尿嘧啶DNA糖基酶(Uracil N-Glycosylase,UNG)又名Uracil-DNA Glycosylase, UDG, 为来源于E. coli uracil N-glycosylase基因的重组表达蛋白,分子量为26kDa。它可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶,但对RNA无活性。 UNG主要应用于PCR扩增产物的防污染,作用原理基为:如果在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中,形成了含dU碱基的PCR扩增产物,该酶能选择性断裂单链和双链DNA中U基的糖苷键,降解该PCR扩增产物。 |
组分 |
组分名称数量Uracil N-Glycosylase (5 U/μl)200 μl/1 ml |
应用 |
去除单链或双链DNA中的尿嘧啶碱基 去除 PCR 残存污染
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活性定义 |
在标准PCR反应体系下,37℃条件下,1小时降解1μg含dU碱基的单链DNA的酶量为一个活性单位。 |
活性测试 |
取1μg dUTP PCR产物,用UNG 37℃消化30min后进行琼脂糖凝胶电泳。 Lane 1:对照(不加UNG酶);Lane 2-7:分别为 2U、0.5U、0.125U、0.032U、0.008U、0.002U UNG酶37度消化30min后的PCR产物;M:D2000 DNA Marker。 |
性能测试 |
UNG在标准PCR体系下(50ul体系)性能测试。 处理方法为:在反应体系中分别加入不同量的UNG(如图所示),50度2min,95度5min,然后进入PCR循环扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。Lane 1-3:标准dNTP Mixture,UNG用量0.25U/0.5U/1U; Lane 4-6:dNTP/dUTP Mixture,UNG用量0.25U/0.5U/1U;M:D10000 DNA Marker。 |
反应buffer |
Uracil DNA Glycosylase (UNG)与绝大多数的PCR 聚合酶反应缓冲液都是兼容的,但在高离子浓度(>100mM)下活性会受到抑制。 |
酶保存液 |
20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, , 50% Glycerol, 0.1% (w/v) Triton X-100, pH 7.5。 |
储存 |
-20℃可保存2年,避免反复冻融。 |
热失活 |
95℃,5min。 |
取1μg dUTP PCR产物进行UNG热失活测试。 Lane 1:对照(不加UNG酶);Lane 2: 1U UNG酶37度消化30min;Lane 3: 1U UNG酶95度加热5min后,再加入PCR产物消化(37度消化30min); Lane 4: 1U UNG酶95度加热10min后,再加入PCR产物消化(37度消化30min);M: D2000 DNA Marker。 |