AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

AFLP试剂盒（EcoRI-MseI）

AFLP Kit(EcoRI-MseI)

本产品在传统AFLP-PCR的基础上经过精心优化而开发。AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一种结合RFLP和PCR技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下：


产品特点：
1．一站式，足够50次酶切-连接反应、50次预扩反应和1600次AFLP PCR(PCR按30μL体系计算)，但不包括DNA 纯化和带型分析试剂(如PAGE电泳试剂和银染试剂)。
2．本系列产品提供EcoRI-MseI 组合，适用于GC含量在50%以上的基因组。对GC含量在50%以下的基因组，需从本公司采购AFLP(EcoRI-TaqI)组合。
3．各种参数都经过优化，一次PCR所得AFLP片段数一般在10-100之间，可重复性好，误差小于0.6%。
4．本产品适用于基因组在500 Mb-6000Mb的材料(如动物和植物)，对于基因组在50-500Mb的材料(如细菌和真菌)或50Mb以下的材料(如质粒，cosmid，BAC，YAC和PAC等)，需要分别另购专门的+1型预扩引物混合液和+3型EcoRI引物(8 种)AFLP引物对。

试剂盒组成：

+2型EcoRI引物和+3型MseI引物最后碱基的序列

储存条件：低温运输、-20℃保存，有效期一年。

自备试剂：Southern级DNA纯化试剂，尿素-PAGE电泳套装，银染试剂盒。

使用方法：

一、DNA提取(本试剂盒不提供相关试剂)
用户需要自备50-500ng Southern级别的基因组DNA，用前最好预实验以确保DNA能够被EcoRI和MseI内切酶彻底切开。

二、限制性酶切和接头连接反应(本试剂盒足够50次本反应)
1．在0.2mL离心管中加入设置20μL的限制性内切酶酶切体系：

2．轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2小时酶切(若PCR 仪器不带热盖，则必须加50μL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同)，70℃保温15分钟灭活内切酶。
3．在上述酶反应体系中加入20μl EcoRI-MseI 接头混合物和1μl T4 DNA连接酶，轻柔混匀并短暂离心后，20℃保温2小时让接头跟DNA片段相连。
4．在一个离心管中加入10μl上步得到的连接反应液和90μL TE缓冲液，pH8，充分混匀，得到酶切-连接反应10倍稀释液，未用完的酶切-连接反应原液(30μL)可放-20℃保存。

三、预扩增(本试剂盒足够50次本反应)
5．在0.2mL离心管中设置30μl的PCR 体系：

6．离心数秒，按下列参数进行PCR预扩增：

7．可以取10μl PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物为100-1500bp 模糊条带。
8．将剩下的预扩反应液用TE 稀释50倍，直接用于下步反应或放-20℃保存待用。

四、选择性PCR扩增(本试剂盒足够至少1600次本反应)
9．在0.2mL PCR 管中，加入下列成分(如果用户已经知道哪个一种或几种引物组合适合自己的材料，则直接使用；如果不知道，则需要预先测试所有64 种组合，设置64个PCR反应)，下面只是一种组合：

10．轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：

五、尿素-PAGE电泳和银染(需另购试剂并按相关说明书进行)

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！