pbmc样品分选和适用于人全血样品分选的两种试剂盒。试剂盒操作简单便捷，各成分对细胞无毒性，且可实现高纯度细胞分离的目的，为下游实验提供便捷。3.3 试剂盒特点l 便捷性 只需一步操作，即可实现高纯度细胞分选。l 高效性 分选得到目的细胞最短只需15min。l 高纯度 细胞分选纯度可达95%以上。l 高活性 细胞分选后目的细胞存活率高。 图1图1为使用人cd3+t细胞阳性分选试剂盒分离人全血后，使用克隆号为hit3a的人cd3-fitc流式抗体进行染色后，经流式细胞仪分析结果。左图为未经分选流式图；右图为经阳性分选后的流式图。 3.4试剂盒原理采用免疫磁珠阳性分选的方法，利用偶联于磁性微粒上人cd3单克隆抗体的高度特异性，使磁珠特异性结合pbmc（人外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞）中的cd3+ t细胞，通过外加磁场的作用，使得cd3+ t细胞得以滞留在磁场中而被分离出来。 4.3试剂盒组成产品组成产品规格human cd3 magnetic beads20test200testselection buffer50ml500ml 4.4 试剂盒分选流程 

IPHASE/汇智和源推出细胞分选新产品——CD3+T细胞阳性分选试剂盒，CD3磁珠 免疫磁性细胞分选是用磁珠抗体偶联系统从样本细胞悬液中选择性吸附靶细胞的方法，分选和富集靶细胞。 IPHASE/汇智和源针对CD3+T细胞分选，开发出CD3抗体偶联磁珠，以及一体化人CD3+T细胞分选试剂盒，试剂盒采用免疫磁珠阳性分选的方法，利用偶联于磁性微粒上人 CD3 单克隆抗体的高度特异性，使磁珠特异性结合 PBMC（人外周血单个核细胞或脐带血单个核细胞）中的 CD3 + T 细胞，通过外加磁场的作用，使得 CD3 + T细胞得以滞留在磁场中而被分离出来。 人CD3+T细胞阳性分选试剂盒CD3磁珠 新品推出期间，可申请免费试用，每个客户可免费申请试用1套试剂盒，名额有限，先到先得！ 免费试用时间：2021.12.24—2022.01.30

2021年10月13-14日，中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所（以下简称“职业卫生所”）依据国家卫生健康委员会关于《化学品毒性鉴定管理规范》的要求，在北京龙爪树宾馆举办了“化学品毒性鉴定试验方法培训会”。北京汇智泰康医药技术有限公司（以下简称“汇智泰康”）作为受邀单位参加本次会议，同时参会的还有北京市疾控预防控制中心、湖南省职业病防治院，广东省职业病防治院，北京大学医学部，青岛大学，埃克森美孚公司以及来自全国的其它十余家由国家卫生健康委认定的化学品毒性鉴定试验单位。 在会议上，汇智泰康杜克贺副总经理代表公司，向会议代表做了题为《做好质量管理工作，提升GLP项目服务品质》的报告，报告依据GLP质量管理体系的要求，结合公司开展项目的实际情况，从机构负责人、项目负责人、质量负责人以及委托方等不同的角度分别阐述了对GLP工作的理解，引起了与会代表的广泛共鸣。 此外，还有多位专家老师进行了精彩的专业技术报告，汇智泰康的多位专业技术人员和质量保证人员，也都积极参会学习，与会期间和专家以及参会者进行了广泛交流，对于进一步提升技术能力和专业认识都有很大帮助。后续，公司还将继续参与支持化学品毒性鉴定试验方法的研发与交流工作。 

平衡透析法检测血浆蛋白结合率原理及注意事项药物血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding, PPB）即血液中与蛋白结合的药物占总药量的百分数，可以反映药物与血浆蛋白结合的程度。药物血浆蛋白结合率是药物在动物体内重要的药理学参数之一，影响着药物体内游离浓度进而影响药物的分布与排泄。药物在进入血液后与血浆蛋白会有不同程度结合，血液中游离药物的比例会影响其在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程，与血浆蛋白结合的药物可能会有更长的半衰期和更慢的清除速率，因此测定血浆蛋白结合率对于理解化合物的活性以及组织分布有很重要的参考意义。1 结合蛋白类型血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白（AAG）为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。2 血浆蛋白结合率常用测定方法目前常用于药物血浆蛋白结合率测定的常用方法包括平衡透析法（Equilibrium Dialysis），超滤法（Utrafiltration Method），超速离心法（Ultracentrifugation Method），凝胶过滤法（Gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法，也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。超滤法使用滤膜分立自由的药物和结合蛋白的药物，时间短，但确定点是药物容易结合到超滤过程使用的器械上，从而影响检测结果。平衡透析法虽然比超滤法耗时多一些，但它使用teflon镀层的平衡装置，能大大减少药物的非特异性结合，得到更精确的结果。目前，平衡透析法已有96孔板的高通量测试形式，可以实现同时测试大量候选药物的蛋白结合率。平衡透析法常用种属血浆：大鼠血浆，小鼠血浆，比格犬血浆，猴血浆，人血浆分析方法：HPLC，LC-MS/MS，GC-MS等各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后，在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型，游离性药物具有药物活性。药物与血浆蛋白结合会成为结合型药物，暂时失去药理活性，并且储存于血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短具有重要的意义。一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长，药效平稳。结合率低的药物体内消除快，同时作用时间短，药效有很大的波动。平衡透析法测定血浆蛋白结合率是用透析膜将蛋白质溶液与缓冲液分隔开，建立在两者之间的一种平衡状态，只有分子量小的药物小分子可以通过。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。平衡透析法能够直接测出为与蛋白结合的药物小分子的数量，这是分析蛋白与小分子物质结合的关键，从而能够求出结合位点数及结合常数。图1：分隔示意图如图所示，利用透析膜将左右两室进行分隔，膜左侧加入含药的待测药物，膜右侧加入空白缓冲液，未被结合的游离药物可以自由穿过透析膜，孵育一定时间后两侧达到平衡，游离药物浓度相等，通过HPLC、LC-MS/MS或者GC-MS等方法测定两侧药物浓度，利用公式即可计算得到血浆蛋白结合率。这种透析膜只允许特定分子量的小分子通过，而阻止蛋白大分子通过。平衡透析法在测定药物血浆蛋白结合率具有操作简单、温度易于控制、PH值可调、设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化，且透析时间过长可能会造成由加热或代谢引起的被测物质的降解等缺点。因此在利用平衡透析法测定药物血浆蛋白结合率，或者药物与蛋白质相互作用时需要与其他的一些方法联用，才能获得更准确的作用信息。一般只有血浆蛋白结合率高，分布容积小，消除慢以及治疗指数低的药物在临床上的这种相互作用才有意义。汇智泰康ADME服务项目血浆蛋白结合率测定代谢稳定性研究肝微粒体代谢实验肝细胞代谢稳定性试验代谢表型研究代谢产物鉴定代谢途径鉴定种属比较研究细胞色素P450抑制实验（CYP450抑制试验，常用CYP450酶包括CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4等）细胞色素P450诱导实验（CYP450诱导试验）血浆稳定性试验跨膜转运试验药物-药物相互作用毒理学研究4 血浆蛋白结合试验检测试剂盒汇智泰康针对血浆蛋白结合率测定试验研发针对性的平衡透析装置，平衡透析装置包括96个透析池和透析池之间的透析膜组成，可以同时对多个样品进行透析测定，确定游离化合物比例。透析膜（半透膜）选用高分子膜，孔径可根据客户需求定制。产品：血浆蛋白结合平衡透析装置血浆蛋白结合试剂盒血浆蛋白结合试剂盒-猴血浆血浆蛋白结合试剂盒-比格犬血浆血浆蛋白结合试剂盒-大鼠血浆血浆蛋白结合试剂盒-小鼠血浆试剂盒组分：①透析膜②不同种属血浆③PBS缓冲液注意事项：①影响血浆蛋白结合率测定的因素很多，如溶解度、温度、非特异性结合、酯酶代谢等，需要根据化合物特征，结合研究目的选择合适的测定方法进行实验。②如果有的药物具有很高的蛋白结合能力，试验条件的微小偏差可能会使试验结果出现较大偏差，从而大大提高血液中药物的浓度而引起毒性。图2：平衡透析系统图3：半透膜汇智泰康是一家位于中美两地的生物医药合同研发机构，整合中美两地的药物研发技术服务平台，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025实验室认证，面向全球企业及研发机构提供分析化学、DMPK、药理药效、生物学、以及毒理安全性评价产品与服务。体外研究内容包括血浆蛋白结合率，肝微粒体代谢稳定性，肝细胞代谢稳定性，CYP450代谢表型鉴定，CYP450酶抑制与酶诱导，代谢产物推断与鉴定等。 

药物稳定性研究的实验原理和注意事项药品的稳定性是指其保持理化性质和生物学特性不变的能力。若药品的稳定性差，发生降解而引起质量变化，则不仅可能使药效降低，而且生成的杂质还有可能有明显的毒副作用，影响药品使用的安全性与有效性。稳定性试验的目的是考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为药品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期，保证用药安全。 一、稳定性试验基本要求要求1: 影响因素试验用1批供试品进行（原料药或制剂）。加速试验与长期试验要求用3批供试品进行。要求2: 原料药供试品应是达到一定规模生产的产品。供试品量相当于制剂稳定性试验所要求的批量;原料药合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。要求3: 药物制剂供试品应是放大试验的产品，其处方和工艺与大生产一致。药物制剂，如片剂或胶囊剂，每批放大试验的规模，至少应为10000片或粒。大体积包装的制剂，如静脉注射液等，每批放大规模的数量至少应为各项试验所需总量的10倍。特殊品种、特殊剂型所需数量，根据具体情况另定。要求4: 供试品的质量标准应与临床前研究及临床试验和规模生产所使用的供试品质童标准一致。要求5: 加速试验与长期试验所用供试品的包装应与上市产品一致。原料药所用包装应采用模拟小桶，但所用材料与封装条件应与大桶一致。实验室规模的产品仅可用作辅助性稳定性预试验。要求6: 研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法与有关物质(含降解产物及其他变化所生成的产物)的检查方法，并对方法进行验证，以保证药物稳定性结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视有关物质，特别是降解产物的检查和鉴定。要求7: 由于放大试验比规模生产的数量要小，故药品注册申请人应在获得批准后，从放大试验转人规模生产时，对最初通过生产验证的3批规模生产的产品仍需进行加速与长期稳定性试验。 二、原料药物与药物制剂的稳定性试验1、原料药物（1）影响因素试验影响因素试验是将药品置于比加速试验更为剧烈的条件下进行的稳定性考察。其目的是探讨药物的固有稳定性，了解影响其稳定性的因素及可能的降解途径与降解产物，为制剂生产工艺、包装，、贮存条件和建立降解产物分析方法提供科学依据。当试验结果发现降解产物有明显的变化，应考虑其潜在的危害性，必要时应对降解产物进行定性或定量分析，汇智泰康可提供降解产物推断与含量检测服务。（2）加速试验此项试验是在加速条件下进行。其目的是通过加速药物的化学或物理变化，探讨药物的稳定性，为制剂设计、包装、运输、贮存提供必要的资料。（3）长期试验长期试验是将药物置于接近实际贮存的条件下进行的稳定性考察，目的是为制订药物的有效期提供依据。2、药物制剂药物制剂稳定性研究，首先应查阅原料药物稳定性有关资料，特别了解温度、湿度、光线对原料药物稳定性的影响，并在处方筛选与工艺设计过程中，根据主药与辅料性质，参考原料药物的试验方法，进行影响因素试验、加速试验与长期试验。（1）影响因素试验药物制剂进行此项试验的目的是考察制剂处方的合理性与生产工艺及包装条件。（2）加速试验此项试验是在加速条件下进行，其目的是通过加速药物制剂的化学或物理变化，探讨药物制剂的稳定性，为处方设计、工艺改进、质量研究、包装改进、运输、贮存提供必要的资料。（3）长期试验长期试验是在接近药品的实际贮存条件下进行，其目的是为制订药品的有效期提供依据。 三、稳定性重点考察项目原料药物及主要剂型的重点考察项目见附表，表中未列人的考察项目及剂型，可根据剂型及品种的特点制订。剂型稳定性重点考察项目剂型稳定性重点考察项目原料药性状、熔点、含量、有关物质、吸湿性以及根据品种性质选定的考察项目口服乳剂性状、含量、分层现象、有关物质片剂性状、含量、有关物质、崩解时限或溶出度或释放度口服混悬剂性状、含量、沉降体积比、有关物质、再分散性胶囊剂性状、含量、有关物质、崩解时限或溶出度或释放度、水分，软胶囊要检查内容物有无沉淀散剂性状、含量、粒度、有关物质、外观均匀度注射剂性状、含量、pH值、可见异物、不溶性微粒、有关物质，应考察无菌气雾剂递送剂量均一性、微粒子剂量、有关物质、每瓶总揿次、喷出总量、喷射速率栓剂性状、含量、融变时限、有关物质吸入制剂递送剂量均一性、徽细粒子剂量软膏剂性状、均匀性、含量、粒度、有关物质喷雾剂每瓶总吸次、每喷喷量、每喷主药含量、递送速率和递送总量、微细粒子剂量乳膏剂性状、均匀性、含量、粒度、有关物质、分层现象颗粒剂性状、含量、粒度、有关物质、溶化性或溶出度或释放度糊剂性状、均匀性、含量、粒度、有关物质贴剂（透皮贴剂）性状、含量、有关物质、释放度、黏附力凝胶剂性状、均匀性、含量、有关物质、粒度，乳胶剂、应检查分层现象冲洗剂、洗剂、灌肠剂性状、含量、有关物质、分层现象(乳状型) 、分散性(混悬型)、冲洗剂应考察无菌性状眼用制剂如为溶液，应考察性状、可见异物、含量、pH值、有关物质;如为混悬液，还应考察粒度、再分散性; 洗眼剂还应考察无菌:眼丸剂应考察粒度与无菌搽剂、涂剂、涂膜剂性状、含量、有关物质、分层现象(乳状型) 、分散性(混悬型)，涂膜剂还应考察成膜性丸剂性状、含量、有关物质、溶散时限耳用制剂性状、含量、有关物质，耳用散剂、喷雾剂与半固体制剂分别按相关剂型要求检查糖浆剂性状、含量、澄清度、相对密度、有关物质、pH值鼻用制剂性状、pH值、含量、有关物质，鼻用散剂、喷雾剂与半固体制剂分别按相关剂型要求检查口服溶液剂性状、含量、澄清度、有关物质注：有关物质（含降解产物及其他变化所生成的产物）应说明其生成产物的数目及量的变化，如有可能应说明有关物质中何者为原料中的中间体，何者为降解产物，稳定性试验重点考察降解产物。 四：稳定性试验的分析方法与要求适用于药物稳定性试验样品质量检测的分析方法称为稳定性指示分析法。稳定性指示分析法应该能够准确检测出药物原料和制剂的质量随着稳定性试验考察因素的作用和时间的延长而可能出现的变化。稳定性指示分析法应能够不受降解产物、工艺杂质、赋形剂或其他潜在杂质的影响，而准确测定药物中的活性成分，并能够定性和（或）定量地监测药物中的杂质（包括降解产物）。稳定性试验中所用的含量测定方法应当具备稳定性指示能力。如果所用含量测定方法的专属性不能满足稳定性试验的要求，则必须增加能够进行杂质(包括降解产物)定性和定量监测的分析方法对其进行补充。所以，常用的稳定性指示分析法主要是色谱分析法，如PLC，HPTLC等。稳定性指示分析法建立时，为了保障其适用性，通常均要求在试验样品的制备、分析条件的建立和试验方法的验证3个方面进行全面的试验研究。1、试验样品的制备试验样品包括：起始原料、中间体，粗品原料、药物成品，以及将药物经过破坏（苛性）处理使主成分含量下降约5%~20%而包含分降解产物的样品。对于复方制剂，则需要对各药效成分既分别又合并进行破坏处理。常用的破坏处理方法是将药物固体和（或）其适宜的溶液置于比加速和影响因素试验更为剧烈的条件下进行破坏，生成分降解产物。这样既可以满足考察稳定性指示分析法适用性的需要，又可以建立药物的分降解行为与途径，鉴定可能的分降解产物，并获得药物的内在稳定性特征。从而为预测药物在贮藏过程中可能出现的分降解产物，并为药物的生产制备工艺、制剂处方工艺、包装与贮藏等条件的优化与建立提供参考。药物的化学结构不同，理化性质有差异，其分降解行为也常常不同。水解、氧化、异构化或聚合等，是药物分降解的主要途径，并有可能出现多途径降解。所以，常用的破坏处理方法包括水解、氧化、高温和光照等。当药物在通常的溶剂条件下的溶解度不合适时，还可以添加适宜的有机溶剂助溶，以便有效地产生分降解反应。破坏处理时，需同时制备:空白溶剂或辅料、平行破坏处理的空白溶剂或辅料、未经破坏处理的样品、平行破坏处理的单组分样品，以便识别和鉴定分降解产物及其来源。并可适当增减调整破坏处理的程度，以便获得破坏程度适宜的降解样品。对于具有手性、多晶型或顺反异构的药物，还须特别考察破坏处理过程中的手性、晶型或异构的转化。2、分析方法的建立常用的稳定性指示分析法均为具有良好分离能力和专属性的色谱方法。为了检验稳定性指示分析法的专属性和适用性，应采用起始原料、中间体、粗品原料及药物经过破坏处理生成分降解产物的样品，进行分离效能的考察，确保所使用的方法满足药物中活性成分的专属与准确测定要求，满足有关物质的定性和（或）定量检査的要求。所以，在稳定性指示色谱测定条件的建立过程中，必须对主成分峰以及需要逐一进行定量测定的所有特定杂质峰，分别采用适宜的手段进行专属性的确证。专属性确证常用的方法包括：色谱峰纯度PDA或MS鉴定的直接检查法；改变色谓条件或色谱系统，考察和比较色谱峰分离的间接检查法；以及添加杂质对照的验证检查法。由于分降解产物与药物活性成分常常具有明显的理化和色谱行为差异，所以，在药物杂质检查和稳定性指示分析测定中，梯度HPLC 的使用巳变得越来越广泛。例如，ChP中阿司匹林的有关物质检查，自ChP2010即采用了梯度HPLC，而在ChP2005相应标准中，除游离水杨酸外，没有进行有关物质的检查。当然，稳定性指示分析法并不一定要使破坏产生的所有分降解产物均能够获得专属的分离。尤其是那些已经证明在加速和长期稳定性试验中不可能产生的杂质，在稳定性指示分析法建立时，可以不予考虑。汇智泰康分析方法建立步骤：（1）了解样品的性质-化合物的化学结构、分子量、PKa值、溶解度等；（2）确定定性还是定量—涉及标准品的准备（若是定量，需提前准备好标准品）（3）样品的预处理：根据来源形式不同，可能有如下几种形式①可直接进样；②需稀释或加入内标等其他操作；③需要溶解或提取处理的固体。（4）上机检测3、试验方法的验证汇智泰康可根据稳定性指示分析法的类型不同，分别对方法的专属性、线性和范围、精密度、准确度、灵敏度和耐用性等进行必要的验证，结果应与选用方法的类型相适宜。 参考材料：1、原料药物与制剂稳定性试验指导原则2、药品注册管理办法（局令第28号）附件二  

