活性检测CCK-8细胞增殖与毒性检测试剂盒-10000

产品描述

Cell Counting Kit-8 (CCK-8试剂盒)，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度的比色检测试剂盒。检测原理为：WST-8在电子耦合剂1-Methoxy PMS存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan，参考图1)，生成的甲臜的颜色深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm 波长处测定OD 值，间接反映活细胞数量。

本试剂盒可用于细胞增殖测定，细胞毒性的检测，药物筛选，以及细胞生长抑制检测等。

图1：WST-8分子结构及检测原理

保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期2年，反复冻融会造成测定背景OD值升高。

使用方法

1.  以96孔板为例，96孔板中每孔接种100 μL的细胞悬液，在细胞培养箱预培养24 h。

2.  向每孔加入10 μL不同浓度的待测物质。如果仅测定细胞活性，则不需要2~3步骤，直接从第四步操作。

3.  将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (依据待测药物而定)。

4.  向每孔加入10 μL CCK-8溶液 (注意不要产生气泡，轻轻混匀)。

5.  将培养板在培养箱内孵育适当时间（一般1~4 h）。

6.  酶标仪测定450 nm处的吸光值。

注意事项

1. 建议调试合适的接种细胞的数量和加入CCK-8溶液后培养的时间。

当使用标准96 孔板时，贴壁细胞至少1000 个/ 孔(100 μL 培养基)，白细胞至少2500 个/ 孔(100 μL 培养基)。

建议实验前设定几个不同细胞数量的梯度孔进行条件测试，细胞培养时间和处理方法根据实验情况而定，加入CCK-8溶液后（加入体积为每孔细胞培养液体积的10%），在37℃细胞培养箱中孵育，不同时间点后测450 nm处的吸光值(CCK-8敏感性高，一些细胞0.5 h后就可以测定第一次)。

2．CCK-8试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化反应，如果待检测体系中有较多还原剂（或抗氧化剂）会造成背景OD    值升高，干扰检测结果。如果实验中有还原剂，请检查背景的OD值，设法先去除还原剂干扰。例如，可在加入CCK-8溶液之前更换新鲜的培养基，以去除待测药物的影响。当待测药物影响比较小时，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

3．进行药物抑制实验时，如果药物中含有金属，如Pb2+、Fe2+、Cu2+等金属会对CCK-8 Solution的显色反应产生影响，从而导致检测的灵敏度降低。

4．如果细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化，应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8检测。细胞培养基酚红不影响测定结果。

5．为使CCK-8试剂盒培养基充分混匀，减少CCK-8在移液器上的残留，建议加样前用培养基稀释CCK-8试剂，混匀后加样。

6．若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入0.1 M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，室温避光保存，24 h 内检测，吸光度不会受到影响。(加入1% SDS 溶液的体积与加入CCK-8溶液的体积相同)。

7．如果吸光值很低，可以适当增加细胞数量或者延长加入CCK-8溶液后孵育的时间。

8．为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

CCK-8法的优势