一站式His标记蛋白质微量纯化套装

一站式His标记蛋白质微量纯化套装

One-Stop His-Tagged Protein Miniprep Pack

本试剂盒基于His-Ni亲和层析的蛋白质纯化方法，是目前分离纯化重组表达蛋白质的重要方法，本产品就是专门用于上述实验的一站式产品。

特点：
1. 一站式套装，含所需的介质、溶液和层析柱，用户只需要提供表达His蛋白的细菌（酵母、杆状病毒、培养细胞）即可，非常方便。
2. 专一性强，一次过柱即可获得纯度高达95%的His-标记蛋白。
3. 变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。
4. 每次可以处理20mL的表达菌液，适合初步筛选和鉴定。
5. 提供4mL浓度为50%的Ni-Agarose介质，其最大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质。
6. 介质为CL-6B琼脂糖，含四个Ni离子螯合基团，比只有四个Ni离子螯合基团的Ni-IDA更有效。
7. 本介质可以反复使用多次。

产品组成：

保存条件：常温运输和保存，但介质长期需4℃保存，溶菌酶、Benzonase溶液和PMSF溶液需-20℃保存，有效期一年

自备试剂：去离子水、20%乙醇、0.45μm滤膜

使用方法：
1. 将Ni-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据His蛋白产量决定，其最大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质，请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱）。
2. 用5倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。
3. 用5倍柱体积的新配结合液洗柱（配方如下，以10mL为例），共三次：

4. 室温5000 g离心10分钟收集20mL表达菌液，弃上清，沉淀（约100 mg）放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。
5. 如果超声破碎细菌：加入1mL冰浴的结合液（1mL菌液需要用50μl结合液），再加入25μl PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。如果酶法裂解细菌：加入1mL冰浴的含溶菌酶的结合液（先取20mL结合液，加入所有30 mg溶菌酶干粉，溶解后分装成1mL/管，剩余的-20℃放置），再加入25μl PMSF（10mg/mL）溶液和1μl Benzonase，冰上放置30分钟。
6. 4℃下13000-15000 g离心10分钟，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE电泳对照。如果要纯化裂解液中可溶部分的His标记蛋白，则直接进入第7步；如果要纯化裂解液中包涵体（沉淀部分）中的His标记蛋白，则直接进入第12步。

A、纯化细胞裂解液中可溶部分的His标记蛋白
7. 将上步得到的上清液上柱，让重力使裂解液自然流出。如要提高His标记蛋白与介质的结合效率，可用试剂盒提供的红盖将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在4℃结合30分钟或过夜。
8. 用10倍柱体积结合液洗柱（配方见上表），收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。
9. 如果用一步式洗脱法（适合已经找到最佳咪唑浓度的情况），则直接用适量的新鲜配制的洗脱液洗柱，收集并保存穿透液（含His标记蛋白）。洗脱液的配方如下（以1mL体积和最佳咪唑浓度是500 mM为例）：

10. 如果用多步式洗脱（适合不知道最佳咪唑浓度或一步式洗脱杂质多的情况），则按上表配制一系列咪唑浓度不同（如40、60、100、200、300和500 mM），其他成分浓度不变的洗液，按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。
11. 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

B、纯化包涵体中His标记蛋白
12. 将第6步离心得到的包涵体沉淀重悬于1-3mL含盐酸胍结合液中或1-3mL含尿素结合液中（建议优先使用尿素做变性剂，因为得到的洗脱液可以直接跑SDS-PAGE，而用盐酸胍的洗脱液需先除盐后才能电泳）。冰浴1小时以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。含变性剂的结合液配方如下（以10mL为例）：

13. 室温10000×g离心20分钟，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的His标记蛋白）以自备的0.45 μm滤膜过滤。
14. 将滤过液上柱，后续纯化步骤同第7-第11步。只是所用结合液和洗脱液均含变性剂，含变性剂的洗脱液配方见下表（以1mL为例）：

注意事项：
整个实验需避免含巯基乙醇、DTT和EDTA等成分。若洗脱液不能将His标记蛋白洗脱下来，可改用pH 6.5- 4.5的pH递减的Tris-HCl洗脱。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！