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验，Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay）于 1975年建立并不断发展完善，目前已被世界各国广为采用，已经成为毒理学实验室必需开展的重要实验项目。Ames实验用于检测待分析物质的致突变作用，该验灵敏、高效、检测范围广。Ames 试验原理Ames 试验利用鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株，该缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长；假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌诱导回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的 S9混合液。北京汇智泰康医药技术有限公司针对Ames试验开发Ames试剂盒， 本试剂盒省去了培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株 鉴定、菌株培养等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，菌株特性与活菌数目以及诱导 S9 活性均符合 Ames 试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。Ames试剂盒应用广泛，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。Ames试验导则1 范围本规范确定了鼠伤寒沙门氏菌／回复突变试验的基本原则、要求和方法。本规范适用于化妆品原料及其产品的基因突变检测。2 规范性引用文件OECD  Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。3 定义3.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。3.2 基因突变 （Gene mutation）在化学致突变物作用下细胞DNA中碱基对的排列顺序发生变化。3.3 碱基置换突变 （Base substitution mutation）引起DNA链上一个或几个碱基对的置换。碱基置换有转换(transition)和颠换(transversion)两种形式。转换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘧啶所替代，或一个嘌呤被另一嘌呤所代替。颠换是DNA链上的一个嘧啶被另一嘌呤所替代，或一个嘌呤被另一嘧啶所代替。3.4 移码突变（ Frameshift mutation）引起DNA链上增加或缺失一个或多个碱基对。3.5 鼠伤寒沙门氏菌/回复突变试验（ Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）利用一组鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型试验菌株测定引起沙门氏菌碱基置换或移码突变的化学物质所诱发的组氨酸缺陷型(his-)→原养型(his+)回复突变的试验方法。3.6 S9经多氯联苯(PCB混合物)或苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合诱导的大鼠制备肝匀浆，在9000g下离心10min后的肝匀浆上清液。4 原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。可使用北京汇智泰康医药技术有限公司研发生产的Ames试剂盒，试剂盒省去了培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株 鉴定、菌株培养等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变， 故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。5 仪器和设备培养箱、恒温水浴、振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机，玻璃器皿等。6 培养基和试剂6.1 0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分： L-组氨酸(MW 155) 78mgD-生物素(MW 244) 122mg加蒸馏水至 1000mL配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4℃冰箱。6.2 顶层琼脂培养基成分： 琼脂粉 1.2g氯化钠 1.0g加蒸馏水至 200mL配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。6.3 Vogel-Bonner (V-B) 培养基E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g磷酸氢二钾(K2HPO4) 500g磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 175g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 10g加蒸馏水至 1000mL配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。6.4 20%葡萄糖溶液成分：葡萄糖 200g加蒸馏水至 1000mL配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。6.5 底层琼脂培养基成分：琼脂粉 7.5g蒸馏水 480mLV-B培养基E 10mL20%葡萄糖溶液 10mL配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。6.6 营养肉汤培养基成分：牛肉膏 2.5g胰 胨 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g加蒸馏水至 500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。6.7 盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)成分：氯化钾(KCl) 61.5g氯化镁(MgCl2·6H2O) 40.7g加蒸馏水至 500mL配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。6.8 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 29.015g加蒸馏水至 500mL配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。6.9 S9混合液成分 每毫升S9混合液肝S9 100ml盐溶液 20ml灭菌蒸馏水 380ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液 500ml辅酶II(NADP) 4mmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分， 使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液应该丢弃。6.10 菌株鉴定用和特殊用途试剂6.10.1 组氨酸—生物素平板成分：琼脂粉 15g蒸馏水 944mL(V-B)培养基E 20mL20%葡萄糖 20mL灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL配制：高压灭菌琼脂和水后，将灭菌20%葡萄糖，V-B培养基和组氨酸溶液加进热的琼脂溶液中。待溶液稍为冷却后，加入灭菌生物素，混匀，浇制平板。6.10.2 氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板成分：琼脂粉 15g蒸馏水 940mL(V-B)盐溶液 20mL20%葡萄糖 20mL灭菌盐酸组氨酸溶液（0.5g/100mL） 10mL灭菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/LNaOH中) 3.15mL四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中) 0.25mL配制：琼脂和水高压灭菌20min，将无菌的葡萄糖、VB盐溶液和组氨酸—生物素溶液加进热的溶液中去，混匀。冷却至大约50℃，无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。应该在倾注琼脂平板后几天内，制备主平板。6.10.3 营养琼脂平板成份：琼脂粉 7.5g营养肉汤培养基 500mL配制：于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。7 试验菌株及其生物学特性鉴定7.1 试验菌株采用TA97、TA98、TA100和TA102一组标准测试菌株。7.2 生物学特性鉴定新获得的或长期保存的菌种，在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。菌株鉴定的判断标准，如表1所示。表1 试验菌株鉴定的判断标准菌株组氨酸缺陷脂多糖屏障缺损氨苄青霉素抗性切除修复缺损四环素抗性自发回变菌落数*TA97TA98TA100TA102+++++++++++++++----+90-18030-50100-200240-320注“+”表示需要组氨酸“+”表示具有rfa突变“+”表示具有R因子“+”表示具有△uvrB突变“+”表示具有pAQ1质粒*在体外代谢活化条件下自发回变菌落数略增7.2.1 组氨酸缺陷原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37℃下培养24h后观察结果。结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。7.2.2 脂多糖屏障缺损原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影响。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，然后将浸湿的0.1%结晶紫溶液滤纸条与划线处交叉放置。37℃下培养24h后观察结果。结果判断：假若待测菌在滤纸条与划线交叉处出现一透明菌带，说明该待测菌株具有rfa突变。7.2.3 氨苄青霉素抗性原理：含R因子的试验菌株对氨苄青霉素有抗性。因为R因子不太稳定，容易丢失，故用氨苄青霉素确定该质粒存在与否。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL，在氨苄青霉素平板上划线，37℃下培养24h后观察结果。结果判断；假若测试菌在氨苄青霉素平板上生长，说明该测试菌具有抗氨苄青霉素作用，表示含R因子，否则，表示测试菌不含R因子或R因子丢失。7.2.4 紫外线敏感性原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长，而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于营养琼脂平板上划线，用黑纸盖住平板的一半，置紫外灯下照射（15W，距离33cm）8秒钟。置37℃下孵育24h后观察结果。结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。7.2.5 四环素抗性原理：具有pAQI的菌株对四环素有抗性。鉴定方法：吸取待测菌株增菌液0.1mL于氨苄青霉素/四环素平板上划线，置37℃下孵育24h后观察结果。结果判断：假若测试菌照常在氨苄青霉素/四环素平板上生长，表明该测试菌株对氨苄青霉素和四环素两者有抗性，具有pAQI质粒，否则，说明测试菌株不含pAQI质粒。7.2.6 自发回变原理：每种试验菌株都以一定的频率自发地产生回变，称为自发回变。这种自发回变是每种试验菌株的一项特性。鉴定方法：将待测菌株增菌液0.1mL加到2mL含组氨酸—生物素的顶层琼脂培养基的试管内，混匀后铺到于底层琼脂平板上，待琼脂固化后，置37℃培养箱中孵育48h后记数每皿回变菌落数。结果判断：每种标准测试菌株的自发回变菌落数应符合表1要求。经体外代谢活化后的自发回变菌落数，要比直接作用下的略高。7.2.7 回变特性—诊断性试验原理：每种试验菌株对诊断性诱变剂回变作用的性质以及S9混合液的效应不一。鉴定方法：按照平板掺入试验的操作步骤进行。将受试物换成诊断性诱变剂。结果判断：标准菌株对某些诊断性诱变剂特有的回变结果参见表2。表2 测试菌株的回变性诱变剂剂量(mg)S9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素叠氮化钠ICR—191链霉黑素丝裂霉素C2,4,7-三硝基-9-芴酮4-硝基-O-次苯二胺4-硝基喹啉-N-氧化物甲基磺酸甲酯2-氨基芴苯并（a）芘6.01.51.00.250.50.20200.51.0101.0---------++124761640inhinh8377216052817417423373123363inhinh82441599292236194143473000185inhinh4007984220273030269375921880223027721602876586261255注：inh表示抑菌。表中数值均已扣除溶剂对照回变菌落数。8 大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备8.1 诱导最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。8.2 S9制备动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。9 溶剂的选择如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定加入量为100ml。10 剂量的设计决定受试物最高剂量的标准是对细菌的毒性及其溶解度。自发回变数的减少，背景菌变得清晰或被处理的培养物细菌存活数减少，都是毒性的标志。对原料而言，一般最高剂量组可为5mg/皿。对产品而言，有杀菌作用的受试物，最高剂量可为最低抑菌浓度，无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液。受试物至少应设四个剂量组。每个剂量均做三个平行平板。11 试验操作步骤11.1 增菌培养取营养肉汤培养基5mL，加入无菌试管中，将主平板或冷冻保存的菌株培养物接种于营养肉汤培养基内，37℃振荡（100次/min）培养10h。该菌株培养物应每毫升不少于1～2×109活菌数。11.2 平板掺入法实验时，将含0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液的顶层琼脂培养基2.0mL分装于试管中，45℃水浴中保温，然后每管依次加入试验菌株增菌液0.1mL，受试物溶液0.1mL和S9混合液0.5mL（需代谢活化时），充分混匀，迅速倾入底层琼脂平板上，转动平板，使之分布均匀。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培养箱里孵育48h。记数每皿回变菌落数。实验中，除设受试物各剂量组外，还应同时设空白对照、溶剂对照、阳性诱变剂对照和无菌对照。12 数据处理和结果判断记录受试物各剂量组、空白对照（自发回变）、溶剂对照以及阳性诱变剂对照的每皿回变菌落数，并求平均值和标准差。如果受试物的回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的两倍或两倍以上，并呈剂量-反应关系者，则该受试物判定为致突变阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突变阴性。13 试验报告试验报告应包括以下内容：（1）受试物名称、理化性状、配制方法、使用溶剂；（2）试验菌株：所用试验菌株；（3）代谢活化系统：所用诱导剂；（4）试验方法：简述操作步骤，除受试物剂量分组外，还应说明空白对照、溶剂对照和阳性对照，阳性结果判定标准；（5）结果：以列表方式报告受试物的Ames实验结果（表1）；（6）结论。Ames试剂盒北京汇智泰康医药技术有限公司针对Ames试验开发Ames试剂盒， 本试剂盒省去了培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株 鉴定、菌株培养等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，菌株特性与活菌数目以及诱导 S9 活性均符合 Ames 试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。Ames试剂盒应用广泛，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。包装盒产品组成v5.1（4菌）V5.2（5菌）使用说明保存条件规格数量规格数量A盒琼脂粉Agar66g180g1室温底层培养基GS100mL1100mL1使用前混匀氯化钠3g13g12-氨基芴1mL11mL1200μg/mL，使用前混匀甲基磺酸甲酯1mL11mL1使用前加1 mL灭菌蒸馏水混匀，浓度10μL/mL敌克松1mL11mL1500μg/mL，使用前混匀叠氮钠//0.5mL115μg/mL，使用前混匀2-氨基蒽//0.5mL120μg/mL，使用前混匀S9反应液42mL142mL1使用前混匀底层培养基VS100mL1100mL1使用前混匀B盒HB溶液2.5mL12.5mL1使用前混匀-80℃下长期保存，可保存6个月。-20℃可短期保存3周。请勿反复冻融。1,8-二羟基蒽醌0.5mL10.5mL11mg/mL，使用前混匀S9 混合物1.4mL51.4mL6使用前加2.86 mL冰冷灭菌蒸馏水复溶TA97菌株5.0mL15.0mL1使用前混匀TA98菌株5.0mL15.0mL1TA100菌株5.0mL15.0mL1TA102菌株5.0mL15.0mL1TA1535菌株//5.0mL11. 诱导 S9 采用国际先进无菌冻干干燥工艺制成，实现了诱导 S9 酶活性的稳定保存，同时有效防止了细菌污染。实验时用 S9 反 应液溶解混匀。2. 实验菌株采用先进工艺规模化制备，出厂前经过严格的质量检测，低温贮存条件确保了实验菌株的长期稳定性。实验时混 匀后即可直接使用，节省了菌株鉴定、活化处理以及菌液浓度调整等时间。3. 实验阳性对照试剂种类覆盖整个 Ames 实验要求，在添加和不添加 S9 的情况下均可以诱导实验菌株呈现阳性反应。阳性对照 试剂采购自国际大品牌公司，按照 Ames 实验需求精准定量分 装，出厂前经过实验检测，阳性对照试剂的长期稳定性有质量 保证。4. 底层培养基 VS、GS 以干粉形式提供，便于培养基长期稳定 保存。使用前只需添加蒸馏水灭菌处理即可，试剂瓶采用耐高 温材料，因此可以直接向试剂瓶中添加所需剂量的蒸馏水。5. 顶层培养基 HB 冻干球采用先进无菌冻干干燥工艺制成，使用前需先用灭菌蒸馏水溶解，然后用 0.22μm 滤膜过滤除菌。试剂盒应用范围本试剂盒应用范围非常广，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装 材料等遗传毒理学检测。传统实验操作不足周期长——培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株鉴定、菌株培养 等耗费大量时间。 稳定性差——杂菌污染、活菌数不符合要求、实验试剂配制不准 确等都会导致实验失败。试剂盒优势便捷—— 本试剂盒省去了培养基成分准备、诱导 S9 制备、菌株 鉴定、菌株培养等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染， 菌株特性与活菌数目以及诱导 S9 活性均符合 Ames 试验要求，实 验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。试剂盒使用操作流程1. 实验器材、试剂准备：三角瓶、5mL 或 15mL 试管、100μl 和1000μl 枪头、0.22μm 滤膜、注射器、平皿、二甲基亚砜、灭菌 蒸馏水等；2. 设置待测物剂量，配制各剂量无菌待测物溶液；3. VS、GS 培养基加水溶解并灭菌，配制底层培养基；4. HB 球加灭菌蒸馏水溶解，充分混匀，然后过滤除菌；5. 实验当天配制顶层培养基，2ml 分装，然后 45℃水浴保温；6. 用无菌蒸馏水溶解 S9 复合物并配制 S9 反应混合液；7. 开展 Ames 实验，将 2mL 顶层培养基+100μL 菌液+100μL 待测 物或阳性底物+500μL10% S9 混合液混匀，倾倒于底层培养基（实验室温度低时倾倒的顶层培养基易冷凝，可将底层培养基 放置于 37℃培养箱一段时间，然后再倾倒顶层培养基）；8. 待顶层培养基冷凝后，将实验平皿放入 37℃培养箱，培养 48h后观察实验结果；试验方法试验方法主要是平板掺入法和预培养平板掺入法，具体操作如下：1. 平板掺入法a) 准备所需底层培养基平皿若干。b) 融化顶层培养基分装于无菌小试管，每管2 mL，在45℃水 浴中保温。c) 在保温的顶层培养基中依次加入测试菌株菌液0.1 mL，混 匀；加受试物0.05 mL~ 0.2 mL（一般加入0.1 mL。需活化时 另外再加入10 % S9反应混合液 0.5 mL），再混匀，然后迅 速倾入底层培养基上。转动平皿，使顶层培养基均匀分布 在底层上，平放固化，37℃ 培养 48 h观察结果。d) 另做一阳性对照、溶剂对照和未处理对照。阳性对照不加 受试物，只加标准诱变剂（即试剂盒阳性对照试剂，见表2）；溶剂对照加除受试物和标准诱变剂以外的所有试剂， 如溶剂二甲基亚砜等（光谱纯或分析纯）；未处理对照只 在培养基上加菌液；其他方法同上。2. 预培养平板掺入法 预培养对于某些受试物可取得较好效果。因此可根据情况确定 是否进行预培养。在加入顶层琼脂前，先进行以下预培养步骤：在试验中，将受试物（需活化时另加入10% S9反应混合 液）和菌液，在37℃中培养20min，或在30℃中培养30min，然 后再加2mL顶层琼脂，其他同上述平板掺入法。试验设计及受试物的特殊处理1) 剂量设计 决定受试物最高剂量的原则是受试物对试验菌株的毒性和受试物的溶解度。对于纯的化学物质，一般最低剂量为每平皿0.2 μg，最高剂量为 5 mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细菌产生最小毒性浓度。对于毒性很低、摄入量很大的定型产品，可根据其溶解度和对细菌的毒性采用可能的最大剂量。每 种受试物在允许最高剂量下设4个（含4个）以上剂量，每剂量间隔不超过5倍，每个剂量应做三个平皿。2) 溶剂 溶剂可选用水、二甲基亚砜或其他溶剂（溶剂剂量应限定在毒性剂量以下。以二甲基亚砜为例，平板掺入法每皿不超过0.1mL 溶剂；预培养平板掺入法每皿不超过0.01mL 溶剂）， 无论选用什么溶剂均应无诱变性。3) 对照组的设置 试验应同时设有阳性物对照组、溶剂对照组和未处理对照，均 包括加S9和不加S9两种情况。4) 受试物的特殊处理 若遇特殊受试物作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：a) 含组氨酸受试物：根据食品中测得的组氨酸含量若能诱发 回复突变率的增高可加设组氨酸平行对照组；或将检品经XAD-II树脂柱过滤洗脱预处理。b) 食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成 分，可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。c) 挥发性受试物：可采用真空干燥器处理等方法。d) 天然植物材料：可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。结果的判定以直接计数培养基上长出回变菌落数的多少而定，如在背景生 长良好条件下，受试物组回变菌落数是溶剂对照回变菌落数的 两倍或两倍以上，并有剂量反应关系或至少某一测试点有可重 复的并有统计学意义的阳性反应，即可认为该受试物诱变试验 阳性。受试物经上述四个试验菌株测定后，只要有一个试验菌 株，无论在加S9或未加S9条件下为阳性，均可报告该受试物对 鼠伤寒沙门氏菌为致突变阳性。如果受试物经四个试验菌株检 测后，无论加S9和未加S9均为阴性，则可报告该受试物为致突 变阴性。Ames 实验报道文献举例广东省疾病预防控制中心通过 Ames 试验发现部分染发剂引起试验 菌株 TA97、TA98、TA100 回变率明显升高，提示部分染发类 产品具有致突变作用，可对健康产生危害。何冬梅等、中 国 卫 生检验杂志 2007,17,(11)。人参与女贞子是临床上常见的有一定抗肿瘤效果的补益中药，在 Ames 试验中人参能抑制二氨基芴引起的 TA98 菌株回变菌落数的增加；女贞子能抑制叠氮钠引起的 TA100 菌株回变菌落数的增加，分别表现出抗移码型突变和抗碱基置换型突变的作用。倪娅等、中国保健 2009,17,(17)。生活饮用水经投加二氧化氯处理后对水中石油类污染物具有较 强的去除作用，可使水中有毒有害有致癌性的物质氧化降解为 毒性较小、无致癌作用的小分子物质，并且致突变活性明显降低，Ames 值由阳性转为阴性。高庆然等、工业用水与废水2001,6。喹烯酮是我国自主研发的喹噁啉类一类新兽药，作为抗菌促生 长剂用于猪饲料中， Ames 试验表明喹烯酮对 TA97、TA98、 TA100 和 TA1537 加和不加 S9 在一定剂量下均为阳性。结果提 示，喹烯酮存在一定致突变毒性，应制定最高残留限量。张伟 等、毒理学杂志 2007,04。Ames 试验表明煤和液化石油气（LPG）燃烧颗粒物均具有很强 的直接和间接致突变作用，主要致突变作用来源于硝基和胺基多环芳烃，两种颗粒物同时存在可加大致癌风险。闫洪涛等、 中国公共卫生 2007,04。烷基酚聚氧乙烯醚（APES） 是一大类表面活性剂家族，广泛 用于家庭和工业的清洁产品，烷基酚类化合物是其降解产物， 其中对甲基苯酚、2,6-二甲基苯酚、4-乙基苯酚、4-辛基苯酚、对壬基苯酚、4-硝基苯酚、2-氯苯酚、1,3-二氯苯酚、2,4-二氯 苯酚、2,6-二氯苯酚、三氯苯酚和 2,3,5,6-四氯苯酚 12 种化合物 的 Ames 试验表明除 2,4- 二氯苯酚未诱发各菌株的阳性反应外，其余 11 种待测物均诱发了阳性反应,说明这 11 种苯酚类化 合物均具有致突变性。杨丽等、东北师大学报（自然科学版）2003,01。重组葡糖激酶作为一种生物技术药物具有明显的溶栓和抗凝效果，Ames 实验结果显示重组葡糖激酶对试验菌株 TA97 、TA98、TA100 和 TA102 无诱发回变作用。刘永学等、癌变·畸变·突变 2004,9。常见问题及原因分析1、自发回变数显著低于标准 原因：a. 试剂盒保存条件不合适，菌株失活或营养成分降解；b.培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量低；c.操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；2、自发回变数显著高于标准 原因：a. 培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量高；b.培养皿经环氧乙烷消毒不彻底或环氧乙烷有残留；3、阳性底物诱变菌落数偏离标准范围 原因：a. 阳性底物溶解不彻底或未充分混匀；b. 阳性底物添加量不准确；c. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9失活；d. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；4、待测物诱变菌落数非常低或没有菌落 原因：a. 待测物或待测物溶剂对细菌生长有毒性；b. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9 失活； c. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；5、菌落分布不均匀，集中偏向一侧。原因： 倒底层或顶层培养基时平皿未水平放置；6、顶层或底层培养基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 顶层或底层培养基中琼脂粉含量低；b. 顶层培养基中加入的溶剂或待测物酸化，导致凝胶不充分；7、如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性 将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。如果经受试 物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处 理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,则说明经受试物处理 的菌株没有发生突变，试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。

 TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。TK基因突变试验导则1  范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。本标准适用于评价受试物的致突变作用术语和定义TK基因哺乳类动物的胸苷激基因2  术语和定义TK基因：人类的TK基因定位于17号染色体长臂远端；小鼠的则定位于号染色体突变频率：在某种细胞系中，某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的比例(单位通常为10-6)。3  原理TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变4  仪器和设备   培养箱、恒温水浴、二氧化碳培养箱、压力蒸汽消毒器、、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、倒置显微镜、离心机、无菌细胞培养瓶，玻璃器皿等5  培养基5.1  完全培养基RPMI1640培养液，加入10%马血清(培养瓶培养)或20%马血清(96孔板培养)及适量抗菌素(青霉素、链霉素的最终浓度分别为100IU/mL及100μg/mL。5.2  THMG和TMG选择培养基THMG培养基6  试验方法6.1  细胞和培养条件TK+/-型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞或TK6人类淋巴母细胞。两种细胞均在5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。为避免在培养和传代期间自发突变的细胞对试验结果的影响，在正式试验前，应清除自发突变的TK-/-基因型细胞。6.2  受试物6.2.1  受试物的配制固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂或赋形剂中，在处理细胞前适当稀释。液体受试物可直接加至试验系统和或于染毒前稀释。应该使用新鲜制备的受试物，除非稳定性资料证实可以贮存。6.2.2  受试物剂量设定至少应设置3个~4个可供分析的浓度。对于有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性预试验结果在RS或RSG为20%~80%范围内设3个~4个剂量(浓度)水平，同时应该考虑受试物对溶解度、pH和摩尔渗透压浓度的影响。方法是：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL,按1%体积加入不同浓度受试物，37℃震摇处理3h(L5178Y细胞)或4h(TK6细胞)，细胞经离心洗涤后，作2d(L5178Y细胞)或3d(TK6细胞)表达培养，每天计数细胞密度并计算相对悬浮生长(RSG)。或取上述处理后细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1,6个细胞/孔),每个剂量种1块~2块平板,，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数，计算相对存活率(RS)。对于细胞毒性极低的受试物，最高浓度应设为5mg/ mL、5uL/mL或0.01mol/L.。对于相对不溶解的物质，其最高浓度的设置应达到不影响细胞培养的最大可加入浓度。6.2.3  对照一般情况下，每一项试验中，在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照瓶组。当使用代谢活化系统时，阳性对照物应使用要求代谢活化、并能引起典型突变集落的物质，可以使用3-甲基胆(3- methyleholanthrene)、环磷酰胺( cyclophosphamide,CP)等。在没有代谢活化系统时阳性对照物可使用甲基.磺酸甲酯( methyl methane sulfonate,MMS)、丝裂莓素C( mitomycin C,MMC)、甲基.磺酸乙酯( ethylmethane sulfonate,EMS)等使用其他适宜的阳性对照物。溶媒应是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。溶媒首先选蒸馏水，如使用非水溶媒（可选择二甲基亚砜、丙.酮、乙醇等），则需增设溶媒对照。6.3  处理取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1%体积加入受试物(需代谢活化的情况下，同时加终浓度为10%的S9混合物)，37℃振摇处理3h（L5178Y细胞）或4h(TK6细胞)，以800~100r/min的速度离心4min-6min，弃上清液，用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞2遍，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。6.4  PE0（0d的平板接种效率）测定取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板(每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔)，每个剂量种1块~2块平板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12d。计数每块平板有集落生长的孔数。6.5  表达取6.3所得细胞悬液，作2d(1L5178Y细胞)或3d(TK6细胞)表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下，计算相对悬浮生长(RSG)。6.6  PE2(L5178Y细胞)或PE3 (TK6细胞)测定表达培养结束后,取适量细胞悬液,按6.4方法测定PE2/ PE3。6.7  突变频率（MF）测定6.7.1  L5178Y细胞L5178Y细胞表达培养2d后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104/mL，加人TFT(终浓度为3ug/mL.)，混匀，接种96孔板(每孔加0.2mL，即平均2000个细胞/孔)，每个剂量作2块~4块板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养12d，计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落Large Colony,LC：直径≥1/4孔径，密度低)和小集落(small colony，SC：直径7  大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联.苯（PCB混合物），苯巴bi妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。8  数据处理和结果评价8.1  数据处理8.1.1  平板效率（PE0、PE2）其中，EW为无集落孔数，TW为总的孔数，1.6为每孔接种细胞数。8.1.2  相对存活率（RS）：8.1.3  相对悬浮生长（RSG）每日细胞增长率（DGG）：8.1.4  相对悬浮生长（RSG）8.1.5  相对总生长（relative total growth，RTG）其中，RSn 第2天（L5178Y细胞）的相对存活率。8.1.6  突变频率（MF）其中，EW——96孔板无集落孔数；TW——96孔板总的孔数；N——每孔接种细胞数（此处N=2000），PE2——第2天L5178Y细胞的平板效率。此外，对于L5178Y细胞，可分別计算大集落突变率(L-MF)、小集落突变频率(S-MF)和总突变频率(T-MF)。对于TK6细胞，可分别计算正常集落突变频率(N-MF)，缓慢生长集落突变频率S-MF)和总突变频率(T-MF)。8.1.7  小集落突变百分率8.2  结果评价8.2.1  试验成立条件试验所用L5178Y细胞的自发突変频率应在50X10-6~200X10-6之间；TK6细胞的自发突变频率应在1.5X10-6~5.5X10-6之间，同时自发突变频率应在本实验室历史记录范围内。阴性/溶媒对照的PE0在60%~140%之间，PE2/ PE3的值在70%~130%之间。阳性对照的T-MF与阴性/溶媒对照有显著差异，或是阴性/溶媒对照3倍以上。8.2.2  受试物阳性和阴性结果的判定与阴性照组相比较，在所有染毒条件下，一个或多个剂量水平上基因突变频率差值超过126.0×10-6（总评价因子，GEF）。试验样品所诱发的基因突变频率出现浓度依赖性的增加。 结果同时满足上述标准，判定为阳性结果；否则，判定为阴性结果9 试验的解释TK基因突变试验具有较高的敏感性，可检出包括点突变、大的缺失、重组、异倍体和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变，长时间处理还可检出某些断裂剂、纺锤体毒物和多倍体诱导剂等。但体外试验不能完全模拟哺乳动物体内代谢条件，因此，本试验结果不能直接外推到哺乳动物。阳性结果表明受试样品在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞基因突变；阴性结果表明在该试验条件下受试样品不引起所用哺乳类细胞基因突变。评价时应综合考虑生物学意义和统计学意义。汇智泰康TK基因突变试剂盒优势便捷—— 本试剂盒省去了诱导 S9 制备，阳性底物、筛选培养基的配制和浓度条件摸索的时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合L5178Y细胞基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。TK基因突变试剂盒使用说明书【产品说明】汇智泰康TK基因突变试剂盒提供进行体外哺乳动物细胞TK基因突变试验所需的主要试剂和细胞，可用于评价受试物的致突变作用。其中所用细胞和试剂均符合国标要求，且在国标的基础上引入了MTT染色法，使的结果观察更为直观，为实验结果的可靠性提供了支持。产品组分    规格    数量    使用说明    保存条件细胞（L5178Y）    1mL    1    /    -70℃THMG（100×）    0.5mL    1    使用前混匀    THG（100×）    0.5mL    1    使用前混匀    S9复合物    5.0mL    1    冰浴融化并混匀    环磷酰胺（CP）    0.5mL    1    800 μg/mL，使用前混匀    三氟胸苷（1000）    2mL    1    3 mg/mL，使用前混匀    磷酸盐缓冲液    60mL    1    使用前混匀    室温甲基.磺酸甲酯（MMS）    0.5mL    1    1.5 mg/mL，使用前混匀    染色剂MTT    70mL    2    1 mg/mL，使用时10μL/孔加入96孔板中    【产品使用说明】1、细胞复苏从-70冰箱取出细胞，于37℃水浴融化，1000rpm离心5min，弃上清，用含10%马血清、0.2mg/mL丙.酮酸钠的RPMI 1640培养液（RPMI-10）中重悬细胞；1000rpm再次离心5min，弃上清，用RPMI-10重悬后接种于细胞瓶中培养。2、自发突变细胞清除取对数生长期细胞悬液，于含1% 的THMG（100×）的完全培养基中培养24 h，1000 r/min离心5 min，洗涤后于含1%的THG（100×）完全培养基中继续培养2 d。3、染毒处理取生长良好的细胞，调整细胞密度为5×105个/mL（细胞数可根据实验室情况做调整），在加或不加代谢活化系统的条件下，按1%的体积加入不同浓度的受试物，37℃，70 rpm/min染毒处理3h，每个试验组平行处理两份培养物。（1）S9混合液及染毒用细胞液配制（2）推荐染毒培养体系配制方案（以4个受试物剂量组为例）4、表达培养染毒细胞经离心洗涤后，重悬细于RPMI-10培养液中，于在细胞培养瓶中表达培养2 d。每天测定细胞密度，计算悬浮生长（SG）、相对悬浮生长（RSG）和细胞相对总生长（RTG），具体方法可参照国标方法要求。5、突变频率测定表达培养2天后，用含20%马血清、0.2mg/mL丙.酮酸钠的RPMI 1640培养液（RPMI-20）重悬细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，加入TFT（终浓度3 μg/mL），混匀，0.2mL/孔接种96孔板（即2000个细胞/孔），于37℃、5% 二氧化碳的培养箱中培养12 d，10μL/孔加入MTT染色剂，继续于培养箱中放置2~4h，计数每块平板有大集落LC和小集落SC生长的孔数。试验样品处理组和阳性对照组每份培养物各设2个重复；阴性溶媒对照组设4个重复。6、数据处理和结果评价数据处理方法和结果判定可参照：476 体外哺乳动物细胞基因突变试验，化学品测试方法健康效应卷（第二版），中国环境出版社，2013年（ISBN：978-7-5111-1476-1）；OECD 490等。 

cyp450酶代谢表型研究原理及实验方法1 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组p450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。 1.2 cyp450酶代谢表型研究的意义为获得更好的治疗效果，联合用药在临床治疗中已非常普遍。然而，在获得更好的疗效的同时，常伴随着由药物-药物相互作用（drug-drug interaction，ddi）引起的不良反应事件的发生。如特非那丁与酮康唑合用时，酮康唑可显著地抑制特非那丁的代谢，造成特非那丁的血药浓度显著升高，可以导致致命的室间心律失常。因此，在新药临床前研究中，对药物的代谢酶表型进行鉴定，获得其主要代谢酶的消除比例，阐明参与药物体内代谢转化的相关酶亚型，对于研究药物的代谢机制，预测药物代谢多态性和药物间相互作用等方面具有重要意义。药物代谢酶表型鉴定，主要是研究参与药物清除的代谢酶的类型、数量和相对贡献率。如果药物主要通过单一的代谢途径对药物进行清除，可能会存在很大的用药风险；相反，如果某一药物的代谢过程涉及的代谢酶越多，则说明其代谢途径也越多，也就难以发生潜在的药物-药物相互作用，使得患者之间的治疗偏差降低。北京汇智泰康生物技术有限公司针对cyp450酶代谢表型研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，以化学抑制法为基础，开发了一款专门用于cyp450酶代谢表型研究的试剂盒，该产品可直接用于药物cyp450酶代谢表型研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合cyp450酶代谢表型研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。图1为采用肝微粒体技术研究西尼地平与几种临床常用药物间的代谢相互作用的实例，结果表明环孢素、红霉素和辛伐他丁在体外表现出对西尼地平代谢的抑制作用，由于三者均是cyp3a的抑制剂或底物，这提示西尼地平与cyp3a的抑制剂或底物合用时可能会出现代谢上的相互作用，使西尼地平的代谢速率降低，西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物生成减少，而原型药物的水平显著提高，这可能会影响临床疗效的正常发挥。 图1 人肝微粒体中几种临床常用药物对西尼地平代谢的影响如果合用的药物具有潜在的抑制或诱导代谢酶的能力，则前者将受到合用药物的影响，从而使其代谢清除途径发生量化的改变，这种药物相互作用可能会影响治疗效果，增加药物的治疗失败率，甚至诱发不良反应。因此，通过对代谢酶表型的体外研究来判定该化合物的主要代谢酶亚型，已成为药物临床前代谢研究工作中*的一部分。1.3 cyp450酶及代谢表型研究方法cyp450为一类含亚铁血红素蛋白的超家族，根据相关酶亚型在药物代谢中的重要程度，可将cyp450分为以下三类：（1）主要cyp450，包括cyp1a2、cyp2c9 、cyp2c19 、cyp2d6 和cyp3a4；（2）较主要cyp450，包括cyp2b6、cyp2c8和cyp3a5；（3）次要cyp450，包括cyp1a1、cyp1b1、cyp2a6、cyp2e1、cyp2j2和cyp4a11等。参与药物代谢的动物肝微粒体p450酶较为复杂，而人肝微粒体中参与药物代谢的p450酶相对比较简单，主要有cyp1a、cyp2c、cyp2d、cyp2e和cyp3a，其组成见图2。 图2 人肝内p450酶的组成目前，cyp450的酶表型鉴定主要使用以下3种方法：选择性抑制法、重组人源cyp450同工酶法、相关性分析法。选择性抑制法又分为化学抑制法和抗体抑制法，即在加入和不加入一系类cyp450酶亚型选择性化学抑制剂或抗体的条件下，分别测定人肝微粒体对药物的代谢活性，以考察人肝微粒体中cyp450酶亚型倍选择性抑制后，药物的代谢是否受到影响，从而计算相对抑制百分率，推断cyp450酶代谢表型。其中，化学抑制法由于其操作简单，且价格低廉而得到广泛应用。2 实验原理参与药物代谢的cyp450酶主要为cyp1、cyp2和cyp3三个家族，共有7种重要的亚型，分别为cyp1a2、cyp2a6、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6、cyp2e1和cyp3a4；α-奈黄酮为cyp1a2的特异的选择性抑制剂，毛果芸香碱为cyp2a6的特异的选择性抑制剂，噻氯匹定为cyp2c19的特异的选择性抑制剂，奎尼丁为cyp2d6的特异的选择性抑制剂，二乙基二硫代氨基甲酸钠为cyp2e1的特异的选择性抑制剂，酮康唑为cyp3a4的特异的选择性抑制剂，磺胺苯吡唑为cyp2c9的特异的选择性抑制剂，如选用特异的选择性抑制剂抑制不同亚型的酶的活性，便可研究药物的cyp450酶代谢表型。3 实验方法描述肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以nadph再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用hplc、hplc-mc和hplc-mc/mc测定温孵液中原型药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定的方法。3.1 肝微粒体制备p450酶主要在肝脏中表达，肝脏中的p450酶在体外是以微粒体的形式存在的。微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图3）：图3 肝微粒体制备流程图3.2 体外孵育体系的建立cyp450酶代谢表型研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，再加入酶特异的选择性抑制剂，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µl，体系包括0.1m ph 7.4 的磷酸缓冲液，汇智泰康nadph发生系统（1mm nadp，5 mm的6-磷酸葡萄糖，1 u/ml 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mm的氯化镁）；0.5 mg/ml的肝微粒体蛋白；适量的选择性抑制剂；合适浓度的待测物，于37°c水浴孵育，每个样品平行3次，以不加选择性抑制剂组为对照。于预设的反应时间点，加入等体积预冷的乙腈终止反应。3.3 原型药物或代谢产物的检测采用hplc、hplc-mc和hplc-mc/mc测定温孵液中原型药物或其代谢产物的浓度。例：下图（图4、图5、图6）为研究某一候选药物的cyp450酶代谢表型的实验，该实验采用选择性化学抑制剂的方法分析了该药物在鼠、犬和人肝微粒体中的代谢情况，从而判断微粒体中哪些cyp450亚型是该药物的主要代谢酶。数据计算：用待测物的消除速率表示待测物在微粒体孵育体系中的代谢速率。抑制率%=（1- 加入抑制剂样品代谢速率/空白对照样品代谢速率）×100% 图4 大鼠肝微粒中某药物的代谢抑制率 图5 犬肝微粒中某药物的代谢抑制率 图6 人肝微粒中某药物的代谢抑制率从上图可知，不同种属微粒体中，该候选药物的代谢抑制率存在差异。表明，不同种属微粒体中参与该候选药物代谢的酶亚型可能不同。4 本公司cyp450酶代谢表型研究试剂盒简介北京汇智泰康生物技术有限公司针对cyp450酶代谢表型研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，以化学抑制法为基础，开发了一款专门用于cyp450酶代谢表型研究的试剂盒，该产品可直接用于药物cyp450酶代谢表型研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合cyp450酶代谢表型研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。4.1 产品说明本产品提供了cyp450酶代谢表型研究用到的肝微粒体、nadph再生系统、酶特异性抑制剂及其它组分，可直接用于药物cyp450酶代谢表型研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。4.2 试剂盒优势便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。4.3 产品组成    50反应/盒，200μl/反应。产品名称规格数量a液（20×）600μl /支1支b液（100×）120μl /支1支肝微粒体（20mg/ml）300μl/支1支阳性底物（200×）50μl/支1支选择性抑制剂60μl /支7支0.1m pbs缓冲液10ml/瓶1瓶4.4 产品使用说明本产品需于-70℃冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：4.4.1 试验组1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；例：200μl孵育体系配制：名称加入量（μl）a液(20×)10b液(100×)2肝微粒体（20mg/ml）5选择性抑制剂1受试物（200×）10.1m pbs缓冲液181注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%。b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。3）将以上混合液195μl/管分装至1.5ml离心管中，于37℃水浴中保温， 5μl/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入200μl预冷的乙腈终止反应（预冷乙腈：孵育体系体积=1:1）。4.4.2 对照组1）加阳性底物组：反应体系中不加选择性抑制剂，并将受试物换为阳性底物，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1m pbs缓冲液补齐；2）无抑制剂组：反应体系中不加选择性抑制剂，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1m pbs缓冲液补齐；3）无a液、b液组：反应体系中不加a液和b液，其它组分加入量不变，缺少体积用0.1m pbs缓冲液补齐。4.4.3 结果判定    cyp450酶亚型与选择性抑制剂对应一览表。cyp450酶亚型选择性抑制剂cyp1a2α-奈黄酮cyp2a6毛果芸香碱cyp2c19噻氯匹定cyp2d6奎尼丁cyp2e1二乙基二硫代氨基甲酸钠cyp3a4酮康唑cyp2c9磺胺苯吡唑4.5 运输条件    干冰运输。4.6 注意事项1.试验开始前，请自行准备1.5ml离心管、不同规格枪头、乙腈、37℃水浴锅等。2.本产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。3.使用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。4.于-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。5.在使用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。

 药物血浆蛋白结合率（plasma protein binding, PPB）是药物在动物体内重要的药理学参数之一，影响着药物体内游离浓度进而影响药物的处置过程。药物在进入血液后与血浆蛋白会有不同程度结合，血液中游离药物的比例会影响其在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程，与血浆蛋白结合的药物可能会有更长的半衰期和清除速率，因此测定血浆蛋白结合率对于理解化合物的活性以及组织分布有很重要的参考意义。1 结合蛋白类型血浆蛋白主要作为载体负责各类外源性和内源性分子在循环系统内的转运。其中参与小分子药物结合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和AAG为主。药物与蛋白的结合强弱主要与药物-蛋白亲和力、蛋白丰度相关。2 血浆蛋白结合率常用测定方法目前常用于PPB测定的方法主要包括平衡透析法（equilibrium dialysis），超滤法（utrafiltration method），超速离心法（ultracentrifugation method），凝胶过滤法（gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于药物结合的平衡原理来测定药物游离浓度最常用的方法，也是研究药物血浆蛋白结合率的经典方法。平衡透析法常用种属：大鼠，小鼠，犬，猴，人分析方法：LC-MS/MS各种药物以一定的比率与血浆蛋白结合之后，在血浆中会同时存在结合型与游离型两种类型，游离性药物具有药物活性。药物与血浆蛋白结合会成为结合型药物，暂时失去药理活性，并且储存于血液中，起到药库的作用，对于药物作用及其维持时间长短具有重要的意义。一般蛋白结合率高的药物体内消除慢，作用维持时间长，药效平稳。结合率低的药物体内消除快，同时作用时间短，药效有很大的波动。平衡透析法测定血浆蛋白结合率是用透析膜将蛋白质溶液与缓冲液分隔开，建立在两者之间的一种平衡状态，只有分子量小的药物小分子可以通过。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度与膜的厚度、透析的小分子溶质在膜两边的浓度梯度及透析温度等因素有关。平衡透析法能够直接测出为与蛋白结合的药物小分子的数量，这是分析蛋白与小分子物质结合的关键，从而能够求出结合位点数及结合常数。如图所示，利用半透膜将左右两室进行分隔，左侧加入含药的蛋白溶液，右侧加入空白缓冲液，未被结合的游离药物可以自由穿过半透膜，孵育一定时间后两侧达到平衡，游离药物浓度相等，通过测定两侧药物浓度即可计算得到血浆蛋白结合率。平衡透析法在测定药物血浆蛋白结合率具有操作简单、温度易于控制、PH值可调、设备成本低廉等优点。但是同时存在达成平衡时间较长、溶液体积会变化，且透析时间过长可能会造成由加热或代谢引起的被测物质的降解等缺点。因此在利用平衡透析法测定药物血浆蛋白结合率，或者药物与蛋白质相互作用时需要与其他的一些方法联用，才能获得更准确的作用信息。一般只有血浆蛋白结合率高，分布容积小，消除慢以及治疗指数低的药物在临床上的这种相互作用才有意义。3 血浆蛋白结合平衡透析装置    汇智泰康针对血浆蛋白结合率测定试验研发针对性的平衡透析装置，基于平衡透析法的原理而设计96孔平衡透析装置，可用于血浆蛋白结合率的测定。该装置能够减少非特异性的透析设备表面的药物吸附，缩短平衡时间，提高样品分析的通量。透析膜（半透膜）选用高分子膜，孔径可根据客户需求定制。相关产品：血浆蛋白结合平衡透析装置透析膜血浆蛋白结合试剂盒-猴血浆血浆蛋白结合试剂盒-比格犬血浆血浆蛋白结合试剂盒-大鼠血浆血浆蛋白结合试剂盒-小鼠血浆 

