Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

订购信息

产品描述

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂DNA 的3′-OH末端催化掺入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。 TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞， 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中， TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的3′-OH末端。抗原标记的 dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

产品组分

保存方法

本产品应置于-20℃储存；TUNEL Reaction Buffer 避光储存于-20℃，避免反复冻融。有效期见外包装。

【注】：TUNEL Equilibration Buffer和TUNEL Reaction Buffer中含有有毒、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride，使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后，请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

实验材料（自备）

PBS 缓冲液（pH～7.4）

4%多聚甲醛（in PBS）

牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清

70%乙醇（自选）

脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

蛋白酶K（石蜡切片样本）

操作步骤

1.样本准备：

细胞样品

（1）可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液）。

（2）PBS清洗细胞两次。

（3）细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液， 4℃ 放置 30 min。

（4）PBS清洗细胞两次。

（5）通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室温放置 20 min。

（6）PBS清洗细胞两次。

石蜡组织切片

（1）室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min， 以彻底脱掉石蜡。

【注】：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

（2）室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。

（3）室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗1次，每次5 min。

（4）室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3 min，再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

（5）用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

（6）按1:100的比例， 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释， 使其终浓度为20 μg/mL。每个样本上滴加100 μL稀释好的Proteinase K溶液， 使溶液覆盖全部样本区域， 室温孵育20 min（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 μm左右的片子可以用10 min，但30 μm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

（7）PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

【注】：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

冰冻组织切片

（1）将冰冻切片放置于室温的片架上，室温20 min，晾干。

（2）将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定30 min。

（3）PBS 浸润清洗切片两次，每次5 min。

（4）用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

（5）按1:100的比例， 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释， 使其终浓度为20 μg/mL。每个样本上滴加100 μL稀释好的Proteinase K溶液， 使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10 min（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 μm左右的片子可以用10 min，但30 μm左右的可用30 min，需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

（6）PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤)

（1）按1:10的比例用ddH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。

（2）滴加100 μL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5 min。

（3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL)，使其为终浓度20 U/mL的工作液。

（4）轻轻吸掉多余液体，加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液，室温孵育10 min。

（5）轻轻吸掉多余液体，PBS清洗样品2次。

2. TUNEL 反应：

（1）每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液，孵育 5 min。

（2）预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。

（3）弃去平衡缓冲液，用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体，每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。

a.贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b.悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。

c.组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。

d.去掉反应液，在1×PBS 的染色缸中浸泡润洗2次，每次5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本3 次，每次5 min，以降低背景。

（5）（可选）复染：每个样本滴加浓度为2 μg/mL 的DAPI染液，避光室温孵育10 min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在1×PBS中浸泡润洗3次，每次5 min。

（6）（可选）封片：将切片样本先纯水浸没5 min，再放入70%乙醇浸没5 min ，再80%乙醇浸没5 min，90%乙醇浸没5 min，95%乙醇浸没5 min，无水乙醇浸没5 min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理2次，每次5 min（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加50 μL抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

（7）用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，Cy3的激发波长为550nm，发射波长为570nm（凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光，没有加入TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光）。

注意事项

1.该产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！