Evagreen

                                        Evagreen

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• 产品说明

Evagreen是一种用于实时定量PCR（qPCR）的DNA 结合染料。该染料的诸多优点使它远胜于SYBR Green I。除了有相似的光谱特性，Evagreen有三个主要特点使它区别于SYBR Green I 。 

首先，Evagreen对PCR的抑制性远小于SYBR Green I。因此，使用Evagreen进行的qPCR实验可以使用快速PCR步骤。同时，Evagreen在实验中可以使用较高的浓度，从而获得远强于SYBR Green I扩增信号。较高浓度的Evagreen也消除了“染料重分布”的缺陷，使Evagreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲线分析（HRM）。该分析正被越来越多的用于PCR后的基因分型和异源双链分析。由于SYBR Green I对PCR的抑制性，从而要求其使用浓度必须很低，因此SYBR Green I无法解决由低浓度造成的染料重分布问题，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同时，染料重分布问题也可能影响常规熔解曲线的可靠性，因为低熔点的DNA链可能由于这种原因而无法检测到。     

第二，Evagreen的稳定性极强。在正常的储存、操作和PCR过程中不会被破坏。在缓冲溶液中的染料可以安全的储存在室温或冰箱里，也可以反复冻融。与之相反，SYBR Green I不稳定而且降解后对PCR抑制性更强。

第三，Evagreen降低了细胞膜透性，因而比SYBR Green 1更加安全。独立实验室的测试结果显示，Evagreen既没有诱变性也没有细胞毒性。相反，虽然SYBR Green I本身诱变性很弱，但它在细胞中可能抑制了正常DNA的修复机制，使其有诱变增强作用。考虑到PCR的广泛使用，其安全性应该足够重视。

产品参数

λabs/λem = 500/530 nm (结合DNA)
λabs = 471 nm (未结合DNA)

保存方法

4℃或-20℃，避光保存，有效期见外包装。

操作步骤

如下建立实验体系：（仅供参考）

实验目的

实时定量PCR检测20× Evagreen

主要试剂

1. Prime

hβ-actin：

forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’

reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’

2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)

3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)

4. BSA: Sigma(A7030)

5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)

实验方案

1. 配制2× Evagreen Buffer

2. 配制 q-PCR反应体系

【注】：① DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定合适的 DNA 模板添加量。cDNA作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。②引物终浓度一般控制在0.1-0.5 μM范围内。

3. 实验分组：标准对照样品孔（阳性对照）、检测样品孔、空白对照孔（阴性对照）共三组，同时进行检测，分别进行三次平行实验。

4. 混匀离心、上机进行荧光定量PCR（仪器为Roche：LC96）。

PCR程序：

5. 保存数据，判断样本质量：

A．检测样品与标准品之间的Ct值差

B．检测样品与标准品之间的荧光强度差

检测结果需达到：以上两组检测指标无显著性差异

注意事项

该产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。