促销产品：Ⅰ相代谢稳定性试剂盒（五种属）Ⅱ相代谢稳定性试剂盒（UGTs）CYP450酶代谢表型研究试剂盒（化学抑制法）CYP450酶代谢表型研究试剂盒（重组酶法/7种酶）酶抑制（IC50）研究试剂盒（7种特异性底物）酶抑制（IC50）研究试剂盒（单酶）探针底物代谢产物（7种混合）NADPH再生系统UGT孵育系统

汇智泰康致力于为农药、药品、化妆品、医疗器械、消毒产品等的登记注册提供专业的毒理学研究服务。公司2020年3月成为农业农村部审批通过的农药登记试验单位，可根据客户的需要设计或定制符合标准的实验方案，以大鼠、小鼠和豚鼠等啮齿类以及家兔等非啮齿动物作为试验系统，采用不同的给药途径（经口、经皮、吸入）、开展单次染毒和反复染毒的GLP符合性安全性评价，提供中、英文评价报告。农药登记毒理学服务主体根据《农药登记管理办法》，农药登记申请人包括：①农药生产企业，即已经取得农药生产许可证的境内企业；②向国内出口农药的企业，即将在境外生产的农药向国内出口的企业；③新农药研究单位，即在我国境内研制开发新农药的中国公民，法人或其他组织。农药登记毒理学服务类别杀鼠剂、生物化学农药、微生物农药、植物源农药、转基因农药、卫生用农药等。农药登记资料要求：申请人根据所申请登记农药产品类别向农业部门提交农药登记申请资料，包括产品化学、毒理学、药效、残留、环境影响等试验报告；风险评估报告、标签或者说明书样张、产品安全数据单、相关文献资料、申请表、申请人资质证明、资料真实性声明等。登记试验报告应当由农业部认定的登记试验单位出具，也可以由与中国政府有关部门签署互认协定的境外相关实验室出具；但药效、残留、环境影响等与环境条件密切相关的试验以及中国特有生物物种的登记试验应当在中国境内完成。汇智泰康作为农业农村部发布的第19、20批农药登记试验单位，可以提供急性毒性、重复染毒毒性、特殊毒性以及代谢与毒物动力学等项下共15项农药登记测试毒理项目认证，是华北地区迄今认证的毒理项目最多的农药测试机构。农药 @农村农业部MOA      试验依据：GB/T 15670 农药登记毒理学试验急性毒性急性经口、经皮、吸入眼刺激皮肤刺激皮肤变态反亚急性、亚慢性毒性试验经口、经皮、吸入特殊毒性试验致突变毒性细菌回复突变染色体畸变微核试验基因突变试验致畸毒性毒代动力学阐释毒物代谢规律和动力学参数其它试验研究内容组织病理研究常规毒理安全评价、药效评价，教学、科研探索性研究，含大动物（狗、猴子、兔子、猪），小动物（大、小鼠、豚鼠）病理解剖、病变观察、石蜡包埋、切片、HE染色、特殊染色（含Masson氏结缔组织三合染色、PAS染色、刚果红染色、甲苯胺蓝染色、茜素红S、吉姆萨染色等）、免疫组化、病理阅片、出具病理报告、以及病理同行评议。  临床病理研究血液学参数（5分类，13项）血生化指标（13项）电解质（5项）尿液参数（10项）骨髓涂片基因分析 

喜讯：汇智泰康遗传毒性Ames试剂盒                         获批中国环境诱变剂学会团标立项4月12日，中国环境诱变剂学会发布公告，公布7项符合立项要求的团体标准，汇智泰康提交的《遗传毒性Ames试剂盒标准》也顺利立项，公告同步发布在全国团体标准信息平台。汇智泰康遗传毒性Ames试剂盒是公司自主研发生产的一体化试剂盒产品，内含Ames试验所需的全部鼠伤寒沙门氏菌株（TA97a、TA98、TA100、和TA1535）、大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）、培养基、组氨酸生物素、S9等试剂。自2013年以来，已经被全国各级食药监系统、疾控系统、创新药研发企业与机构、药物研发合同外包组织（CRO）等多类单位广泛使用，应用领域覆盖化学品、药品、食品、农药、化妆品、医疗器械等。为从事遗传毒性研究的广大客户提供便利，大大减少了Ames试验菌株鉴定，菌株活化，诱导S9制备等步骤与时间。汇智泰康是一家致力于为化学品，药品，食品，农药，化妆品，医疗器械等产品登记注册提供登记检测服务与产品的专业机构，在毒理学研究方面有多年积累，除了Ames试剂盒，还先后研发出体外染色体畸变试剂盒，体外微核试验试剂盒，彗星试验试剂盒，TK基因突变试剂盒，HGPRT基因突变试剂盒等多种遗传毒性研究产品，帮助从事遗传毒性研究客户更加方便快速的完成遗传毒性研究试验。

在评价与人体直接或间接接触的医疗器械产品时，需要对其进行生物学评价，以确保其安全、有效。国际标准化组织医疗器械生物学评价技术委员会（iso/tc94）根据医疗器械的特点制定了iso10993系列标准，阐明了不同类别医疗器械各自考虑的生物学危害终点以及基本的生物学评价原则和方法。我国国家药品监督管理局nmpa参考iso等相关文件，发布了gb/t 16886系列标准及相关配套的行业标准，医疗器械相关企业可根据产品使用时间、接触方式及特点，对其可能引起的生物学危害进行识别、评价、控制，并纳入医疗器械风险管理，确保产品不会产生生物学方面的危害。汇智泰康依托配置齐全的毒理学安全评价平台、分析仪器平台和经验丰富的技术团队，基于aaalac、glp、计量认证（cma）等认证资质，可以为客户提供全面的成械性生物学性能技术服务和合规申报服务等。服务对象主要包括ⅲ类医疗器械，用于植入人体、支持、维持生命；或对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制的医疗器械，产品类别包括以下多种：服务内容：实验项目： 饲养、给药、采血、器械植入手术、代谢笼样本采集小动物：大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠、家兔大动物：猴、狗、小型猪 医疗器械生物学评价（试验依据：gb/t 16886）动物皮肤刺激试验；毒代动力学试验；全身毒性（急性）试验；亚慢性（亚急性）毒性试验；眼部刺激试验；体外细胞毒性试验；遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验；刺激与迟发型超敏反应试验；植入后局部反应试验；环氧乙烷灭菌残留量。组织病理研究服务常规毒理安全评价、药效评价，教学、科研探索性研究，含大动物（狗、猴子、兔子、猪），小动物（大、小鼠、豚鼠）病理解剖、病变观察、石蜡包埋、切片、he染色、特殊染色（含masson氏结缔组织三合染色、pas染色、刚果红染色、甲苯胺蓝染色、茜素红s、吉姆萨染色等）、免疫组化、病理阅片、出具病理报告、以及病理同行评议。临床病理服务血液学分析；血生化、电解质分析；凝血分析；尿液分析；骨髓涂片；基因分析；内分泌激素检测；动物大体观察；ct和nmr检查医疗器械及生物医学材料成分、组织与结构分析浊度和色泽，还原物质、氯化物、酸碱度、蒸发残渣、灼烧残渣、环氧乙烷残留量、紫外吸光度、重金属元素（pb，sn，mn，zn，cd，fe，ni，cu，cr，mo）、浸提液重金属总量残留溶剂、元素分析、有机物分析、灰分、细菌内毒素、溶血、细菌菌落总数、大肠菌群、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、真菌菌落总数等。生物学评价生物样品分析生物样本分析方法全套验证：选择性/特异性、线性和灵敏度、精密度、准确度、基质效应、回收率、稳定性、稀释线性等；体内、体外试验设计；浸提液与降解材料含量检测；潜在降解产物的定性与定量；聚合物医疗器械降解产物的定性与定量；陶瓷降解产物的定性与定量；金属与合金降解产物的定性与定量；降解产物和可溶出物的毒代动力学研究与设计；可沥滤允许限量的确立；药代动力学特征分析，出具总结报告；原始数据保存；接受现场核查。其它技术咨询服务医疗器械研究方案制定；专家咨询讨论会的组织；为客户提供集试验技术服务、代理登记注册接口于一体的综合服务。

基因毒性杂质或者潜在基因毒性杂质，可能严重威胁人类健康，需要严格控制药物中这类杂质的限度。由于基因毒性杂质检测在灵敏度、选择性、待测物稳定性、基质复杂性等方面呈现特殊要求，因此在分析方法的开发和选择上具有与其他药物杂质检测不同的特点。汇智泰康在药品含量分析、杂质分析和、稳定性研究以及药品标准建立和质量控制等方面积累了丰富的经验。什么是基因毒性杂质？根据《中国药典》的相关文件定义，遗传毒性(genotoxcity)是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。遗传毒性杂质(genotoxic impurities，GTIs)是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其他类型的无致突变性杂质。其主要来源于原料药或制剂的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。致突变性杂质(mutagenic impurities)指在较低水平时也有可能直接引起DNA损伤，导致DNA突变，从而可能引发癌症的遗传毒性杂质。而潜在基因毒性杂质（Potential Genotoxic Impurities，PGIs）是指其结构中含有与基因毒性杂质反应活性相似的化学结构，即警示结构（Structural alerts, SAs），通常也作为基因毒性杂质来评估。基因毒性杂质从何而来？基因毒性杂质是从化学试剂、化学合成与反应作用而来的，涉及到合成工艺流程的方方面面以及随后的药品的稳定性和可能的降解，是一个极其复杂的过程问题。如何对这类杂质进行危害评估的呢？致突变性杂质的危害评估方法主要是通过数据库、文献检索，(定量)构效关系［(Quantitative)Structure-Activity Relationships，(Q)SAR］评估以及遗传毒性试验等评估方法将杂质分类，参考国际相关分类方法，根据致突变和致癌风险危害程度可将杂质分为以下5类。1类杂质 指已知有致突变性的致癌物质。2类杂质 指致癌性未知的已知致突变性物质。3类杂质 指含有警示结构，与原料药结构无关，无致突变性数据的物质。4类杂质 指含有警示结构，与原料药或与原料药相关的物质具有相同的警示结构的物质，且原料药或与原料药相关的物质经测试为无致突变性的物质。5类杂质 指无警示结构，或有充分的数据证明警示结构无致突变性或致癌性的物质。1.数据库、文献检索评估方法已有资料显示杂质是有致突变性的致癌物质，则将其归为1类；已有资料显示杂质是有致突变性，即细菌回复突变试验呈阳性，或有其他与DNA反应性相关的基因突变的阳性致突变性数据(例如，体内基因突变研究显示阳性)，但无啮齿动物致癌性数据的物质，则将其归为2类；已有资料显示无致突变性或致癌性潜在风险的物质，则将其归为5类。2.(定量)构效关系[(Q)SAR]评估方法(Q)SAR评估方法是根据化合物现有资料、化学结构和对细菌回复突变试验的预测对化合物进行分类。根据现有资料可将化合物归为1类或2类；如果杂质含有与原料药结构无关的警示结构，但无致突变性数据，则可归为3类；如果杂质含有与原料药或与原料药相关的物质相同的警示结构(例如，工艺中间体)，且该原料药或与原料药相关的物质经测试为无致突变性，则可归为4类；如果杂质含有警示结构，但有充分的数据认为该警示结构无致突变性或致癌性，或者杂质不含有警示结构，则可归为5类。应用(Q)SAR方法进行计算机模拟，预测细菌回复突变试验的结果时，应采用两个互补的(Q)SAR预测方法。一个方法基于专家规则，另一个方法基于统计学。如果两个互补的(Q)SAR方法预测结果均没有警示结构，则可以认为该杂质没有致突变性，不建议做进一步的检测。此方法应釆用经验证并获得公认的软件，如有必要，预测结果可由专家评估。3.遗传毒性试验评估方法对于应用(Q)SAR方法评估归为3类的杂质，可以进一步开展细菌回复突变试验。如果试验结果为阳性，则该杂质归为2类；如果试验结果为阴性，则该杂质归为5类。对于长期给药时杂质日摄入量超出1mg时，按照本指导原则评价为阴性的杂质，仍应考虑对杂质进行潜在的遗传毒性评估。对于致突变性(如细菌回复突变试验)结果为阳性的杂质，如果无法控制在可接受的摄入量，可以根据其作用机制和预期的靶器官(组织)分布，选择合适的体内遗传毒性试验，以明确其体内致突变风险，指导对其设定特定的限度。附：遗传毒性杂质警示结构：汇智泰康分析平台依托配备齐全的分析检测技术平台，汇智泰康在药品含量分析、杂质分析和稳定性研究方面积累了非常丰富的药品标准建立和质量控制方面的经验。汇智泰康承诺为客户所执行的委托研究工作完全遵照国际协调组织(ICH)的指导要求、《中国药典》的标准要求和国内外医药监管机构的GLP/cGMP管理要求来执行。为客户提供药物研发分析检测的一站式服务。1.已知基因毒性杂质分析的LC-MS/MS，GC-MS/MS以及ICP-MS方法开发与验证；2.基于LC-TOF-MS检测技术对未知杂质进行结构分析判断和解析；3.应用(Q)SAR方法进行计算机模拟，对基因毒性进行预测；4.利用细菌回复突变试验（Ames试验）对基因毒性进行评估、根据《中国药典》的规则计算药物中基因毒性杂质的限度，进行杂质危害评估并提供科学的控制策略。LC-MS/MSGC-MS/MSICP-MS

Ⅱ相代谢稳定性研究原理及实验方法1 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。1.2 药物代谢药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应。肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的各种酶。UGT家族是人体内仅次于CYP450家族的第2大药物代谢酶。UGT介导的葡萄糖醛酸结合代谢不仅会显著影响药物的口服生物利用度和药物的体内药动学过程，同时还与一些临床药物-药物相互作用、药物-草药相互作用、药物-食物相互作用，以及高胆红素血症、癌症、自身免疫性肝炎等多种疾病的发生发展密切相关。UGT催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上。葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。1.3药物的Ⅱ相代谢药物的Ⅱ相代谢，又称结合反应，是药物在Ⅱ相代谢反应中与一些内源性的物质（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）结合或经甲基化、乙酰化排出体外。药物的结合反应，常常使其转化为无活性的代谢物，且极性增加，以便药物排出体外。药物的结合反应包括葡萄糖醛酸结合、硫酸化、乙酰化、甲基化、谷胱甘肽结合、氨基酸结合及缩合反应等。葡萄糖醛酸结合反应是体内生物转化最重要、最普遍的结合反应。葡萄糖醛酸基的直接供体是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）（见图1）。图1 葡萄糖醛酸结合反应    葡糖醛酸基转移酶（UGT）催化的葡萄糖醛酸化代谢反应是以尿苷5’-二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）为葡萄糖醛酸的供体，将一分子的葡萄糖醛酸转移到含有羟基、羧基、氨基、巯基以及酸性碳原子等基团的脂溶性小分子底物上，葡萄糖醛酸和小分子底物的结合使这些脂溶性小分子底物的水溶性得到改善，进而更容易被排出体外。例（图2）： 图2α-D-UDP-葡糖醛酸和异源物的结合反应例（图3）： 图3 苯甲酸的葡萄糖醛酸结合反应一般来说，药物先进行Ⅰ相反应进行转化，如果极性依然较弱，则会启动Ⅱ相反应，但有些药物可直接进行Ⅱ相反应。2 实验原理Ⅱ相代谢，又称结合反应，指Ⅰ相代谢产物或原型药物在酶的影响下与内源性小分子发生结合，使药物毒性、活性降低或极性增加而易于排出的反应。在药物的Ⅱ相代谢中，与葡萄糖醛酸的结合反应最为常见，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）进行反应，形成葡萄糖苷酸，使其水溶性增加，易于排出体外。因此，在体外，如若加入肝微粒体和UGT系统，便可重建Ⅱ相代谢体系，从而进行Ⅱ相代谢稳定性研究。3 肝微粒体体外温孵法实验方法描述    肝微粒体体外温孵法是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物剩余含量的方法。3.1 肝微粒体制备微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图4）：图4 肝微粒体制备流程图3.2 体外孵育体系的建立Ⅱ相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，由微粒体中的糖醛酸转移酶催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA），在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。推荐的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH发生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁），UGT孵育系统（5 mM UDPGA，5 mM D-葡萄糖二酸-1.4-内酯，50μg/mg蛋白的丙甲菌素），0.5 mg/mL的肝微粒体蛋白，合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，将待测物换为7-羟基香豆素，作为阳性对照， 阴性对照组分三组：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液。于预设的反应时间点，如0，5，10，15，30，60 min后加入等体积预冷的乙腈终止反应。3.3 原型药物检测采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物的剩余含量。4 智泰康医药Ⅱ相代谢稳定性试剂盒简介北京汇智泰康医药技术有限公司针对药物代谢研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，开发了一款专门用于Ⅱ相代谢稳定性研究的试剂盒，该产品可直接用于药物的Ⅱ相代谢稳定性研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合Ⅱ相代谢稳定性研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。4.1 产品说明本产品提供了药物Ⅱ相代谢研究用到的肝微粒体、NADPH再生系统、UGT孵育系统及其它组分，可直接用于药物Ⅱ相代谢稳定性的研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。4.2 试剂盒优势便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。4.3 产品组成    50反应/盒，200μL/反应。产品名称规格数量A液（20×）600μL /支1支B液（100×）120μL /支1支肝微粒体（20mg/mL）300μL/支1支UDPGA（50mM）1.1mL/支1支丙甲菌素（250μg/mL）1.1mL/支1支D-葡萄糖二酸-1.4-内酯（50mM）1.1mL/支1支阳性底物（200×）50μL /支1支0.1M PBS缓冲液10mL/瓶1瓶4.4 产品使用说明本产品需于-70℃冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：4.4.1 试验组1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；例：200μL孵育体系配制：名称加入量（μL）A液(20×)10B液(100×)2UDPGA（50 mM）20丙甲菌素（250μg/mL）20D-葡萄糖二酸-1.4-内酯（50 mM ）20肝微粒体（20mg/mL）5受试物（200×）10.1M PBS缓冲液122注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%。    b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。3）将以上混合液195μL/管分装至1.5mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入200μL预冷的乙腈终止反应（预冷乙腈：孵育体系体积=1:1）。4.4.2 对照组1）阳性对照组：将受试物换为阳性底物；2）阴性对照组分三组：a.只加UDPGA；b.只加A液、B液；c.不加UDPGA、A液、B液；3）空白对照：只包含底物和PBS缓冲液。4.4.3 运输条件    干冰运输。4.4.4 注意事项1）试验开始前，请自行准备1.5mL离心管、不同规格枪头、乙腈、37℃水浴锅等。2）本产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。3）使用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。4）于-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。5）在使用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。6）D-葡萄糖二酸-1.4-内酯为葡萄糖醛酸结合物的水解抑制剂，可根据实际需求选择是否加入。

体外染色体畸变试验方法及注意事项体外染色体畸变试验的目的是检测培养的哺乳动物细胞染色体结构畸变。结构畸变可份为染色体型和染色单体型。大多数化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突都也可发生。多倍体增加表明受试物可导致染色体数目畸变。但是，本方法不用于检测数目畸变。染色体突变和相关事件可以引起很多人类遗传性疾病，并且有证据表明，引起体胡魔癌基因和抑癌基因改变的染色体突变以及相关事件，与人类和实验动物的肿瘤发生有关。体外柴色体畸变试验可应用于已建立的细胞系、细胞株或原代细胞培养，根据培养生长能力、核型的稳定性、染色体数目、染色体差异以及染色体响变的自发频率选择合适的细胞。北京汇智泰康医药技术有限公司针对染色体畸变试验开发染色体畸变试验试剂盒， 本试剂盒省去了阳性底物成分准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合染色体畸变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。染色体畸变试验导则1  规范性引用文件OECD. OECD Guidelines for Testing of Chemicals. 473 In vitro Mammalian Test, 1-10. Paris: OECD, Adopted2lst July, 1997.2  定义2.1  染色单体型畸变(chromatid-type aberration )显示为单个染色单体断裂或染色体单体间断裂或断裂和重接的染色体结构损伤。2.2  染色体型畸变（chromosome-type aberration）显示为两个染色单体在同一部位断裂或染色体单体间断裂或断裂和重接的染色体结构损伤。2.3  内复制 （endore-duplication）在DNA复制的S期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体有4、8、16…倍的染色单体。2.4  裂隙（gap）染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的小错误排列。2.5  有丝分裂指数（mitotic index）    处于有丝分裂M期的细胞数占其总细胞数的百分数。细胞增殖程度的指标。2.6  数目畸变(numerical aberration)    染色体数目改变，不同于所用动物或细胞染色体的正常数目。3  原理体外染色体畸变试验的目的是检测培养的哺乳动物细胞染色体结构畸变。结构畸变可份为染色体型和染色单体型。大多数化学致突变物诱导染色单体型突变，但染色体型突都也可发生。多倍体增加表明受试物可导致染色体数目畸变。但是，本方法不用于检测数目畸变。染色体突变和相关事件可以引起很多人类遗传性疾病，并且有证据表明，引起体胡魔癌基因和抑癌基因改变的染色体突变以及相关事件，与人类和实验动物的肿瘤发生有关。体外柴色体畸变试验可应用于已建立的细胞系、细胞株或原代细胞培养，根据培养生长能力、核型的稳定性、染色体数目、染色体差异以及染色体响变的自发频率选择合适的细胞。4  仪器和设备   培养箱、恒温水浴、二氧化碳培养箱、压力蒸汽消毒器、、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、生物安全柜、离心机、无菌细胞培养瓶，玻璃器皿等。5  操作方法和程序5.1  准备5.1.1  细胞可利用包括人体细胞在内的多种细胞系、细胞株或原代细胞培养，如中国仓鼠成纤维细胞、人或其他哺乳动物的外周血淋巴细胞。5.1.2  培养基和培养条件应使用适当的培养基和培养条件(培养皿，CO2浓度，温度和湿度)维持培养。已确立的细胞系或细胞株应常规核实染色体众数和检测支原体污染，如有污染则不应使用。应了解正常的细胞周期时间和培养条件。5.1.3  培养物准备已建立的细胞系和细胞株:从贮备的培养物中增殖细胞，接种的密度应使细胞在收获时未达到融合，细胞培养于37C。淋巴细胞:从健康的个体采得经抗凝剂( 如肝素)处理的全血或分离的淋巴细胞，加至含促细胞分裂剂(植物凝集素等)的培养基中，并于37"C培养。5.1.4  代谢活化在有或无适当的代谢话化系统条件下，将细胞暴露于受试物。常用的代谢话化系统是以酶诱导剂如Aroclorl254或苯巴比安和β-茶黄酮联合处理啮齿类动物肝脏制备的去线粒体后组分(S9) 及辅因子系统。S9在培养液中终浓度范围为1%~10% (体积分数)。代谢活化系统的条件可能取决于受试物的类别。在某些情况下，需要使用不同浓度的S9。通过遗传工程建立的可表达特殊活化酶的细胞系，将使内源性活化成为可能。细胞系的选择要提供科学的依据(如通过细胞色素P450同工酶与受试物代谢的相关性进行判断)。5.2  试验条件5.2.1  溶剂/赋形剂所用溶剂/赋形剂不应与受试物发生化学反应，并且应对细胞存活率和s9活性无影响。如果采用不常用的溶剂/赋形剂，应有资料表明其对细胞存活率和S9活性无影响。推荐采用水作溶剂赋形剂，当受试物在水中不稳定时，则所用的有机溶剂应该是无水的。可使用分子筛去除水。5.2.2  染毒浓度在决定高浓度时应考虑受试物的细胞毒性、在试验系统中的溶解性以及pH或渗透压的改变。正式试验中应该在有和无代谢活化条件下，利用能反映细胞完整性和细胞生长情况的指标来检测细胞毒性和溶解性，如融合程度、活细胞计数或有丝分裂指数等。预试验有助于确定细胞毒性和溶解性。至少应设置3个剂量组，在有细胞毒性时，浓度范围应包括大细胞毒性至几乎无细胞毒性。组间距为(2~)倍。在收获时，高浓度组的细胞融合程度、细胞计数或有丝分裂指数均应该有显著降低(大于50%)。有丝分裂指数只是间接测定细胞毒性/细胞生长抑制作用的方法，而且依赖于细胞处理后的时间，但是，对于悬浮细胞培养物，其他的毒性测试方法可能比较繁琐且不实用，有丝分裂指数就比较适用。细胞周期动力学资料如平均传代时间(average generation time, AGT)可用于作为确定染毒浓度的补充资料。对于相对无细胞毒性的化学物，高浓度应该是5 uL/ml, 5 mg/ml或0.01 mol/L,取低的一种。无细胞毒性且相对不溶的受试物，所用的高剂量应保证在染毒期末的终培养液中有可见沉淀。在有些情况下(例如仅在略高于低溶解浓度时才出现细胞毒性)，可在多于一个肉眼可见沉淀的浓度进行试验。应在染毒开始和结束时评价溶解性，因为在试验系统中存在细胞、S9和血清等，溶解性可能在染毒过程中发生改变。不溶性之后肉眼可见的沉淀。沉淀不应不干扰计数结果。5.2.3  对照每个试验应包括在有和无代谢活化条件下同时进行的阳性和阴性(溶剂/赋形剂)对照。在利用代谢活化时，阳性对照应是需要代谢活化才显示致突变作用的化学物。阳性对照物(已知的断裂剂)在暴露水平应有超过本底值的可重复和测量的增加，以证实试验系统的敏感性。但阳性对照物的浓度不应使读片者立即发现其为阳性对照标标本片。阳性对照物如表1所示。表1  体外哺乳动物细胞染色体畸变试验代谢活化条件化学物[CAS号]不需要外源性代谢活化甲磺酸甲酯[66-27-3]甲磺酸乙酯[62-50-0]乙基亚硝基鸟[759-73-9]四裂霉素C [50-07-7]4-硝基喹啉~N-氧化物[56-57-5需要外源性代谢活化苯并[a]芘[50-32-8]环磷酰胺(单水合物) [59-18-0 (5519-22 ]也可利用其他适当的用性对服物。如有可能，应利用与受试物化学结构相关的阳性对照物。在每个收获时间都应包括相应的阴性对照。阴性对照在处理培养液中含溶剂/赋形剂，并以同样的方法处理培养物。而且，也应该有未染毒对照，除非本底对照资料证明，所选用的溶剂无细胞毒性或致突变作用。5.3  操作方法5.3.1  受试物处理在有和无代谢活化系统条件下，以受试物染毒处于增殖期的细胞。淋巴细胞应在有丝分裂刺激后的48 h开始染毒。一般对每个浓度和阴性/溶剂对照应该用双份平行培养物。当本底资料可以证明双份平行培养物之间变异较小时，对每个浓度改用1个培养物也可以接受。气态或挥发性物质应以适当的方法试验，如用密闭的培养瓶。5.3.2  收获时间在一次试验，细胞应在有和无代活化条件下染毒3~6h,并在染毒开始后约1.5倍的正常细胞周期时采样。如此方案在有或无代谢活化时均为阴性结果，应再进行一次无代谢活化的试验，适当延长染毒时间。某些化学物在染毒/采样时间长于1.5 倍正常细胞周期时更易检测。在有代谢活化条件下得到阴性结果，需要根据情况予以证实。如认为阴性结果不必进行证实，应提供适当理由。5.3.3  染色体制备在收获前以秋水仙素或秋水仙胺处理细胞培养物1~3h。各个细胞培养物分别收获和低渗、固定和染色，以制备染色体。5.3.4  染色体分析包括阳性和阴性对照的所有涂片，应在显微镜分析之前独立编号。由于固定过程通常会导致处于分裂中期细胞的同源染色体丢失，因此所计数细胞的着丝粒数应等于细胞染色体众数+2。每个浓度组和对照组至少计数200个分散良好的中期相细胞(如果可行，2个平行培养样分别计数100个细胞)。当观察的畸变数很高，计数的中期相数可以减少。虽然此试验的目的是检测染色体结构畸变，但应同时观察和记录多倍体和内复制。6  大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备6.1  诱导泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。本巴比钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。 S9制备动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化家溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化加溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化家溶液3mL。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2 mL ~3 mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。大鼠肝微粒体肝S9制备过程时间较久，也可以直接联系北京汇智泰康购买现有肝微粒体，肝S9，NADPH再生系统，UGT孵育系统等产品。高7  数据和报告7.1  数据处理试验单位是细胞，应评价有染色体结构畸变细胞百分率。对染毒组和对照组应列出染色体结构畸变的类型及其数目和频率。应分别记录裂除并报告，但一般不包括在总畸变率中。应记录同时进行的所有染毒组和阴性对照组细胞毒性结果。应提供各个培养物的资料，并且以表格形式总结所有的资料。对明确的阳性结果不要求证实。对可疑的结果应进一步试验， 改变试验条件。应对阴性结果进行证实，方法如5.3.2 所述。在进一步试验中应考虑改变试验参数，包括改变浓度间距和代谢活化条件。7.2  结果、评价和解释判断阳性结果的标准为染色体畸变细胞数有浓度相关性增加和/或在一个或多个浓度有可重复的增加。应首先考虑结果的生物学意义。利用统计学方法分析，以有助于评价试验结果。但是，统计学显著性不应是确定阳性反应的-因素。多倍体的细胞数增加可表明受试物能抑制有丝分裂过程和导致染色体数目畸变，内复制的细胞数增加可表明受试物抑制细胞周期进展。结果不符合上述标准的受试物，可认为在本系统为阴性结果。虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，但在极少情况下，所得到的资料不能对受试物的致突变性进行明确的判断。经多次重复试验，结果仍然是可疑的。体外染色体略变试验的阳性结果表明受试物能对培养的哺乳动物体细胞诱导染色体畸变。阴性结果表明在试验条件下受试物对培养的哺乳动物体细胞不能诱发染色体畸变。晴变。试验的解释和评价8.1  体外试验一般需要外源性代谢活化系统的支持。此代谢活化系统不可能完全模拟哺乳动物体内条件。应注意避免假阳性结果的发生，这些假阳性结果可能由于pH、培养基渗透压的改变或高度细胞毒性所致。8.2  本试验用于筛选可能的哺乳动物致突变物和致癌物。本试验结果为阳性的很多化学物是哺乳动物致癌物；但本试验和致癌性之间并无很好的相关性。相关性取决于化学物类别，已有证据表明此试验未检出的致癌物并不是通过直接损伤DNA的机制起作用的。体外染色体畸变试验试剂盒优势便捷—— 本试剂盒省去了诱导 S9 制备，阳性底物、秋水仙素的配制和浓度条件摸索的时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。 准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合体外哺乳动物细胞染色体畸变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。试剂盒使用操作流程1. 实验器材、试剂准备：1640RPMI培养基、牛血清、青链霉素双抗、胰蛋白酶消化液、75，25cm2细胞培养瓶、,50mL 或 15mL 试管、200μl 和1000μl 枪头、0.22μm 滤膜、注射器、平皿、二甲基亚砜、灭菌 蒸馏水等；2. 设置待测物剂量，配制各剂量无菌待测物溶液；3. 将处于对数生长期，贴壁生长良好的CHL细胞用0.25 %胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5 mL/瓶接种于25cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中加湿培养约24 h-48h；4. 吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、0.05mL S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液补足至5mL，于培养箱中处理6h，换成含有10%牛血清的完全培养基。在收获细胞前4 h加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素溶液（终浓度为0.2 mg/mL）；5. 用0.25%的胰蛋白酶溶液消化细胞，加入0.075mol/L氯化加溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，记录畸变细胞的坐标位置及畸变类型，具体操作方法参照国标方法进行；6. 阅片。试验设计及受试物的特殊处理1) 剂量设计 决定受试物高剂量的原则是受试物对试验细胞的毒性和受试物的溶解度。对于纯的化学物质，一般高剂量为 5 mg，或溶解度允许，或饱和浓度，或对细胞产生小毒性浓度。对于毒性很低、摄入量很大的定型产品，可根据其溶解度和对细菌的毒性采用可能的大剂量，至少3个剂量组，每个剂量应做2个平皿。2) 溶剂 溶剂可选用水、二甲基亚砜或其他溶剂（溶剂剂量应限定在毒性剂量以下。以二甲基亚砜为例，一般不超过1%）， 无论选用什么溶剂均应无诱变性。3) 对照组的设置 试验应同时设有阳性物对照组、溶剂对照组和未处理对照，均包括加S9和不加S9两种情况。4) 受试物的特殊处理 若遇特殊受试物作非常规处理时应在报告中说明。对以下几种情况可作如下处理：a)  食品包装材料及其制品成分：根据材料或制品的组成成分，可分别采取过筛抽提、蒸发残渣等技术处理。b)  挥发性受试物：可采用真空干燥器处理等方法。c)  天然植物材料：可按植物化学方法制备粗制品或纯制品。常见问题及原因分析1、收获细胞较少：贴壁细胞生长到70-80%左右时开始染毒，人或哺乳动物外周血淋巴细胞；2、自发回变数显著高于标准 原因：a. 培养基配制操作过程中组氨酸、生物素添加量高；b.培养皿经环氧乙烷消毒不彻底或环氧乙烷有残留；3、阳性底物诱变菌落数偏离标准范围 原因：a. 阳性底物溶解不彻底或未充分混匀；b. 阳性底物添加量不准确；c. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9失活；d. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；4、待测物诱变菌落数非常低或没有菌落 原因：a. 待测物或待测物溶剂对细菌生长有毒性；b. 试剂盒保存条件不合适或过期，阳性底物降解或 S9 失活； c. 操作过程中添加菌液时顶层培养基温度过高；5、菌落分布不均匀，集中偏向一侧。原因： 倒底层或顶层培养基时平皿未水平放置；6、顶层或底层培养基凝固不充分或滑出平皿 原因：a. 顶层或底层培养基中琼脂粉含量低；b. 顶层培养基中加入的溶剂或待测物酸化，导致凝胶不充分；7、如何判断 Ames 实验结果是否为假阳性 将经受试物和阳性对照物处理的 Ames 菌落进行增菌培养后接种于无组氨酸的培养基上,观察比较细菌的生长情况。如果经受试 物处理的菌株不能生长在无组氨酸的培养基中,而经阳性对照物处 理的菌株则可以生长在无组氨酸的培养基上,则说明经受试物处理 的菌株没有发生突变，试验中所观察到的菌落数增加是假阳性。

体外哺乳类细胞微核试验原理及注意事项微核试验是遗传毒性研究标准组合试验之一，在食品，化学品，药品，农药，饮用水等多类产品的遗传毒性评价方面得到广泛应用。与体内实验相比，体外微核试验更加简单快速，避免动物个体差异影响，灵敏度高。体外微核试验主要包括体外哺乳类细胞微核试验，人外周血淋巴细胞微核试验，肝原代细胞微核试验等类别。体外哺乳类细胞微核试验是一种用于检测哺乳类细胞在受试物处理后是否产生微核的遗传毒性检测方法。该试验适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和诱发非整倍体的能力。如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不确定时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验，相当于用受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期。参考导则：GB 15193.28-2020 食品安全-国家标准 体外哺乳类细胞微核试验一、仪器、试剂仪器细胞培养箱、倒置显微镜、正置显微镜、超净台、离心机。代谢活化系统1.1 S9辅助因子的配制1）  镁钾溶液氯化镁1.9 g和氯化-钾6.15 g加蒸馏水溶解至100 ml。2）  0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)磷酸氢二钠(Na2HPO4，28.4 g/L)440 mL,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O,27.6 g/L)60 mL，调pH 至7.4，0.103 MPa 20 min灭菌或滤菌。3）  辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，现用现配。4）  葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液称取葡萄糖-6磷酸钠盐,用蒸馏水溶解配制成0.05 mol/L 溶液，过滤灭菌。现用现配。1.2 大鼠肝S9组分的诱导和配制选健康雄性成年SD或Wistar大鼠，体重150g~200g，约5周龄~6周龄。将多氯-联-苯(Aroclor 1254)溶于玉米油中，浓度为200 g/L，按500 mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射，5 d后处死动物，处死前禁食12 h。也可采用苯巴比-妥-钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比-妥-钠和β-萘黄酮，剂量均为80 mg/kg体重，连续3d，禁食16 h后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。S9组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超过40 mg为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-80°C低温或冰冻干燥，保存期不超过1年。1.3  S9混合液的制备S9混合液浓度一般为1%~10%，实际使用浓度可由各实验室决定，但需对其活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。一般由S9组分和辅助因子按1:9组成10%的S9混合液，无菌现用现配。10%S9混合液10mL配制方法如下:取上述磷酸盐缓冲液6.0 mL、镁钾溶液0.4 mL、葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.0 mL、辅酶 II溶液1.6 mL、肝S9组分1.0 mL，混匀，置冰浴中待用。1.4  肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B(CytochalasinB，cytoB)溶液用二甲基亚砜( DMSO)配制适当浓度的储备液，避光冷藏保存。cytoB的终浓度通常为3μg/ mL ~6μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率。1.5  0.075 mol/L氯化-钾溶液5.59 g氯化-钾加蒸馏水至1000 ml。1.6  固定液甲醇:冰醋酸为3:1，临用前配制。1.7  姬姆萨(Giemsa)染液取姬姆萨染料3.8 g ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375 mL，待完全溶解后，再加 125 mL甘油，放入37° C温箱中保温48 h。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，2周后使用，作为姬姆萨染液原液。使用时,取1份姬姆萨染液原液，与9份1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.8)混合,配成其应用液.现配现用。磷酸盐缓冲液(1/15 mol/L，pH 6.8)配制方法如下：1）一液：取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47 g溶于1000 mL去离子水中，配成1/15 mol/L溶液；2） 二液：取磷酸二氢钾(KH2 PO4 )9.07 g溶于1 000 mL去离子水中，配成1/15 mol/L溶液；3） 取一液50 mL加于二液50 ml中混匀，即为pH 6.8的1/15 mol/L磷酸盐缓冲液。二、 试验方法2.1受试物固体受试物应溶解于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度使用。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。2.2 细胞可选用中国仓鼠肺细胞株(V79、CHL)或卵巢细胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤细胞株(L5178Y)、人外周血淋巴细胞株(如TK6)和原代培养细胞。推荐使用CHL或L5178Y细胞株。细胞在使用前应进行染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查。汇智泰康体外微核试验试剂盒推荐使用中国仓鼠肺细胞株（CHL）。2.3试验方案选择试验分为使用和不使用cytoB两种方案。方案一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB，然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞(双核细胞)微核率。当选用人类淋巴细胞时,建议采用方案一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是所有的细胞都对植物血球凝集素(PHA)有反应。方案二：不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率。如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长(如小鼠淋巴瘤细胞株)，建议采用方案二。2.4 剂量1） 剂量设置至少应设置3个检测剂量。受试物没有细胞毒性时，从高剂量往下设至少2个剂量，一般情况下间隔系数可为2~3；有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从55%士5%的细胞毒性到几乎无细胞毒性。2） 高剂量的选择决定高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH、渗透压。受试物有细胞毒性时，高剂量应能引起55%士5%的细胞毒性；如果没有细胞毒性或沉淀，高剂量应是5 μL/mL、5 mg/ml或10 mmol/L。对溶解度较低的物质.当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则高剂量应是在最终培养液中溶解度限值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不能影响观察。3） 细胞毒性的确定，在S9存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性。方案一，使用cytoB，细胞毒性的确定可依据复制指数(ReplicationIndex,RI)或胞质分裂阻断增殖指数( Cytokinesis Block Proliferation Index,CBPD)。4） 阳性对照阳性对照物包括染色体断裂剂和非整倍体剂。加S9时，断裂剂可以选用环磷酰胺和苯并(a)芘；不加S9时，断裂剂可以选用阿糖胞苷、si裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍体剂只用于不加S9时，可以选用秋水仙素和长春新碱。如果短期处理试验方案在S9存在和不存在两种条件下都选用断裂剂作为阳性对照，那么长期处理试验方案应该选用非整倍体剂作为阳性对照。如果选用的细胞本身具有代谢能力，则不需要另外添加S9，阳性对照应该同时使用断裂剂和非整倍体剂。5） 阴性对照溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响组胞存活和S9活性。优先选溶媒是培养液(不含血清)或水。使用水作为溶媒时其体积不应大于总体积的10%。DMSO也是常用溶媒，但终浓度不应大于1%。6） 空白对照如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照2.5试验步骤1） 细胞准备将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中，以收获细胞时，培养皿(瓶)的细胞未长满为标准，贴壁细胞一般以长到85%左右为佳。2） 受试物处理应用方案一，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗细胞，加入无血清培养液及一定浓度的受试物(需代谢活化者同时加人S9 mix)，置于培养箱中3h~6h；结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞，加人含10%血清的新鲜培养液和cytoB，继续培养1.5个~2.0个正常细胞周期后收集细胞。对于淋巴细胞，有效的方法是在有丝分裂原(如PHA)刺激后44h~48h开始受试物处理，这时细胞开始进入分裂周期。如果3h~6h短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无S9的长期处理试验，用cytoB和受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期，在处理结束后收集细胞。如果已知或怀疑受试物(如核苷类物质)可能影响细胞周期(特别是P53活性细胞)，则细胞收获时间应该再延长1.5 个~2.0个正常细胞周期。应用方案二，与应用方案一处理方法相同，只是不加cytoB。3） 收获细胞与制片每次培养都应单独收获细胞和制片，如果细胞混合液的分散度良好则不需要进行低渗处理。a、消化贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待细胞脱落后，加入含10%胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋白酶的作用，混匀，放人离心管以800r/min~1 000r/min的速度离心5 min，弃去上清液。悬浮细胞不需要消化，直接离心。.b、低渗加入0.075 mol/L氯化-钾溶液2 mL，用滴管将细胞轻轻地混匀，放人37°C细胞培养箱中低渗处理 1 min~5 min.固定加入2 mL固定液，混匀后固定5 min以上，以800 r/min~1 000 r/min的速度离心5 min，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。c、滴片加人数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。d、染色推荐用姬姆萨染色(5% ~10%姬姆萨染液，15 min~ 20 min),，也可用DNA特异性荧光染料(如: 吖啶橙或Hoechst  33258)。如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交(FISH)或引物原位标记等方法。4） 阅片a、微核的判断标准：微核一般为圆形或椭圆形，直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。b、应用方案一，每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率(一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作一个含微核细胞)。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。对不规则的双核细胞(如两个核大小相差悬殊)和多于两个核的细胞不进行分析。c、应用方案二，每个剂量组至少分析2 000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养。三、数据处理和结果判定3.1 数据处理数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量组与空白对照组、阴性对照组(溶媒对照组)、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法(如X2检验)进行处理。3.2结果判定下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果；a)受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关;b) 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。四、试验解释阳性结果表明受试物在该试验条件下可引起所用哺乳类细胞染色体损伤，微核细胞率增加。阴性结果表明在该试验条件下受试物不引起所用哺乳类细胞染色体损伤。评价时应综合考虑生物学和统计学意义。体外微核试验试剂盒北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞微核试验开发体外微核试验试剂盒，本试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞微核试验所需的主要试剂和细胞，快速检测受试物是否有导致染色体断裂和诱发非整倍体的情况，从而评价受试物的遗传毒性，试剂盒的使用可以大大节约实验人员的准备时间。【产品组成】5mL×32体系/盒。组分规格数量使用说明保存条件中国仓鼠肺细胞（CHL）1 mL1贴壁生长-70℃S9混合物1.2mL1冰浴融化S9 PS 反应液10mL1使用前混匀S9 CS 反应液0.5mL1使用前混匀环磷酰胺（CP）（CAS：6055-19-2）0.2 mL1使用前混匀si裂霉素C（MMC）（CAS：50-07-7）0.1mL1使用前加入300 μL灭菌蒸馏水混匀秋水仙素0.2 mL1使用前混匀细胞松弛素B（cytoB）540 μL1使用前用无菌的1260 μL PBS稀释，混匀【产品使用说明】1、细胞复苏收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。从-70冰箱取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%牛血清RPMI 1640培养液（RPMI-10）中重悬细胞后，再次离心；弃上清，用RPMI-10重悬后接种于细胞培养瓶，于37℃二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。2、细胞准备将处于对数生长期，贴壁生长良好的细胞用胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化处理制成细胞悬液，5mL/瓶接种于25cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中加湿培养约24 h-48h。3、染毒处理吸去培养瓶中培养液，加入一定浓度的受试物、S9混合液（不加S9混合液时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，于培养箱中处理3h。弃去处理液，使用PBS洗涤细胞2~3次，换液后，按1%的比列加入细胞松弛素B（如4.95mL RPMI-10+0.05mL cytoB）。具体试验方案见下表1）10%S9混合液配制10%S9混合液配制（11mL）S9混合物1.2mL现配现用。使用过程中，于冰浴条件下保存。试验结束后，剩余溶液应丢弃，不可重复使用。S9 PS反应液0.4mLS9 CS反应液补足至10mL2）推荐染毒培养体系配制方案处理方式组别培养液体积（mL）S9混合液体积（mL）受试物体积（mL）溶剂体积（mL）阳性对照体积（mL）CPMMC秋水仙素活化3h阳性对照4.450.5//0.05//剂量14.450.50.05////剂量24.450.50.05////剂量34.450.50.05////溶剂对照4.450.5/0.05///不活化3h阳性对照14.95////0.05/阳性对照24.95/////0.05剂量14.95/0.05////剂量24.95/0.05////剂量34.95/0.05////溶剂对照4.95//0.05///3）推荐染毒培养体系配制方案处理方式组别培养液体积（mL）CytoB（mL）受试物体积（mL）溶剂体积（mL）阳性对照体积（mL）CPMMC秋水仙素不活化24h阳性对照4.900.05///0.05/剂量14.900.050.05////剂量24.900.050.05////剂量34.900.050.05////溶剂对照4.900.05/0.05///注：24h染毒的阳性底物需将si裂霉素C稀释5倍后再使用。由于CytoB使用DMSO溶解的，按照食品标准，阴性对照的有机溶剂含量不得超过1%，若受试物需用有机溶剂溶解，样品制剂的有机溶剂含量不得超过70%。4、收获细胞及制片用胰蛋白酶溶液消化细胞，加入0.075mol/L氯化-钾溶液进行低渗处理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，可适当调整冰醋酸浓度，但不宜过大）进行固定并滴片，用吉姆萨染液染色，中性树胶封片，并于油镜下进行阅片，每处理组计数500个细胞中的增值指数CBPI和细胞复制指数RI，计算出细胞毒性；每一剂量组应分析不少于2000个核型相差不大的双核细胞，计算微核率。5、数据分析计算 6、结果判定下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并与剂量相关；受试物在任何一个剂量条件下，引起的染色体结构畸变数增加具有统计学意义，并有可重复性。细胞毒性=1-RI【注意事项】实验前请自行准备RPMI 1640培养液、牛血清、细胞培养瓶、0.075mol/L氯化-钾溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆萨染液、胰蛋白酶、24孔细胞培养板、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、15、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。汇智泰康是一家位于中美两地的生物医药合同研发机构，整合中美两地的药物研发技术服务平台，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025实验室认证，面向企业及研发机构提供分析化学、DMPK、药理药效、生物学、以及毒理安全性评价产品与服务。

体内碱性彗星试验在化合物遗传毒性评价中的应用日益广泛。ICH S2(R1)已将肝脏彗星试验列为第2个组织/终点的体内试验；体内哺乳动物碱性彗星试验的指导原则（TG489）也已颁布。体内碱性彗星实验能够检测DNA链断裂、碱性不稳定位点、不完整切除修复引起的DNA链的断裂，能够制成合适细胞悬液的组织DNA损伤。与其他试验相比其检测的是单细胞水平的DNA损伤，因此该试验敏感性较高，操作简单，经济省时。实验原理彗星实验（comet assay）也称单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一种有效评估DNA损伤的方法。其原理是器官或组织经处理（如辐射、重金属等）后，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经细胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA 断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱。正常细胞的大分子DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱。根据电泳缓冲液的pH值不同，可分为中性彗星实验（pH=8.4）和碱性彗星实验（pH＞13）。中性彗星实验主要用于检测DNA双链的断裂损伤，碱性彗星实验具有更高的灵敏性，可用于检测更少量的单链和双链断裂损伤。需要注意的是，试验过程中的个方面，包括样品准备、电泳条件、视觉分析参数(如染色强度、显微镜光强度以及使用显微镜滤镜和相机动态和环境条件(如背景照明)已经被研究，可能影响DNA迁移。碱性彗星实验指导原则TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals试验能力验证每个实验室都应证明能够为所使用的目标组织获得足够质量的单细胞或细胞悬浮液，从而在彗星试验（comet assay）中建立实验能力。汇智泰康拥有多年毒理学服务与产品研发经验，针对不同遗传毒性试验开发针对试剂盒，包括彗星试验试剂盒。首先通过%尾DNA的评价，对照处理组动物%尾DNA在低范围内。目前的数据表明,尾部DNA百分比(基于平均中位数)在大鼠肝脏应该最好不要超过6%,这将是符合JaCVAM验证试验的值和其他出版和私有数据。目前还没有足够的数据对其他组织的最佳或可接受范围提出建议。这并不排除合理使用其他组织。测试报告应根据已发表的文献或专有数据，对彗星试验在这些组织中的性能进行适当的审查。首先，在对照组中，需要一个较低的%尾DNA范围，以提供足够的动态范围来检测阳性的影响。其次，每个实验室都应能够按照表1所建议的不同方式，对直接诱变剂和促进剂的反应。阳性对照物    靶组织Ethyl methanesulfonate    任何组织  Methyl methanesulfonate    肝脏、胃、十二指肠或空肠，肺和支气管肺泡灌洗(BAL)细胞，肾脏，膀胱，肺，睾丸和骨骼骨髓/Ethyl nitrosourea    肝胃，十二指肠或空肠N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine   胃、十二指肠或空肠1,2-Dimethylhydrazine 2HCl   肝脏和肠N-methyl-N-nitrosourea   肝脏，骨髓，血液，肾脏，胃、空肠和大脑。表一：阳性对照物质及其部分靶组织应收集阴性对照数据，以证明阴性数据反应的再现性，并确保对检测的技术方面进行适当控制，或建议需要重新建立历史控制范围。历史对照在实验室能力验证过程中，实验室应建立历史数据库，建立相关组织和物种的阳性和阴性对照范围和分布。不同的组织和不同的物种，以及不同的给药溶媒和给药途径，可能会产生不同的%尾DNA阴性对照值。因此，建立每个组织和物种的阴性对照范围是很重要的。实验室应采用质量控制方法，以确定其数据的变化程度，并表明该方法在其实验室中得到了“控制”。可能还需要优化选择适当的阳性对照物质、剂量范围和实验条件(例如电泳条件)，以便发现微弱的影响。对实验方案的任何更改都应根据其与实验室现有历史控制数据库的一致性加以考虑。任何重大的不一致都应导致建立新的历史控制数据库。方法描述动物选择：通常使用健康成年啮齿动物(6-10周龄，但年龄稍大的动物也可接受)。然而，如果合乎伦理和科学，其他物种也可以被利用。动物准备：动物随机分为对照组和实验组。在开始实验前，这些动物适应实验室条件至少5天，给予标识识别。试验开始时,动物的重量差异应该不超过±20%。样品制备：在给动物给药前，固体测试化学品应溶解或悬浮在适当的溶媒中，或混合在饮食或饮用水中。液体试验化学品可直接加药或在加药前稀释。对于吸入暴露，根据其物理化学性质，试验化学品可以作为气体、蒸汽或固体/液体气溶胶使用。溶媒：在使用的剂量范围内，溶媒不应产生毒性作用，也不应与试验物质发生化学反应。如果使用的不是常用溶媒应提供参考数据，说明它们在测试动物、管理路线和终点方面的兼容性。建议在可能的情况下，应首先考虑使用水性溶剂/溶媒。值得注意的是，一些溶剂可诱导炎症反应，增加接触部位DNA链断裂的背景水平，尤其是与多药给药时。阴性对照：阴性对照动物，单独用溶媒处理，其他处理方法与治疗组相同，每一次采样时间和组织的每次检测均纳入一组阴性对照动物。阴性对照动物的尾部DNA应在每个组织预先设定的实验室背景范围和该物种的取样时间内。动物数量和性别：目标是每组提供至少5只可分析的单性别动物，或如果使用两种动物，则每组至少提供5只可分析的单性别动物。如果人类接触到的化学物质可能具有性别特异性，例如某些药物，则应在适当的性别下进行检测。三个剂量组和同时进行的阴性和阳性对照(每一组由5只单性别动物组成)，将需要25至35只动物。试验计划：动物应接受为期2天或以上的每日给药(即每隔约24小时进行两次或两次以上)，并在最后一次治疗后的2-6小时采集一次样本。延长剂量方案(如28天每日给药)的样本是可以接受的。测试化学品也可以分次使用，即，两组给药在同一天间隔不超过2-3小时，便于给药量大。在这种情况下，取样时间应根据最后一次给药的时间来安排。剂量水平：对无毒试验化学品，给药14天以上的，最大(限)剂量为1000mg /kg体重/天。给药时间少于14天，最高剂量为2000毫克/公斤体重/天。对于特定法规所涵盖的特定类型的测试化学品(如人类药物)，这些限制可能有所不同。在长期给药后表现出毒物动力学性质饱和或诱导排毒过程而可能导致接触减少的物质，可能是剂量设定标准的例外，应逐个进行评估。急性和亚急性的彗星试验,除了最大剂量(MTD,最大可行的剂量,最大接触或限制剂量)递减序列至少两个额外的适当间隔的剂量水平(最好相隔不到√10)应该选择为每个采样时间证明剂量相关的反应。但是，所使用的剂量水平也最好包括从最大限度到产生很少或没有毒性的剂量范围。当检测到所有剂量水平的靶组织毒性时，建议进一步进行无毒剂量的研究。为了更全面地调查剂量-反应曲线的形状，可能需要进行研究。在设计试验时，应考虑人体接触的预期途径。因此，暴露途径，如饮食、饮水、局部、皮下、静脉、口服(灌胃)、吸入、气管内或植入术可能是合理的。无论如何，应选择适当的路径以确保目标组织得到充分暴露。腹腔注射通常不推荐使用，因为它不是典型的人体接触的相关途径，只能在有特定理由的情况下使用(例如，一些阳性对照物质，用于调查目的，或用于腹腔注射途径所使用的某些药物)。一次灌胃或注射液体的最大容量取决于试验动物的大小。体积不应超过1毫升/100克体重，但可使用2毫升/100克体重的水溶液除外。如果动物福利立法允许，使用比这更多的量是合理的。在可能的情况下，应通过调整剂量配方的浓度来达到不同的剂量水平，以确保在所有剂量水平上的体积相对于体重是恒定的。采样时间：采样时间是一个关键变量，因为它是由测试化学物质在目标组织中达到最大浓度所需的时间和DNA链断裂的诱导时间决定的，但在这些断裂被移除、修复或导致细胞死亡之前。彗星实验（comet assay）检测到的一些导致DNA链断裂的损伤持续时间可能很短，至少对于一些体外测试的物质来说是这样。因此，如果怀疑这种短暂的DNA损伤，应采取措施减轻其损失，确保组织得到足够早的采样，可能早于下面给出的默认时间。最佳采样时间可能是特定于物质或路径的采样时间，例如，静脉给药或吸入给药导致组织快速暴露。因此，在可能的情况下，应根据动力学数据(如血浆或组织浓度达到峰值的时间(Tmax)或多次给药的稳态时间(Cmax)确定采样时间。在缺乏动能的测量数据合适的妥协基因毒性是样品2-6 h后给药两次或两次以上,或2-6和第16 - 26 h后。关于目标器官中毒性作用外观的信息也可用于选择适当的取样时间。组织收集：因为它可以研究诱导的DNA链断裂(彗星)在任何组织中,组织选择应清晰、基于收集的原因进行研究与任何现有的基因毒性、致癌性或其他测试物质的毒性数据在调查之中。应考虑的重要因素应包括给药途径、预测的组织分布和吸收、代谢的作用以及试验物质可能的作用机制。肝脏是研究最频繁、数据最丰富的组织。因此，在缺乏任何背景信息的情况下，如果没有确定感兴趣的特定组织，那么对肝脏进行取样是合理的，因为肝脏是异种生物代谢的主要场所，而且常常高度暴露于母体物质和代谢物中。在某些情况下，直接接触部位的检查(例如，口服药物，胃腺或十二指肠/空肠，或吸入药物，肺)可能是最相关的。应根据进行测试的具体原因选择其他或替代组织，但如果实验室已证明对这些组织的熟练程度和同时处理多个组织的能力，对同一动物的多个组织进行检查可能是有用的。样本制备：在最后一次用测试化学品后的适当时间，对动物实施安乐死。收集选定的组织,而同时采集同一组织的一部分,放置在甲醛溶液或适当的固定剂可能组织病理学分析。彗星实验的组织被放置在切碎缓冲液中，用冷切碎缓冲液充分冲洗以去除残留的血液，并储存在冰冷的切碎缓冲液中，直到处理完毕。原位灌注也可进行，如肝、肾灌注。玻片准备：单细胞悬液制备后，应尽快(最好在1小时内)制备载玻片，但动物死亡与载玻片制备之间的温度和时间应严格控制，并在实验室条件下进行验证。向低熔点琼脂糖(通常0.5-1.0%)中加入细胞悬浮液的体积，使玻片的低熔点琼脂糖百分比不应降低到0.45%以下。最佳的细胞密度将由用来给彗星评分的图像分析系统决定。细胞裂解：裂解条件也是一个关键变量，可能会干扰特定类型的DNA修饰(某些DNA烷基化和碱基内收)导致的链断裂。因此，我们建议在实验中对所有玻片的裂解条件尽可能保持恒定。准备好后，应在约2-8摄氏度的弱光条件下(如黄光(或防光)，将载玻片浸入冷冻溶解液中至少1小时(或过夜)，以避免暴露在可能含有紫外线成分的白光下。在此潜伏期之后，在碱液展开步骤之前，应冲洗载玻片以除去残留的洗涤剂和盐。这可以用纯净水、中和缓冲液或磷酸盐缓冲液来完成。也可以使用电泳缓冲液。这将维持电泳室的碱性条件。解旋和电泳：将载玻片随机放置在含有足够电泳溶液的潜电泳装置的平台上，使载玻片表面完全覆盖(每次覆盖的深度也应一致)。在其他类型的彗星试验电泳装置，即主动冷却，循环和高容量电源，较高的解决方案覆盖将导致更高的电流，而电压保持不变。在电泳槽内放置载玻片应采用平衡设计，以减轻槽内任何趋势或边缘效应的影响，并尽量减少批与批之间的差异，即，在每次电泳中，研究中每个动物的载玻片数量应相同，并应包括来自不同剂量组(阴性和阳性对照)的样本。应该留给DNA解旋至少20分钟,然后进行电泳受控条件下,测定的灵敏度和动态范围最大化(即导致尾部DNA百分比的可接受水平的正面和负面的控制灵敏度最大化)。DNA迁移水平与电泳时间线性相关，也与电位(V/cm)线性相关。根据JaCVAM试验，这可能是0.7 V/cm，持续至少20分钟。电泳时间被认为是一个关键的变量，需要设置电泳时间来优化动态范围。较长的电泳时间(如30或40分钟，以提高灵敏度)通常会导致较强的阳性反应已知的诱变。然而，较长的电泳时间也可能导致过度迁移的控制样本。在每个实验中，电压应保持恒定，其他参数的变异性应在一个较窄的指定范围内。调节缓冲深度，达到要求，并在整个实验过程中保持。应记录电泳开始和结束时的电流。因此，最佳条件应在实验室中与所研究的每个组织有关的熟练程度的初步演示期间确定。通过展开和电泳的电泳溶液的温度应保持在低温下，通常为2-10oC(10)。电泳完成后，将载玻片在中和缓冲液中浸泡/冲洗至少5分钟。凝胶可以被染色并标记为“新鲜”(例如在1-2天内)，也可以被脱水以便以后的标记(例如在染色后1-2周内)。但是，这些条件应该在熟练程度的展示过程中得到验证，并且应该为每个条件分别获得和保留历史数据。如果是后者，则应将玻片浸入无水乙醇中脱水至少5分钟，风干，然后储存在室温或冰箱容器中。测量方法：彗星应该使用自动化或半自动化的图像分析系统进行定量评分。用合适的荧光染色剂对载玻片进行染色，并在配备有超荧光和适当检测器的显微镜或数码相机上进行适当放大(如200x)的测量。根据彗星图像图谱的描述，细胞可以分为三种类型，即可分析、不可分析和“刺猬。只有可分析的细胞(明确定义的头部和尾部，不干扰相邻的细胞)应该为%的尾部DNA，以避免人为干扰。刺猬的频率应该根据每个样本至少150个细胞的视觉评分(因为缺少一个清晰定义的头部意味着它们不容易被图像分析检测到)来确定，并单独记录下来。所有用于分析的玻片，包括阳性和阴性对照的玻片，都应独立编码并进行“盲法”评分，以便评分者不知道情况。对于每个样本(每个动物的每个组织)，至少应该分析150个细胞(刺猬除外)。分析150细胞/动物至少5动物每剂，提供足够的统计能力。彗星DNA链断裂可以通过尾DNA %、尾长和尾力矩等独立端点来测量。如果使用适当的图像软件分析仪系统，就可以进行这三种测量。然而，推荐将%尾DNA(也称为%尾强度)用于结果的评估和解释，并由以细胞总强度百分比表示的尾DNA片段强度决定。数据处理和结果判断在实验条件下，阳性对照组的尾DNA%的与阴性对照相比具有统计学意义上的增加（p在试验系统判定有效的前提下，同时满足以下三个条件，则判定受试样品为阳性结果：（1） 尾DNA%的在某个单独剂量组显著升高；（2） 尾DNA%随试验样品浓度升高有显著增加趋势；（3） 受试物组的尾DNA%全部超过阴性背景数据范围。在判定阳性结果时，如仅符合上述标准中的一个或两个，除统计学意义外，还应考虑其生物学意义。如全部不符合上述3个，则判定为阴性结果。试验报告试验报告应包括以下内容：（1）受试物来源如批号；（2）测试化学品的稳定性、使用限制日期或已知的重新分析日期;（3）化学识别，如IUPAC或CAS名称、CAS编号、SMILES或InChI代码、结构公式、纯度、杂质的化学识别(视情况和实际可行)等。（4）多组分物质，UVBCs和混合物, 尽可能用化学特性(见上文)、定量发生和表征化学成分的相关理化性质。（5）溶剂选择的理由，已知测试化学品在溶剂/溶媒中的溶解性和稳定性;剂量制剂的制备;对配方(例如稳定性、均匀性、名义浓度)的分析测定;（6）实验动物：所使用的品种，以及作出选择的科学和伦理理由;动物的数目、年龄和性别;来源、居住条件、饮食、营养等;试验开始和结束时动物的体重，包括每组动物体重的范围、平均值和标准差;（7）测试条件：阳性和阴性控制数据;测距研究的结果(如进行);剂量水平选择的理由;测试化学制剂的详细资料;测试化学品的管理详情;行政路线的基本原理;注射部位(用于皮下或静脉注射研究);样品制备方法，如有，组织病理学分析，特别是对彗星反应阳性的物质;（8组织选择的基本原理;如果检测结果为阴性，则验证该测试化学品是否达到目标组织或一般循环的方法;根据膳食/饮用水试验化学浓度(ppm)和消耗量(如适用)计算的实际剂量(mg/kg体重/日);饮食及水质详情;详细说明实验方案和取样计划以及选择的理由(如有毒物动力学数据);-止痛、镇痛方法;-安乐死的方法;分离和保存组织的程序;制备单细胞悬液的方法;所有试剂的来源和批号(如有可能);评价细胞毒性的方法;电泳条件;使用染色技术；评价和测量彗星的方法;（9）结果:对每只动物在试验前和整个试验期间进行一般临床观察(如有);进行细胞毒性试验的证据;超过一周的研究:研究期间的个体体重，包括各组体重范围、平均值和标准差; 剂量-反应关系明显;对于每个组织/动物，%的尾部DNA(或其他测量方法，如果选择)和每张玻片的中位数，每只动物的平均值和每组的平均值;同步和历史阴性对照数据，包括评估的每个组织的范围、平均值/中位数和标准差;并发和历史正控制数据;对于肝脏以外的组织，使用阳性对照的剂量-反应曲线。（10）应用的统计分析和方法; （11）讨论结果和结论彗星试验试剂盒北京汇智泰康针对碱性彗星试验开发彗星试验试剂盒，本试剂盒提供了彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）需要的主要试剂盒耗材，省去了细胞裂解液、细胞悬液、碱性电泳液、电溶胶配制等时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测和多次试验验证，符合碱性彗星试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。碱性彗星试剂盒应用广泛，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒性检测评价。【产品说明】  本试剂盒提供了单细胞凝胶电泳试验（single cell gel electrophoresis,SCGE）需要的试剂和耗材。 1. 细胞裂解液避免了多成分配制的繁琐工艺，保证了每次实验细胞裂解的稳定性。2. 电泳胶经过采用先进工艺规模化制备，出厂前经过严格的质量检测，实验时直接溶解即可使用。3. 针对实验设计的两孔式玻片增加了溶胶的粘附性，使细胞完整，便于拍照分析。【试剂盒应用范围】本试剂盒应用范围非常广，可进行食品与饮用水、化学品、洗涤剂、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装 材料等遗传毒理学检测。【传统试验操作不足】1. 溶液配制繁琐，每次配制裂解效果不同。2. 不同胶浓度会影响DNA尾百分数，过低浓度的胶稳定性差，过高浓度的胶会抑制彗星尾的产生，且反复溶胶会导致储备液蒸发，影响试验结果。3. 传统玻片对溶胶的粘附性较低，且溶胶易流出玻片，损失较大。【试剂盒优势】便捷—— 本试剂盒省去了裂解液配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。【产品使用说明】仪器和设备干热烤箱、低温冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、双稳定电泳仪、电泳槽、倒置荧光显微镜和低速冷冻离心机等。试剂配制 实验开始前，请根据说明书要求自行准备实验所需试剂及耗材。   注：可根据实验实际需求改变试剂的配制量。单细胞悬液制备（1）悬浮细胞：细胞悬浮液经离心分离获得。将细胞以1×105个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。（2）贴壁细胞：轻轻从皿底分离细胞。将细胞和培养基转移到离心管中，进行细胞计数。用1X PBS (不含Ca+和Mg+)冰洗一次。将细胞以1×105个/ml的速度悬浮于1X PBS(不含Ca+和Mg+)中。（3）组织制备：称取组织约0.05 g，加入制备缓冲液（含20 mmol/L EDTA-Na2的PBS）立即剪碎，冲洗。迅速研磨组织，过滤，整个过程在冰上操作。离心重悬，计数单细胞悬液密度约在为1×105～4×105个/mL。制片、裂解、解旋及电泳（1）取120μL浓度为电泳胶A趁热铺于磨砂载玻片上，形成底胶，用盖玻片推匀，不能有气泡，4℃凝固20min。（2）水平取下盖片，取80 μL电泳胶B与20μl细胞悬液混匀，立即铺片，加上盖玻片，4℃凝固5min，形成第二层胶。再取80μL电泳胶B铺在第二层胶上，4℃凝固5min，形成第三层胶。保证细胞均匀分布于每孔，每个样本平行2孔。（3）细胞裂解将玻片置于平皿中，加入预冷的裂解液（裂解液：DMSO=10:1），4℃过夜裂解，裂解液平面刚好没过玻片表面。裂解后，倒掉裂解液，用超纯水清洗3次，5min/次。4、解旋加入预冷的解旋液（pH＞13）没过玻片，4℃避光解旋1h。5、电泳预先将电泳槽置于冰盒内，冷却备用。将解璇后的细胞玻片置于电泳槽，倒入电泳液，调整电压 22-24V，电流约为300Ma，电泳20min。电泳结束后，取出玻片，轻轻擦拭，去除多余液体。超纯水清洗2遍，无水乙醇脱水1遍，5min/次。37℃烘干。染色、拍照及分析染色时将稀释过的Gene Red : Tris-Hcl 1:6000，加到玻片每孔表面，每孔100μL，避光染色30分钟。超纯水清洗3遍，去除多余液体，37℃烘干或室温避光晾干。拍照前关闭实验室光源，使用CASP1.2.3beta2彗星图像分析软件进行分析，每只动物都要分析150个可分析的尾DNA含量百分率的中位数。分析过程中如遇刺猬细胞进行标记。 【注意事项】1.本试剂盒仅供科研使用，不可用于诊断程序。2.实验开始前，请自行准备DMSO、超纯水、手术器械、筛网、无水乙醇、染色液、水平电泳槽等。3.使用组织进行彗星试验时，需注意细胞制备需全程在冰上进行，且保证在1 h内完成铺片。4.电泳胶使用时需提前水浴融化，禁用微波。5.因各实验室条件不同，各种激发光源所需染色液各异，本试剂盒未提供染色液。推荐的染色液包括但不局限于Gene Red、SYBR Green、SYBR Gold等。6.清洗玻片时注意不要直接将液体倾倒至胶面，防止脱胶。    图1 阳性对照                                     图2 阴性对照注：附图仅供参考，以实际为准。 常见问题及原因分析1. 大鼠麻醉处死后，取肝脏样品制备要注意肝的保存温度及保存时间、冷冻组织以及一些其他诸如取样所用缓冲溶液、所取肝脏组织大小等因素。取好的肝脏在制成单细胞悬液前最多在冰上保存1h。一半彗星实验所取的肝脏大小约为0.05cm³。2. 如需将组织冷冻，应将组织取出后迅速并深度冷冻，直至制备单细胞悬液时取出。3. 解旋时间会影响DNA尾百分数，DNA尾百分数随着解旋时间的延长而增长。4. 电泳时间会影响DNA尾百分数，细胞DNA迁移随着电泳时间的增长二增长。可以通过改变电压提高试验的灵敏度，推荐电压为0.7V/cm。5. 如有其他技术问题，可联系汇智泰康。

吸入给药作为口服，静脉给药外的另一种给药途径，在便携性，服药依从性等方面有其独特优势，越来越得到广泛应用。汇智泰康是国内较早开展吸入给药的安评机构，可完成单一或多种物质在气态、液态气溶胶、粉尘气溶胶和纳米颗粒气溶胶状态下的急性、亚急性、亚慢性、慢性动物口鼻或全身动态吸入染毒试验研究。 服务领域：药物，化学品，农药，化妆品等试验样品：    药物：喷雾剂（Nebulizer）、粉雾剂（DPIs）、气雾剂（MDIs）、气体造影剂等农药、化学品：气体、液体气溶胶、固体气溶胶、蒸气 动物种属：大鼠，小鼠                                                服务项目：急性吸入毒性研究：OECD 403  急性吸入毒性试验OECD 403  Acute Inhalation Toxicity TestOECD 436   急性吸入毒性试验：急性毒性试验的阶层法OECD 436   Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method亚急性、亚慢性吸入毒性研究：OECD 412  亚急性吸入毒性：28天试验OECD 412 Subacute Inhalation Toxicity: 28 day StudyOECD 413  亚慢性吸入毒性：90天试验OECD 413 Subchronic Inhalation Toxicity: 90 day Study孕期发育毒性研究：OECD414 孕期发育毒性试验OECD414 Prenatal Developmental Toxicity Study体外吸入毒性研究依据物质特性确定方法、周期确定给药方案 仪器设备空气发生系统排出气回收系统气溶胶发生系统气体实时监测与控制系统空气动力学粒径谱仪挥发性有机物检测仪GC-MSLC-MS/MS Q&AQ：易挥发液体，沸点19℃，蒸气压 (19.93℃) 106.5 Kpa常规动物染毒暴露条件下 (22±3°C), 化合物易形成气体和液溶胶等形式混合物。如何在每日4或6小时的暴露条件下保持稳定且浓度恒定的染毒剂量？As: 样品经持续加热至蒸气，维持恒定的染毒仓浓度；使用气体采样袋收集染毒带气体样本，使用GC-MS进行检测；建立并验证暴露浓度的GC-MS方法；使用GC-MS检测/监测染毒过程中的实际暴露浓度。

1 概述1.1 药物代谢研究简介药物代谢研究是创新药物研发的重要内容，它不仅决定了创新药物制剂研发的成败，而且与创新药物研发的速度和质量有密切关系。因而，药物代谢研究在新药研发工程中具有不可或缺的重要作用，研究药物代谢对于了解药物在体内的变化过程至关重要。药物代谢研究的方法主要分为体内和体外两种。体内代谢法因药物在生物体内的分布较广，加上代谢转化的器官和酶系的多样性，使药物及其代谢产物在体内的浓度比较低，代谢产物的检测具有一定的困难。体外代谢法在短时间内可以得到大量的代谢产物，且代谢条件可控，代谢体系比较“干净”，代谢物易于分离、提取，有利于代谢途径研究及代谢产物结果的确定等，因而，体外代谢法具有突出的优越性。由于肝脏是药物代谢的主要场所，体外代谢模型多以肝脏为基础。目前，研究体外代谢方法主要有：肝微粒体体外温孵法、重组P450酶体外温孵法、肝细胞体外温孵法、肝脏离体灌流法和肝切片法。其中，肝微粒体体外温孵法与其他体外代谢方法相比，酶制备简单，代谢过程快，重现性好，易大量操作，同时可用于药物代谢酶的抑制及体外清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。1.2 药物代谢药物代谢，又称药物的生物转化（biotransformation），是指药物经过体内吸收、分布之后，在药酶的作用下经历化学结构变化的过程，是药物从体内消除的主要方式之一。药物在体内的生物转化，分为Ⅰ相代谢反应和Ⅱ相代谢反应。肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢Ⅰ相代谢和Ⅱ相代谢的各种酶。在肝脏中，参与药物代谢的Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶中以P450酶重要，它是一种以铁卟啉为辅基的蛋白质。P450酶存在明显的种属、性别和年龄的差异，其中以种属差异表现明显，不同种属的P450同工酶的组成不同，因此药物在不同种属的动物和人体内的代谢产物可能是不同的。1.3 药物的Ⅰ相代谢药物在Ⅰ相代谢反应中主要发生氧化、还原和水解的反应，经过Ⅰ相代谢反应，药物可能带有一些极性基团，如羟基、羧基等。氧化反应是最多见的第Ⅰ相反应，单加氧酶系是氧化异源物最重要的酶，单加氧酶主要存在于滑面内质网的微粒体中，能催化烷烃、烯烃、芳烃和类固醇等多种物质进行氧化。由细胞色素P450、NADPH+H+、NADPH-细胞色素P450还原酶（以FAD为辅基的黄酶），催化基本反应为：RH+O2+NADPH+H+→ROH+NADP++H2O单加氧酶能直接激活氧分子，使其中一个氧原子直接加入底物分子中形成羟化物或环氧化物，另一个氧原子则被NADPH还原为水。由于一个氧分子发挥了两种功能，故单加氧酶系又称为混合功能氧化酶；又因底物的氧化产物是羟化物，所以又称为羟化酶。加单氧酶的反应见图1： 图1 加单氧酶的反应肝细胞微粒体内存在的还原酶主要有硝基还原酶和偶氮还原酶，是第Ⅰ相反应的主要还原酶，能使硝基化合物和偶氮化合物还原生成胺类（见图2）。 图2 硝苯和偶氮苯的还原反应肝微粒体中含有多种水解酶，如酯酶、酰胺酶、糖苷酶等，可分别催化酯类、酰胺类、糖苷类化合物的水解（见图3），以降低或消除其生物活性。 图3 乙酰水杨酸的水解反应2 Ⅰ相代谢稳定性实验原理肝药酶CYP即细胞色素P450氧化酶（CYP450），属于单加氧酶（momooxygenase），也称肝微粒体混合功能氧化酶，多位于内质网和线粒体内壁上，参与药物、致癌物、类固醇激素和脂肪酸等多种内、外源性物质代谢。肝药酶CYP氧化还原酶（POR）是所有肝微粒体酶的电子供体，通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）将电子传递给CYP450酶，CYP450酶得到电子后再与底物发生氧化还原反应，从而发挥代谢活性。肝微粒体中包含了大部分Ⅰ相酶，其中最重要的是以CYP450为主要成分的微粒体混合功能氧化酶系统，在用肝微粒体进行研究时，如加入相应的辅助因子NADPH，则可重组体外代谢体系，从而通过体外温孵法进行Ⅰ相代谢稳定性研究。3 肝微粒体体外温孵法实验方法描述    肝微粒体体外温孵法是采用肝微粒体，辅以NADPH再生系统，在体外模拟生理环境条件进行代谢反应，经过一定时间的反应后，采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物，并对代谢产物进行初步的分析和鉴定的方法。3.1 肝微粒体制备微粒体是指在细胞匀浆和差速离心过程中获得的由破碎的内质网自我融合形成的近似球形的膜囊泡状结构，是异质性的集合体。它包含内质网膜和核糖体两种基本成分，在体外实验中具有蛋白质合成、蛋白质糖基化和脂类合成等内质网的基本功能。目前，制备肝微粒体常用的方法是差速离心法。具体制备流程见下图（图4）：图4 肝微粒体制备流程图3.2 体外孵育体系的建立Ⅰ相代谢稳定性研究的肝微粒体体外孵育体系，是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境的条件下进行生化反应的体系。推荐使用的孵育体系为：每个孵育体系总体积为200 µL，体系包括0.1M PH 7.4 的磷酸缓冲液，NADPH发生系统（1mM NADP，5 mM的6-磷酸葡萄糖，1 U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶，3.3 mM的氯化镁）；0.5 mg/mL的肝微粒体蛋白；合适浓度的待测物，于37°C水浴孵育，每个样品平行3次，以不包含NADPH发生系统的样品作为阴性对照。于预设的反应时间点，如0，5，10，15，30，60 min后加入等体积预冷的乙终止反应。3.3 原型药物或代谢产物的检测采用HPLC、HPLC-MC和HPLC-MC/MC测定温孵液中原型药物和其代谢产物。图5为采用LC-MS/MS测定药物在人、犬和大鼠肝微粒体中的代谢情况，从图上可知，药物在三种肝微粒体中均存在明显代谢，但不同种属间又存在显著差异。图5药物在人，犬，大鼠肝微粒体中的代谢情况4 汇智泰康Ⅰ相代谢稳定性试剂盒简介北京汇智泰康医药技术有限公司针对药物代谢研究的需要，以肝微粒体体外温孵法为指导，开发了一款专门用于Ⅰ相代谢稳定性研究的试剂盒，该产品可直接用于药物的Ⅰ相代谢稳定性研究，省去了肝微粒体制备和试剂配制的繁琐过程，大大缩短了实验周期，且试剂盒各组成成分经过严格的质量检测，符合Ⅰ相代谢稳定性研究试验要求，实验结果准确、可靠、重现性好。4.1 产品说明本产品提供了药物Ⅰ相代谢研究用到的肝微粒体、NADPH再生系统及其它组分，可直接用于药物Ⅰ相代谢稳定性的研究。本产品可提供肝微粒体有：人肝微粒体、恒河猴肝微粒体、比格犬肝微粒体、大鼠肝微粒体和小鼠肝微粒体，可根据实际需求，选择不同种属的肝微粒体。4.2 试剂盒优势便捷——本试剂盒省去了肝微粒体制备和试剂配制时间，可以直接使用，大大缩短了实验周期。准确——本试剂盒各成分均经过严格的质量检测，实验结果准确、可靠、重现性高。稳定—— 本试剂盒稳定性强、易于运输和保存。4.3 产品组成50反应/盒，200μL/反应。4.4 产品使用说明本产品需于-70℃冰箱冷冻保存，切记避免反复冻融。试验具体操作如下：4.4.1 试验组1）冰浴融化试剂盒各组分，置于冰上待用；2）除微粒体外，将孵育体系其它各组分按照配比混合并吹吸混匀，于37℃预孵育5min；例：200μL孵育体系配制：注：a.体系中有机溶剂加入量不得大于1%。    b.若实际需要n个孵育体系，则需配置n＋1个体系。3）将以上混合液195μL/管分装至1.5mL离心管中，于37℃水浴中保温， 5μL/反应加入肝微粒体，吹吸3次混匀于37℃水浴条件下启动代谢反应，使用秒表计时；4）于设定孵育时间点，向孵育体系中加入200μL预冷的乙终止反应（预冷乙：孵育体系体积=1:1）。4.4.2 对照组1）阳性对照组：将受试物换为阳性底物；2）阴性对照组：不加A液、B液；3）空白对照组：只包含底物和PBS缓冲液。4.5 运输条件    干冰运输。4.6 使用注意事项1）实验开始前，请自行准备1.5mL离心管、不同规格枪头、乙、37℃水浴锅等。2）产品仅供科研使用，不能用于人体及动物的治疗或临床诊断。3）用前，需于冰浴条件下解冻并混合均匀。4）-70℃冰箱冷冻保存，切勿反复冻融。5)用过程中，也可根据实际实验需求调整各组分的加入量。

外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞（Lymphocyte）、单核细胞（Monocyte）、树突状细胞（DC）和其他少量细胞。PBMC可通过健康人或动物供体的外周血，通过Ficoll密度梯度离心法（IPHASE/汇智和源），磁珠分选等步骤获得。　　Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量400,000，当密度为1.2g/mL，未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。  人PBMC中不同细胞类型的比例PBMC中大部分都是淋巴细胞，包括B细胞和T细胞，其中CD3 T细胞又占了淋巴细胞中绝大部分(45-70%)。这些T细胞都处于初始（naive）状态，即已经成熟了但没有受到抗原刺激。 在正常人中，只有非常小的一部分初始T细胞会因抗原识别而被激活。同样的B细胞也都处于初始状态。相对于淋巴细胞，单核细胞的比例在10-30%，收到刺激之后会发育成树突状细胞(DC)或巨噬细胞。干细胞的比例非常低，只有0.1-0.2%，因此很难从全血样本中分离到。   一、外周血单个核细胞（PBMC）制备方法1.设备与试剂全血 （以10ml为例）无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) RPMI 1640培养基 胎牛血清（FBS）双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) 二甲亚砜（DMSO）预先装好异丙醇的冻存盒 2.方法/步骤配制所需的溶液：a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；（1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；（2）取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；（3）2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；（4）PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。（5）加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；（6）加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；（7）细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。  IPHASE/汇智和源建议操作注意事项（1）全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。（2）分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。（3）人PBMC和动物PBMC分离方法稍有不同，动物PBMC需求可联系IPHASE/汇智和源。 细胞运输与保存（1）干冰运输，收到细胞后立即转入液氮冻存或直接复苏；（2）T25瓶运输的新鲜细胞，收到后应继续生长，传代达到细胞生长状态良好时，再进行冻存，具体操作步骤见细胞培养步骤。 PBMC收到后注意事项（1）收到PBMC细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时反馈。（2）先不打开瓶盖，瓶身擦拭酒精后放培养箱静置四小时，稳定细胞状态，切忌在温箱内静置过夜。（3）静置后镜检，拍照，记录细胞状态。建议传代后也拍照记录细胞生长情况。（4）贴壁细胞：若细胞密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，收集细胞瓶内的培养基，留8ml继续培养至80%左右再传代，瓶盖可稍微拧松。（5）细胞瓶内的培养基含血清和双抗，可收集后4℃保存备用，可补加2%血清。刚开始传代时建议一半用细胞瓶内的培养基，一半用自备的培养基，使细胞逐渐适应培养条件，以免因不适应而造成生长状态不佳。（6）细胞胰酶消化液建议使用PBS配制。 IPHASE/汇智和源其他外周血单个核细胞：人外周血单个核细胞 Human PBMC猴外周血单个核细胞 Monkey PBMC比格犬外周血单个核细胞 Dog PBMC大鼠外周血单个核细胞 Rat PBMC小鼠外周血单个核细胞 Mouse PBMC兔外周血单个核细胞 Rabbit PBMC猪外周血单个核细胞 Pig PBMC

体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test【试验原理】体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。这些细胞系，最常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT， 从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。【参考标准】GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验【材料和试剂】细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。对于 V79和 CHO 细胞，常用最低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。对于 TK6 和 L5178Y细胞，常用 RPMI 1640培养液，加人10%马血清（培养瓶培养）或20%马血清（96孔板培养）和适量抗菌素（青霉素、链霉素）。胰蛋白酶/EDTA溶液：用无钙、镁 PBS配制，胰酶的浓度为0.05 %，EDTA 的浓度为0.02% ,胰蛋白酶与EDTA溶液按1:1混合。-20℃储存。活化系统：通常使用的是S9混合物。选择剂：6-硫代鸟嘌呤(6-TG)，建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL,用碳酸氢钠溶液(0.5 %)配制。预处理培养液(THMG/THG)：为减少细胞的自发突变频率，在试验前，先将细胞加在含 THMG的培养液中培养24h，清除自发的突变细胞，然后再将细胞接种于THG(不含氨甲喋呤的THMG培养液)中培养1d～3d至细胞恢复正常生长周期和形态。THMG 所含各物质终浓度如下(除培养液成分外):————胸苷，5×10-6 mol/L；————次黄嘌呤，5×10-5 mol/L；————氨甲喋呤，4×10-7 mol/L；————甘氨酸，1×10-4 mol/L；【试验方法】一、受试物受试物配制：固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度。受试物应在使用前现用现配，否则就必须证实贮存不影响其稳定性。溶媒的选择：溶媒必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶媒是蒸馏水；对于不溶于水的受试物可选择其他溶媒，首选二甲基亚矾(DMSO)，但使用时浓度不应大于0.5%。对照：每一项试验中，在有无代谢活化系统条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。阳性对照：当使用代谢活化系统时,阳性对照物必须是要求代谢活化、并能引起突变的物质，可以使用3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene)、N-亚硝基二甲胺(N-nitroso-dimethylamine)、7,12-二甲基苯并[a]蒽(7, 12-dimethylbenz[a]anthracene)等。在没有代谢活化系统时,阳性对照物可使用甲磺酸乙酯(ethyl methanesulphonate)、乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)等。也可使用其他适宜的阳性对照物。阴性对照：阴性对照(包括溶媒对照)除不含受试物外，其他处理应与受试物相同。此外，当不具有实验室历史资料证实所用溶媒无致突变作用和无其他有害作用时，还应设空白对照。二、剂量最高浓度选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH 或渗透压的改变。细胞毒性确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在代谢活化系统存在和不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对存活率。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。浓度设置和最高浓度选择：至少应设置4个可供分析的浓度。当有细胞毒性时，其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性，通常浓度间隔系数在2～√10之间；如最高浓度是基于细胞毒性，那么该浓度组的细胞相对集落形成率或相对存活率应为 10%～20 %(不低于10% )。对于那些细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5μL/mL、5mg/mL或0.01mol/L。对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值；最好在试验处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变化，不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。三、试验步骤和观察指标贴壁生长细胞的试验步骤和观察指标：细胞准备：将5×105 个细胞接种于直径为10 mm平皿中，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养24h。接触受试物：吸去培养液，PBS洗两次，加人一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及S9混合物(无需代谢活化者用无血清培养液补足），置于培养箱中3h～6h，结束后吸去含受试物的培养液，用 PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19h～22 h。表达：接触受试物的细胞继续培养19h～22 h后用胰酶-EDTA 消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管以800r/min～1000r/min的速度离心5min～7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105 个细胞接种于直径为10 mm 的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最佳表达时间为6d～8d）。细胞毒性测定：将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。突变体的选择及集落形成率的测定：表达结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～10μg/mL），放人培养箱培养8d～10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，并计算突变频率。悬浮生长细胞的试验步骤和观察指标：细胞准备及接触受试物：取生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1%体积加入一定浓度的受试物及S9混合物（无需代谢活化者用无血清培养液补足），37 ℃振摇处理3h～6h，以800r/min～1000r/min的速度离心4min～6min，弃上清液，用PBS或无血清培养液洗细胞2次，重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中，并调整细胞密度为2×105/mL。PE0（0天的平板接种效率）测定：取适量细胞悬液，作梯度稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加0.2mL，即平均1.6个细胞/孔），每个剂量接种1～2块平板，37℃，5 二氧化碳，饱和湿度条件下培养9d～11d，计数每块平板有集落生长的孔数。表达：取上一步所得细胞悬液，作6d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在1×106/mL以下。PE6（第六天的平板接种效率）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，按PE0（0天的平板接种效率）测定方法测定PE6。突变频率（MF）测定：表达培养结束后，取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，加人6-TG（建议使用终浓度为5μg/mL～15μg/mL），混匀，接种96孔板（每孔加0.2mL，即2×104 个细胞/孔），每个剂量接种2～4块平板，37℃，5%二氧化碳，饱和湿度条件下培养11d～14d，计数有突变集落生长的孔数。【数据处理和结果评价】数据处理贴壁生长细胞 HGPRT试验数据处理：细胞毒性：以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶媒对照的集落形成率为100%(1.00),求出各受试物组的相对值。 集落形成率和突变频率： 悬浮生长细胞 HGPRT试验数据处理：平板接种效率(PE0、PE6)：  相对存活率（RS）： 突变频率（MF）： 结果评价：阳性结果的判定：受试物组在任何一个剂量条件下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。阴性结果的判定：不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。【试验报告】试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。试验摘要。受试物：名称、鉴定资料、CAS编号（如已知）、纯度、与本试验有关的受试物的物理和化学性质及 稳定性等。溶媒和载体：溶媒和载体的选择依据，受试物在溶媒和载体中的溶解性和稳定性。细胞株：名称、来源、浓度及培养条件（包括培养基的组成、培养温度、CO2浓度和培养时间）。试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。试验结果：各剂量组受试物（加和不加S9）对细胞的毒性和突变频率的均数和标准差、是否具有剂量-反应关系、统计结果，同时进行的阴性（溶媒）对照和阳性对照的均数和标准差、以及阴性（溶媒）对照和阳性对照的历史范围。结论：本试验条件下受试物是否具有致突变作用。【试验解释】若阴性对照中，集落形成率或存活率低于50%，结果应不采用。各实验室选用的阳性对照突变频率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下限以上，否则结果不能成立。HGPRT基因突变试剂盒北京汇智泰康针对体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验开发HGPRT基因突变试剂盒，试剂盒提供了进行体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验所需的主要试剂和细胞(V79)，可用于评价受试物的致突变作用。所用细胞和试剂均符合国标GB 15193.12-2014 《食品安全国家标准 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验》的要求。20mL×24体系/盒，4个剂量组。【产品使用说明】1、细胞复苏收到试剂盒后，请尽快复苏细胞。从-70℃冰箱中取出细胞，于37℃水浴融化，离心，弃上清，用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基重悬；再次离心，弃上清，用10% FBS培养基，接种于细胞培养瓶中，放置于37℃的二氧化碳培养箱中培养，后期细胞传代比例为1:3。2、自发突变细胞清除取对数生长期细胞悬液，于含1% （V/V）的THMG的培养液中培养24 h，离心，洗涤后将细胞接种于含1% （V/V）的THG（不含氨甲喋呤）培养液中继续培养1d~3d，至细胞恢复正常生长周期和形态。注：为确保试验的可行性，试验中所用细胞的自发突变率应在5×10-6~20×10-6之间，清除自发突变的细胞传代使用不得超过1个月，且每次试验前需将细胞清除自发突变。3、染毒处理将5×105个细胞接种于直径为100mm的平皿中，于37℃，5%二氧化碳培养箱中放置培养24h。吸去培养液，PBS洗两次，加入一定量的无血清培养液、一定浓度的受试物及10%S9混合液（无需代谢活化者用无血清培养液或S9反应液PS补足），置于37℃，5%二氧化碳培养箱中培养3~6h，结束后吸去含受试物的培养液，用PBS洗细胞两次，换入含10%血清的培养液，继续培养19~22h，每个试验组平行处理两份培养物。（1）S9混合液及染毒用细胞液配制注：在试验过程中，需根据实际需求，调整配制量。（2）推荐染毒培养体系配制方案（试剂盒仅提供1次完整实验的4个剂量组所需）注：1.染毒时间可根据实际情况进行调整，一般为3h~6h，必要时可延长到1个或多个细胞周期。2.如进行短时间染毒，可直接加入稀释并混合均匀的丝裂霉素C；若进行24h染毒，则需将丝裂霉素C再稀释2.5倍后再加入。4、表达培养接触受试物的细胞继续培养19~22h后，用胰酶-EDTA消化，待细胞脱落后，加入含10%血清的培养液终止消化，混匀，放入离心管中800r/min~1000r/min的速度离心5~7min，弃上清液，制成细胞悬液，计数，以5×105个接种于直径为100mm的平皿，3d后传代，仍接种5×105个细胞培养3d（最佳表达时间为6d~8d）。5、细胞毒性测定将上述首次消化计数后的细胞每皿接种200个，每组5个皿，37℃、5%的二氧化碳条件下培养7d，固定，Giemsa染色，计数每皿集落数。以相对于溶媒对照组的集落形成率表示细胞毒性，即以溶媒对照的集落形成率为100%，求出各受试物组的相对值。计算公式见（1）：A=B/C×100%------------------------------------------（1）式中：A—相对集落形成率，%；B—受试物组集落形成率，%；C—溶媒对照组集落形成率，%。6、突变体的选择和集落形成率的测定表达培养结束后，消化细胞，分种，每组5个皿，每皿接种200个细胞，不加6-TG，7d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算集落形成率。同时另做突变频率测定，每组5个皿，每皿接种2×105个细胞，待细胞贴壁后，按照千分之一的比例加入6-TG，放入培养箱中培养8~10d后固定，Giemsa染色，统计每皿集落数，计算突变频率。集落形成率计算见式（2）：D=E/F×100%-------------------------------------------（2）式中：D—集落形成率，%；E—实际存活的细胞集落数；F—接种细胞数。突变频率计算见式（3）：式中：G—突变频率；H—突变集落数；I—接种细胞数；D—集落形成率。7、结果评价7.1 实验成立条件若阴性对照中，集落形成率低于50%，结果应不予采用。若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对照的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不成立。7.2 结果判定受试物组在任何一个剂量下的突变频率为阴性（溶媒）对照组的3倍或3倍以上，可判定为阳性。受试物组的突变频率增加，与阴性（溶媒）对照组比较具有统计学意义，并有剂量-反应趋势，则可判定为阳性。受试物组在任何一个剂量条件下引起具有统计学意义的增加并有可重复性，则可判定为阳性。不符合上述阳性结果判定标准，则可判定为阴性。【注意事项】实验前请自行准备胎牛血清、RPMI1640基础培养液、胰酶-EDTA、Giemsa染色液、100mm平皿、灭菌枪头、无菌移液管、二氧化碳培养箱、振荡器、50mL离心管等，所有耗材需做无菌处理。

中华人民共和国国务院令第727号《化妆品监督管理条例》在2020年1月3日国务院第77次常务会议通过，自2021年1月1日起施行。《化妆品监督管理条例》中第七十七条规定：牙膏参照本条例有关普通化妆品的规定进行管理。根据法规要求，是不是意味着牙膏成为了化妆品呢？在2021年1月14日国家药监局召开的化妆品监管条例实施新闻吹风会上，国家药监局化妆品监管司副司长戚柳彬对“牙膏参照有关普通化妆品的规定进行管理是基于什么考虑”这个问题进行了回答。其中提到牙膏在原料管理、标签管理上有区别于普通化妆品的独特之处，因此条例规定是“参照”而不是“按照”普通化妆品进行管理。下一步，国家药监局将按照条例规定要求，充分尊重牙膏监管的自身规律，在考虑行业发展现状、历史沿革的前提下，严格落实“四个最严”要求，推进相关配套规章和规范性文件的起草工作。国家药监局化妆品监管司为贯彻落实《化妆品监督管理条例》，组织起草了《牙膏备案资料规范》（征求意见稿），向社会公开征求意见并于2021年1月5日发布了关于公开征求《牙膏备案资料规范》法规文件意见的函。征求意见稿中对牙膏备案提交资料和备案检验要求进行了明确规定。2021年1月7日国家市场监督管理总局令第35号公布《化妆品注册备案管理办法》已于2020年12月31日经国家市场监督管理总局2020年第14次局务会议审议通过，自2021年5月1日起施行。也就意味着《牙膏备案资料规范》将于2021年5月1日开始执行。征求意见稿中第二十四条（备案资料总体要求）规定牙膏备案人办理备案时，应当提交以下资料：（一）《牙膏备案信息表》及相关资料； （二）产品名称命名依据；（三）产品配方；（四）产品执行的标准；（五）产品标签样稿； （六）产品检验报告；（七）产品安全评估资料。征求意见稿附件2中对牙膏备案检验提出了以下要求同一牙膏的备案检验项目，应当由同一检验检测机构独立完成并出具检验报告。牙膏备案检验，应当依据相关标准及技术规范，结合产品功效类别进行相应的检验工作：一、牙膏应当按照表1-1、1-2、1-3确定检验项目，其中表1-1、1-2中涉及检验项目的检验应当由取得检验检测资质认定（CMA）并具备相应检验能力的检验检测机构完成。二、产品配方中含有以下原料的产品，应当按以下要求确定检验项目： （一）配方中含有甘油、丙二醇或聚乙二醇原料的产品，应当检测二甘醇和乙二醇；（二）配方中含有乙醇、异丙醇含量之和大于等于10%的产品（质量分数），应当检测甲醇； （三）配方中含有乙氧基结构原料的产品，需检测二噁烷项目；（四）配方中含有滑石粉原料的产品，需检测石棉项目；（五）配方中含有甲醛释放体类原料的产品，需检测游离甲醛项目。三、pH值低于5.5的牙膏，应在国家药品监督管理局公布的检验检测机构进行安全性评价的检测。四、根据牙膏使用原料及产品特性，对产品中可能存在并具有安全性风险的物质，国家药品监督管理局经过安全性风险评估认为必要时，可要求增加相关检验项目。   注：①配方中含有甘油、丙二醇或聚乙二醇的产品，应当检测二甘醇和乙二醇。（在牙膏成品中，由其他原料作为杂志带入的二甘醇和乙二醇的和应该小于等于0.1%）②乙醇、异丙醇含量之和≥10%（w/w）的产品，需检测甲醇项目。  ③配方中含有乙氧基结构原料的产品，需检测二噁烷项目。④配方中含有滑石粉原料的产品，需检测石棉项目。⑤配方中含有甲醛释放体类原料的产品，需检测游离甲醛项目。⑥配方中含有氟化物，需检测游离氟或可溶氟量项目。以单氟磷酸钠或单氟磷酸钠与氟化钠（氟化亚锡、氟化铵）复合使用的含氟牙膏适合可溶氟检测方法；以氟化钠或（氟化亚锡、氟化铵）为原料的含氟牙膏适合游离氟检测方法。若使用的氟化物超出单氟磷酸钠、氟化钠、氟化亚锡、氟化铵四种氟化物，应选择适宜的检测方法进行。⑦配方中含有氟化物，需检测总氟量项目。 注：①pH低于5.5的产品，备案人应提供一份由国家药品监督管理局公布的检验检测机构对口腔硬组织（含牙釉质和牙本质）进行安全性评价的检验报告。资料来源：《化妆品监督管理条例》《牙膏备案资料规范》（征求意见稿）2019年10月，汇智泰康通过国家食品药品监督管理局化妆品备案与注册检验服务机构资质审批，成为国内首批化妆品备案与注册检验检测机构，可进行理化、微生物和毒理学各类项目检验检测。

近日来儿童使用“激素面霜”导致类库欣综合征的事件引起了激烈讨论。其实此类事件并不是第/一次发生，2019年“3•15”时《中国消费者报》报道其购买了市场上热销的8款产品进行检验，含有激素的6款“宝宝霜”均为“卫消字号”产品。在此类事件屡禁不止的情况下除了监管部门要加大力度打击不法商家，作为消费者也要学会甄别护肤用品。挑选皮肤用产品要先了解各类产品有什么区别，目前市面上常见的皮肤用产品大概分为：国药准字、妆字号、消字号、械字号。国药准字是指在现行《药品管理法》中规定，生产药品“需要经过国务院药品监督管理部门批准，并发给药品批准文号”。相应的皮肤产品为药品，要遵从医嘱使用。妆字号是化妆品（以涂擦、喷洒或者其它类似的办法，散布于人体表面任何部位，以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰目的的日用化学工业产品）的代号。化妆品如含有现行《化妆品卫生规范》中规定的限用物质、限用防腐剂、限用紫外线吸收剂、限用染发剂等，会按照《化妆品卫生规范》要求在标签上标注相应的使用条件和注意事项。消字号是经地方卫生部门审核批准的卫生批号，属于卫生消毒用品范畴。消字号仅有消毒功能不具备治疗效果，生产企业和经营企业不应该对“消”字产品做任何有疗效的宣传。并且《消毒产品生产企业卫生规范》第三十条明确规定：“消毒产品禁止使用抗生素、抗真菌药物、激素等物料。”械字号是指医疗器械备案字号，常见的有械字号面膜。械字号产品是风险程度低，实行国家常规管理可以保证其安全、有效的医疗器械。械字号产品安全性更高，经过国家药品监督管理局备案，特殊人群使用时更安全。如：敏感性皮肤、激素脸、玫瑰痤疮等皮肤抵抗力比较差时都可以进行使用。 综上，消费者如果是选用日常护肤产品，首/选妆字号产品或者根据需要选择械字号产品。并且一定要在正规渠道选购产品，购买到的产品可以通过国家药品监督管理局“化妆品查询”、“医疗器械查询”查询产品的备案信息，防止购买到三无产品。同时要学会查看产品说明书中的成分，对于一些致敏成分，要依据自身情况进行选择。容易致敏的的色素、香精和防腐剂可以在网上进行查询。对于有湿疹等皮肤问题的情况，应及时就医，遵从医嘱使用产品。 2019年10月，汇智泰康通过国家食品药品监督管理局化妆品备案与注册检验服务机构资质审批，成为国内首批化妆品备案与注册检验检测机构，可进行理化、微生物和毒理学各类项目检验检测。http://www.iphasepharma.com/Service?id=358db41c-7ab6-4505-b025-36175c30dc4a检验产品包括：润肤膏霜、化妆水、润肤乳液、啫喱、洁面乳、面膜、精华、眼霜、眉笔、眼线笔、粉饼、粉底液、睫毛膏、眼影、唇彩、唇膏、腮红、沐浴露、洗发水、指甲油